方法文章

开源的 Micro-Manager 插件用于荧光偶极子的实时成像

DOI：

10.3791/67755

⸱

2025年3月14日

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Engineering, Eastern Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, College of Future Technology, Peking University, 3National Biomedical Imaging Center, Peking University, 4Zhejiang Provincial Engineering Research Center for Organelles Diagnostics and Therapy

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们开发了一个开源的 Micro-Manager 插件，可在结构光照明显微镜上实现荧光偶极子的实时观测。该插件支持二维和三维偶极子取向的观测。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

荧光偏振显微镜（FPM）能够对荧光团的位置及其偶极子取向进行成像。尽管超分辨率荧光偏振显微镜已取得诸多成果，但其依赖于采集后的图像处理，限制了实时观测能力。偏振化结构光照明显微镜（pSIM）可实现荧光偶极子的超分辨率成像，具有较快的成像速度，非常适合活细胞应用。我们开发了一种开源方案，用于偏振图像的实时重建及荧光偶极子的实时显示。此外，我们将该方法扩展至实现三维取向图谱（3DOM），从而拓展其在复杂生物学研究中的应用。同时，我们系统地介绍了如何将现有的SIM显微镜系统扩展用于偏振成像，并提供了Micro-Manager 2.0的详细配置指南以控制显微镜，实现偏振成像的实时预览。此外，我们还提供了涵盖pSIM和3DOM的完整重建MATLAB代码。本综合指南旨在帮助初学者快速掌握并轻松上手相关操作。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

荧光偏振显微镜（FPM）已成为一种强大的技术，可同时成像荧光团的位置和偶极取向，为生物成像提供了深刻见解1,2。通过实现对生物分子取向的直接观测，FPM揭示了肌动蛋白3,4,5、微管5、septin6、DNA细丝7-9、核孔复合物10以及膜蛋白11等大分子的复杂排列结构。其高速、无创且兼容活细胞的特性，使得FPM能够以高时间分辨率追踪分子旋转动力学11,12。当与生物力探针结合时，FPM不仅能以亚细胞分辨率绘制力的大小分布图，还可测量力的方向，从而通过揭示力的作用方向，推动了对生物力学过程的理解13。

近几十年来，超分辨率荧光偏振显微技术经历了快速发展。该领域中一个显著的进展是单分子取向定位显微技术（single-molecule orientation localization microscopy，简称 SMOLM），该技术能够同时定位荧光分子的位置和取向，从而实现多维定位。SMOLM 中的偏振测量可通过偏振激发调制7、多通道偏振检测3或设计的偏振敏感点扩散函数（PSF）14来实现。尽管 SMOLM 能够达到数十纳米级别的空间分辨率并实现单分子偏振测量，但其成像时间较长。这主要是由于荧光分子反复发生闪烁和定位循环，从而对视频速率成像和活细胞应用构成了挑战。

相比之下，偏振结构照明显微镜（pSIM）可实现约高达100 nm的空间分辨率，同时利用同一套SIM数据获取偏振信息。值得注意的是，pSIM能够达到视频帧率的成像速度，且与活细胞成像高度兼容，对荧光分子无严格要求。近期，pSIM已成功揭示了膜相关周期性骨架（MPS）中的肌动蛋白环结构5，并实现了生物力的超分辨率定位13。

然而，pSIM 需要采集后进行图像重建，这阻碍了偏振结果的实时可视化。这种延迟限制了对生物现象的即时观察，使研究人员难以快速捕捉感兴趣的生物现象，并对样本和成像条件进行实时调整。为解决这一局限性，我们开发了一种基于 ImageJ 和 Micro-Manager 平台的开源实现，可实现图像采集、偏振结果的实时重建与显示（https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging）。

此外，虽然 pSIM 之前仅限于提供二维面内偏振信息，但我们最近已将其功能扩展至使用几乎相同的设备实现三维取向映射15，该技术称为三维取向映射（3DOM）。这一开源软件还提供了对 3DOM 的控制、重建和可视化功能。重建与可视化模块同样兼容单分子取向追踪应用。所有这些功能增强了偏振成像在复杂生物学研究中的实用性。

