基于荧光的 Acinetobacter baumannii T6SS 活性检测方法的建立与比较

摘要

本文提出一种基于荧光标记（特别是荧光素酶）的定量检测方法，可高效、准确地评估细菌VI型分泌系统（T6SS）的活性，适用于临床菌株的高通量分析。

摘要

VI型分泌系统（T6SS）是介导革兰氏阴性菌细胞间相互作用的关键机制，尤其在如Acinetobacter baumannii等致病菌中具有重要作用。先前的研究表明，A. baumannii ATCC 17978菌株中的大型质粒pAB3编码一种TetR样蛋白，可抑制T6SS核心基因的表达。相比之下，缺失pAB3的WT^R-菌株能够稳定表达并分泌T6SS效应蛋白Hcp，并表现出杀伤E. coli的能力。tssM基因是T6SS的核心基因之一，对T6SS的功能至关重要；其缺失会直接导致T6SS失活。然而，传统的T6SS活性检测方法（如杀伤实验）存在通量低、灵敏度不足的问题。为克服这些局限性，我们开发了基于荧光标记的定量检测方法。

为提高VI型分泌系统（T6SS）活性的检测效果，我们开发了三种荧光标记方法：（1）基于荧光素酶标记的定量检测方法，具有高特异性、高灵敏度和良好的重复性，适用于高通量分析；（2）基于绿色荧光蛋白（GFP）标记的检测方法，尽管易受环境干扰，但具备高通量的优势；（3）流式细胞术检测，可对细菌活力进行定量评估，但操作复杂且成本较高。经综合比较，基于荧光素酶的标记方法被证明最为准确、灵敏且操作简便。该方法应用于20株临床分离的A. baumannii时，证实可快速、准确地评估T6SS活性。

引言

VI型分泌系统（T6SS）是革兰氏阴性菌中一种重要的蛋白质分泌系统，广泛参与细菌间的竞争、对真核宿主的拮抗作用以及宿主免疫反应的调控^1,2。T6SS通过将毒性效应蛋白注入邻近的细菌或真核细胞，帮助细菌在复杂环境中维持竞争优势。近年来，T6SS在细菌适应性、致病性及微生物相互作用中的重要作用使其成为研究热点，尤其是在多重耐药病原体中，其功能为开发新型抗菌策略提供了潜在靶点^3,4,5。

Acinetobacter baumannii（Ab）是一种革兰氏阴性机会性病原菌，广泛分布于医院环境中。由于其高度耐药性和强适应性，已成为全球重要的医院内感染病原体^6,7,8。A. baumannii在复杂微生物环境中的生存依赖于多种分泌系统，其中VI型分泌系统（T6SS）在其与其他微生物的竞争及与宿主的相互作用中发挥关键作用。由于A. baumannii具有高度保守的T6SS基因簇和明确的功能，已成为研究T6SS机制的理想模型。此外，A. baumannii中T6SS的独特结构为进一步揭示T6SS的多样性与功能提供了独特的视角。

A. baumannii 的 T6SS 基因簇包含 12 个核心蛋白基因（如 tssA-tssM，缺少 tssJ）以及多个功能未知的基因（如 tagX, tagN, tagF 等）^2,9,10。其中，溶血素协同调节蛋白（Hcp）是 T6SS 的重要组成成分，其分泌被认为是功能性 T6SS 的标志。研究表明，A. baumannii 中的大质粒 pAB3 通过编码一种类似 TetR 的调控蛋白来抑制 T6SS 的表达。相反，丢失 pAB3 的菌株（如 WT^R-）能够稳定表达并分泌 Hcp，表现出显著的 T6SS 活性¹¹。tssM 基因是 T6SS 的核心基因之一，其缺失会直接导致 T6SS 失活。

然而，传统的VI型分泌系统（T6SS）活性检测方法（如杀伤实验）存在通量低、重复性差和灵敏度不足等局限性，严重制约了T6SS的深入研究与广泛应用⁵。因此，开发高效且准确的T6SS活性检测方法已成为当前研究中的迫切需求。本研究旨在建立并比较基于荧光标记的T6SS活性检测方法，以克服传统方法的不足。通过荧光标记技术，我们实现了对T6SS活性的实时、定量监测，为细菌相互作用的研究提供了更为精确和可靠的工具。本研究验证了荧光标记方法的有效性，并通过比较不同荧光标记策略的优缺点，为未来的研究提供了新的视角和方法学支持。这不仅为T6SS研究提供了新的技术手段，也为深入理解细菌相互作用的复杂机制以及开发新型抗菌治疗策略奠定了科学基础。