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方案

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1. 扩展现有的结构光照明显微镜以实现偏振成像

  1. 准备一台SIM显微镜。
    注意： 我们假定读者已具备一定的显微镜搭建基础，并已拥有结构光照明显微镜。如果您缺乏相关经验，请参考这篇论文，其中详细描述了如何构建一台SIM显微镜16。在我们的pSIM工作中，"HWP+WQP+LCVR"偏振控制单元可由披萨形涡旋波片5或披萨形半波片17替代。
  2. 通过在空间光调制器（SLM）上加载不同图案，测量三个条纹方向的偏振消光比。在物镜后方放置一个偏振片并旋转，使用功率计测量激光功率。对于pSIM，需旋转波片以维持三个方向s偏振的消光比> 10。
  3. 对于3DOM，旋转HWP2以维持六个方向p偏振的偏振状态。 将SIM空间掩模替换为3DOM空间掩模，使六个方向的一级衍射光束能够通过（见图1B）。
    注意：pSIM需要s偏振，而3DOM需要p偏振。pSIM5和3DOM15的详细装置设置在其他文献中已有描述。

2. Micro-Manager 设置

  1. 从官方网站下载 Micro-Manager 2.0 版本，并按照说明安装软件。
  2. 准备相应的设备驱动程序和软件，以成功连接到 Micro-Manager 系统。在此显微镜系统中，使用 Micro-Manager 控制相机、平移台、激光器、DAQ 板和显微镜。
    注意：支持的仪器列表见 https://micro-manager.org/Device_Support。有关待连接仪器的详细信息，请参见 材料表。安装驱动程序或官方/支持软件，并使用 USB 线缆将仪器连接至计算机。
  3. 使用硬件配置向导将仪器添加到 Micro-Manager 中。
    1. 打开软件，从初始下拉列表中选择无。
    2. 选择设备 | 硬件配置向导… | 创建新配置，然后点击下一步进入配置页面。
    3. 在下拉硬件列表中找到相机/激光器/平移台/DAQ/显微镜插件，点击添加 | 确定 | 下一步。
    4. 进入选择默认设备页面，选择自动快门设置，设置默认相机、默认快门和默认聚焦台。点击下一步直至出现保存配置并退出选项，保存配置文件名称，然后点击完成。
  4. 常用模板设置
    1. 为实时成像模式和 SIM 快拍模式保存模板。
    2. 按如下方式设置曝光时间和触发模式：在配置设置中选择分组 '+'，将分组名称命名为'Mode'，选择曝光和触发模式，点击确定。
    3. 选择预设 '+'为 'Mode' 分组添加不同的预设。将一个预设命名为 'live'，用于实时模式的曝光设置；另一个命名为 'SIM'，用于 SIM 模式。例如，在 'live' 模式下，将曝光时间设为 15 ms；在 SIM 快拍模式下，将曝光时间设为 10 ms，触发模式设为标准（重叠）模式。
      注意：我们的代码仓库中包含一个配置文件（MMConfig_psim_demo.cfg），可直接由 Micro-Manager 2.0 加载。

3. 使用荧光微球进行系统校准

  1. 将盖玻片浸入75%乙醇中，用去离子水（ddH2O）冲洗盖玻片3次，并将其干燥。
  2. 涡旋100 nm荧光微球（用磷酸盐缓冲液[PBS]稀释至1:1,000），并将悬浮液直接滴加到盖玻片上。在避光环境中孵育5–10分钟，然后用PBS轻轻洗涤。
  3. 在显微镜载玻片上加入20 µL封片介质，将盖玻片覆盖其上，注意避免产生气泡。保持温度为4 °C，并将载玻片置于避光环境中，以便制备含100 nm荧光微球的样品用于系统校准。
  4. 对于pSIM，采集荧光微球在三个不同相位下的三幅图像。自定义的MATLAB代码（Bead_calib.m）以这些图像作为输入，输出两幅校准图像（calib1.tif、calib2.tif），用于后续分析。
    注意：如先前所示5，pSIM实验可在大多数商用系统上进行。无论是在自行搭建还是商用的SIM显微镜上，均需进行系统校准，以消除因三个光栅方向照明不均所导致的荧光偶极子测量误差。该校准实验假设荧光微球具有各向同性的偏振特性，且仅需SIM成像过程中的原始图像。详细的校准步骤见我们之前的研究工作5。pSIM重建需要输出两幅校准图像calib1.tif和calib2.tif，其中calib1.tif表示光栅方向2的逐像素照明能量，calib2.tif对应光栅方向1。