方案

1. 菌株和质粒的来源

1. 使用 A. baumannii 标准菌株 ATCC 17978、E. coli (pZY01) 以及从吉林大学第一医院检验科分离的 A. baumannii 临床菌株。
2. 使用实验室改造并保存的质粒 pZY01-GFP（携带卡那霉素抗性基因，可在 A. baumannii 中稳定表达），以及 commercially purchased 质粒 pGEN-luxCDABE（携带氨苄青霉素抗性基因）。
3. 在 Luria-Bertani (LB) 培养基或以下成分的最小培养基中培养 A. baumannii 和 E. coli：50 mM 磷酸钾缓冲液（pH 7.4）、15 mM (NH₄)₂SO₄、2 mM MgSO₄、0.2% (w/v) 丁二酸钠作为唯一碳源，以及 0.01% (w/v) 酵母提取物¹²。必要时添加以下浓度的抗生素：E. coli：氨苄青霉素（100 µg/mL）和卡那霉素（50 µg/mL）；A. baumannii：链霉素（100 µg/mL）。
   注意：E. coli (pZY01) 和 E. coli (pZY01-GFP) 表达卡那霉素抗性。E. coli (pZY01) 不含荧光标记，因此在下文中可简称为 E. coli。

2. 实验前细菌菌株的准备

1. 在实验开始前2天，从-80 °C冰箱中取出细菌菌株。将各菌株接种至含有相应抗生素的LB琼脂平板上，于37 °C培养过夜。
   注意：确保所有细胞在实验开始时仍保留质粒。
2. 在实验前一天，分别挑取每种细菌菌株的两个独立单菌落。将每个菌落分别接种至含有5 mL LB液体培养基的两个独立试管中，于37 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。将这些培养物用于后续实验。
   注意：根据细菌生长速率优化培养时间，以确保获得足够的细菌生物量。

3. 准备 E. coli （GFP） E. coli （荧光素酶）菌株

1. 转化
   1. 分别将50 ng质粒DNA（pZY01-GFP或pGEN-luxCDABE，通过NanoDrop在A260/A280处定量）加入100 µL的E. coli DH5α感受态细胞中，并轻轻混匀。
   2. 冰上孵育30 min，42 °C热激60 s，立即置于冰上冷却30 s。
   3. 加入700 µL无抗生素的LB液体培养基，37 °C、180 rpm振荡培养2 h。
2. 涂板与培养
   1. 以420 × g离心2 min，弃上清，将菌体沉淀重悬于100 µL无抗生素的LB液体培养基中。
   2. 将pZY01（GFP）转化产物涂布于含50 µg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上。
   3. 将pGEN-luxCDABE转化产物涂布于含100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。
3. 阳性克隆的验证
   1. 挑取单菌落，次日提取DNA作为聚合酶链式反应（PCR）模板，进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳验证。
   2. 确认阳性菌株，并标记为E. coli（GFP）和E. coli（荧光素酶）。
      注意：确保感受态细胞质量高以实现高效转化。涂板时避免菌液过多，以免影响单菌落的分离。

4. 蛋白质印迹

1. 样品制备
   1. 收集细菌培养物，离心（1500 × g，10 分钟，4 °C）以分离细胞沉淀和上清液。
   2. 向细胞沉淀和上清液中分别加入适量上样缓冲液，在金属浴中 100 °C 煮沸 10 分钟。离心（1500 g，10 分钟，4 °C），收集上清液作为蛋白样品。
   3. 使用二辛可宁酸（BCA）或 Bradford 方法测定蛋白浓度，并调整至相同浓度。
2. 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
   1. 制备适当浓度的 SDS-PAGE 凝胶（例如，12% 分离胶，5% 浓缩胶）¹³。
   2. 将 20 µg 蛋白样品与 1–2 µL 预染蛋白 Marker 一同加入凝胶孔中。在 100–120 V 条件下进行电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部。
      NOTE: 电泳缓冲液：Tris 25 mM，Glycine 192 mM，SDS 0.1% (w/v)，加蒸馏水至 1 L。
3. 转膜（Western Blotting）
   1. 将凝胶从玻璃板中取出，浸泡于转膜缓冲液中。准备一张聚偏二氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素（NC）膜，用甲醇活化 PVDF 膜，然后将其浸入转膜缓冲液中。
      ​NOTE: 转膜缓冲液：25 mM Tris，192 mM Glycine，20% 甲醇
   2. 将转膜装置按"三明治"结构组装（滤纸-凝胶-膜-滤纸）。在 100 V 条件下转膜 60–90 分钟（根据蛋白分子量调整时间；宿主细胞蛋白（HCP）的分子量约为 17 kDa）。
      NOTE: 将转膜槽置于冰水浴中，并加入冰袋以维持低温。若转膜时间较长，中途需更换冰袋。
4. 封闭
   1. 转膜完成后，将膜放入 5% 脱脂牛奶封闭液中，在摇床上室温（RT）封闭 1 小时或 4 °C 过夜。
5. 一抗孵育
   1. 用含 0.1% Tween 20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。将膜与稀释后的一抗（小鼠抗 Hcp 抗体，1:1000 稀释；小鼠抗异柠檬酸脱氢酶（ICDH）抗体，1:1000 稀释）在 4 °C 孵育过夜或室温孵育 2 小时。
6. 二抗孵育
   1. 用 TBST 缓冲液洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。将膜与稀释后的二抗（辣根过氧化物酶 [HRP] 标记的抗小鼠 IgG，1:3000 稀释）在室温孵育 2 小时。
7. 检测
   1. 用 TBST 缓冲液洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。配制 ECL 化学发光底物并均匀覆盖于膜上。
   2. 使用化学发光成像系统检测信号并采集图像（HCP 蛋白分子量约为 17 kDa，ICDH 是一种胞内代谢酶，在 A. baumannii 中预期分子量约为 45 kDa）。
      NOTE: ICDH 是一个重要的质量控制标志物，仅可在细胞沉淀组分（含完整细菌）中检测到，而在上清液组分（含分泌蛋白）中不可检测，从而证明样品制备过程中未发生细胞裂解。Hcp 分泌（17 kDa）应仅在 T6SS 活跃菌株的上清液中可见。