4. 样品制备：固定细胞中的肌动蛋白

  1. 将盖玻片浸入75%乙醇中，用ddH2O冲洗盖玻片3次。将盖玻片放入六孔细胞培养板中。
  2. 在含10%（v/v）胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C和5% CO2条件下，在盖玻片上培养U2OS细胞（ATCC HTB-96细胞系），直至细胞融合度达到约75%。
  3. 用PBS轻柔洗涤细胞3次。进行细胞固定时，在室温下加入4%多聚甲醛作用15分钟。固定后，再次用PBS洗涤细胞3次。
  4. 为增强细胞膜通透性，用含0.1% Triton X-100的PBS处理细胞5分钟，然后用PBS洗涤细胞3次。
  5. 用150 µL DMSO溶解荧光标记鬼笔环肽，配制成储备液（66 µM）。取5 µL储备液加入995 µL PBS中，稀释后制备工作液。将细胞在避光条件下，于室温用鬼笔环肽染液工作液孵育约1小时。用PBS洗涤细胞3次，每次3分钟。
  6. 在显微镜载玻片上滴加20 µL封片剂。小心地将盖玻片盖在载玻片上，避免产生气泡。将载玻片置于4 °C保存，并避光放置。

5. 样品制备：体外λ-DNA

  1. 将0.5 g聚甲基丙烯酸甲酯溶解于10 mL义齿基托材料中。充分溶解后，将溶液均匀涂布于载玻片表面，待其蒸发成膜。
  2. 在968 µL PBS中稀释0.3 µL λ-DNA和32 µL 1,000倍SYTOX Orange核酸染料。取1 µL制备好的溶液滴加至载玻片上，使其自然干燥。
  3. 用封片剂将盖玻片密封固定在载玻片上，以保护和保存样品。将载玻片置于4 °C避光环境中保存。

6. 成像

  1. 将盖玻片放置在样品 holder 上，并在实时模式下调整至焦平面。选择 512 × 512 像素的感兴趣区域（ROI），并调节曝光时间和激光强度。
  2. 打开空间光调制器的独立控制软件，选择适用于 pSIM / 3DOM 或实时成像模式的照明图案序列路径。
    注意：对于 pSIM，照明图案包含三种不同的偏振角度和三种不同的相位；对于 3DOM，照明图案包含六种不同的偏振角度。
  3. 选择 SIM 采集模式，点击 Multi-D Acq.，选择 Time Points，在弹出窗口中设置 Count（pSIM 为 9 张图像，3DOM 为 6 张图像）和 Interval（0 ms），然后点击 Acquire!
  4. 点击 TriggerSLM.bsh（配置文件包含在我们的代码仓库中），MyDaq 采集卡将激活空间光调制器以拍摄图像。

pSIM 和 3DOM 的实时预览插件

  1. 配置 FakeCamera 和图像访问路径：单击 设备 | 加载硬件配置…，加载脚本（MMConfig_FakeCam_demo.cfg）。在 设备 | 设备属性浏览器… | Camera-Path mask 中配置本地图像目录（图 2A-C）。
    注意：该脚本的采集部分依赖于具体的硬件设置，因此我们提供了一个使用 FakeCamera 设备读取硬盘上本地图像的版本（MMConfig_FakeCam_demo.cfg）用于演示。用户可对我们的版本进行修改。请务必更改图像读取路径（Camera-Path mask）。
  2. 通过单击 工具 | 快捷访问面板 | 创建新面板 来设置 快捷访问面板。单击左下角的 设置图标，将 “运行脚本” 拖动到上方区域，以便加载 'psim.bsh' 和 '3DOM.bsh' 脚本（图 2D）。
    注意：快捷访问面板 系统允许用户创建自定义窗口，方便快速访问 Micro-Manager 中最常用的控制功能。如 图 2D 所示，也可添加“实时成像”、“单帧拍摄”或其他通道。
  3. 以 pSIM 为例，单击 'psim.bsh' 执行实时偏振图像重建；观察带有偏振结果的实时重建图像（图 2E）。请记得在 'psim.bsh' 文件中更改校准图像路径（calibPath = " 校准图像文件路径"）。
    注意：实时预览插件是 Beanshell 脚本（psim.bsh 和 3DOM.bsh），可在 脚本面板 中运行。该插件为 pSIM 采集九幅图像，或为 3DOM 采集六幅图像，并基于宽场图像计算取向映射结果。取向映射图像将被实时显示，以提供即时的偏振信息，尽管其分辨率较低。

8. 使用超分辨率重建进行数据分析

  1. 从网站安装 MATLAB R2019b（参见材料表）。
  2. 打开软件；对于 pSIM 重建，需获取九幅图像，即三个不同取向角度下每个角度对应三个不同相位的图像。确保九幅图像的文件名依次为“1.tif”至“9.tif”，将其放入名为“Input”的文件夹中，并运行名为“PSIM.m”的程序。通过彩色标尺观察重建后的宽场图像、SIM 图像和 pSIM 图像。
    注意：pSIM 重建需要两个步骤：SIM 步骤和 PM 步骤。数据通过自定义编写的 MATLAB 程序进行分析，以便于调试。可从 GitHub 的“reconsr”文件夹中获取重建代码。
  3. 对于 3DOM，采集六个不同偏振方向的图像。将这六幅图像合并，将合并后的文件命名为“Raw_data.tif”，并运行名为“Recon_3DOM.m”的程序。通过方位角结果和极角结果观察重建后的宽场图像及 3DOM 图像。
    注意：在重建过程中，可能会出现错误提示——“未识别函数或变量 'bfopen'”。'bfopen' 是 bio-formats 库中的一个函数，常用于打开和读取图像文件。在 MATLAB 命令窗口中输入 addpath('path_to_bioformats_toolbox')，并将 'path_to_bioformats_toolbox' 替换为实际的库文件夹路径。我们已在 GitHub 仓库中添加了 Bio-Formats 依赖项。

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结果

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pSIM 方法可在基于s偏振激光束干涉的SIM显微镜上实施。s偏振干涉是目前应用最广泛的SIM类型，可产生高对比度的照明条纹。显微镜系统的学术原型已在pSIM的原始研究中提出5。如图1简要所示，空间光调制器（SLM）生成±1级衍射光束，而披萨形半波片则维持三个方向上的s偏振状态。尽管其他SIM方案可能使用光栅生成衍射光束，或采用其他偏振调制方法来保持s偏振，这些显微镜同样可扩展用于偏振成像。

3DOM 显微镜采用类似的光学成像系统（图 1A），但存在两点不同。首先，3DOM 不需要两束激光的干涉，而是仅利用 +1 级衍射光束来控制激发光的偏振方向。如原始研究15所示，3DOM 至少需要六个方向的数据才能计算出三维偶极子取向。因此，3DOM ...

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讨论

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在本研究中，我们开发了一种插件，可实现实时预览两种偏振成像技术：pSIM 和 3DOM。这两种技术均可在现有的 SIM 系统上通过轻微改造实现。我们提供了安装 pSIM 和 3DOM 显微镜的详细步骤，并介绍了如何设置 Micro-Manager 以控制显微镜，以及如何获取实时偏振成像结果。实验结果包括 pSIM 成像的肌动蛋白丝和 3DOM 成像的 λ-DNA。鬼笔环肽偶极子的取向大致与肌动蛋白丝的方向平行，而 STOYOX Orange 荧光染料的取向则垂直于 DNA 轴。结构光照明显微镜还可实现高尔基体、微管网络18 和内质网19 的高时空分辨率成像。

我们为 pSIM 和 3DOM 均开发了定制化插件；用户可根据其拍摄模式选择合适的预览程序。在运行实时预览插件的过程中，若插件未能正常启动，用户必须首先检查配置文件中关于读取虚拟相机图像的路径设置，确保该路径已准确修改为图像实际存储的位置。随后，还需确保实时预览插件中读取校准图像的路径也已相应更新。不同版本的 Micro-Manag...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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本工作得到中国国家重点研发计划（2022YFC3401100）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 nm 荧光微球InvitrogenF8801
4% 甲醛溶液InvitrogenR37814
相机TucsenDhyana 400BSI V3https://www.tucsen.com/download-software/
义齿基托材料（I型热固化型，液体）新世纪牙科N/A
杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基GibcoC11995500BT
Eclipse TE2000 倒置显微镜尼康TE2000 E
胎牛血清Gibco10099141C
MATLAB R2019bMathWorks版本 R2019bhttps://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0Kopin版本 4.0空间光调制器软件
Micro-Manager 2.0μΜ经理版本 2.0下载 Micro-Manager 最新版本
MS-2000 XYZ 自动载物台应用科学仪器公司MIM3https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQ国家仪器公司781325-01软件与驱动下载 - NI
OBIS 561 nm LS 20 mW 激光器相干的1325777
Phalloidin-AF568InvitrogenA12380
磷酸盐缓冲液康宁21-040-CV
聚甲基丙烯酸甲酯SolarbioM9810
ProLong DiamondInvitrogenP36980
空间光调制器KopinSXGA-12
SYTOX 橙色核酸染料InvitrogenS11368
Triton X-100InvitrogenHFH10
胰蛋白酶Gibco25200056
λ-DNAInvitrogenS11368

参考文献

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