5. 含LB琼脂培养基的96孔板的制备

1. 迅速将预先温育的、经高压灭菌且不含抗生素的LB琼脂培养基加入无菌的96孔板中，每孔50 µL。将培养板在室温下静置至少1小时，以确保培养基完全凝固。
2. 检测GFP荧光时，使用黑色侧壁、透明底部的培养板。
3. 检测Luciferase荧光时，使用避光的96孔板，以避免孔间荧光干扰。
   注意：添加培养基时应避免产生气泡，以确保凝胶厚度均匀，从而促进细菌与培养基的良好接触和生长。

6. A. baumannii 杀伤实验

1. 标准杀菌实验
   1. 将WT^R-和ΔtssM突变株在含100 µg/mL链霉素的LB培养基中，于37 °C振荡过夜培养；同时在含50 µg/mL卡那霉素的LB培养基中，以相同条件单独培养E. coli。
   2. 用无菌PBS洗涤细菌培养物两次，并重悬于新鲜的无抗生素LB培养基中。将OD₆₀₀调整至1.0以实现标准化。
   3. 将WT^R-和ΔtssM突变株与E. coli按1:1比例混合。
   4. 取10 µL混合菌液点样于无抗生素的LB琼脂平板上，37 °C孵育6 h。
   5. 刮取菌斑并重悬于1 mL PBS中，进行五次10倍系列稀释。
   6. 取10 µL稀释后的菌液点样于含卡那霉素的LB平板上，37 °C过夜培养。
   7. 通过菌落计数分析WT^R-和ΔtssM突变株的T6SS依赖性抗菌活性。
      注：确保细菌悬液充分混匀，以避免实验误差。每个样本至少进行三次独立重复实验，以保证数据可靠性。
2. 利用荧光素酶标记定量检测T6SS活性
   1. 将E. coli（荧光素酶）、WT^R-、ΔtssM突变株及其他菌株（如ATCC 17978、E. coli、Ab#40、Ab#170、Ab#180）的OD₆₀₀标准化至1.0。取5 µL菌液加入含无抗生素LB琼脂的96孔板中。避光风干后，检测基于荧光素酶的生物发光，以验证E. coli（荧光素酶）的发光特异性。
   2. 对E. coli（荧光素酶）进行5倍系列稀释。取10 µL稀释菌液分别点样于含LB琼脂的96孔板和空的96孔板（均避光），检测基于荧光素酶的生物发光，以评估该检测方法的灵敏度，并确认LB琼脂是否干扰发光信号。
   3. 将E. coli（荧光素酶）与WT^R-、ΔtssM突变株及20株临床分离株（OD₆₀₀均标准化至1.0）按1:1比例混合，10倍稀释后取5 µL加入96孔板，设置三个技术重复。
   4. 避光风干后检测生物发光。37 °C避光孵育4–6 h后再次检测生物发光（发射波长：562 nm）。
   5. 通过比较共培养前后生物发光值，定量评估T6SS依赖性抗菌活性。
      注：确保细菌悬液充分混匀，以避免实验误差。每个样本至少进行三次独立重复实验，以保证数据可靠性。采用Student's t检验进行统计分析。
3. 利用GFP标记检测T6SS活性
   1. 实验步骤与荧光素酶标记实验相同（激发波长：480 nm，发射波长：509 nm）。
   2. 将E. coli（GFP）与WT^R-和ΔtssM突变株（OD₆₀₀标准化至1.0）按1:1比例混合。取10 µL混合菌液点样于无抗生素的LB琼脂平板上。室温避光风干后，使用多功能成像系统的GFP荧光通道（Alex488程序，激发：488 nm，发射：509 nm）采集图像。
   3. 37 °C避光孵育4–6 h后再次采集图像。根据菌斑荧光强度的变化评估T6SS活性。
      注：所有操作均需在避光条件下进行，以避免荧光信号干扰。确保细菌悬液充分混匀，以避免实验误差。每个样本至少进行三次独立重复实验，以保证数据可靠性。
4. 流式细胞术检测
   1. 将WT^R-与E. coli（GFP）以及ΔtssM突变株与E. coli（GFP）按1:1比例混合。取适量混合菌液，用无菌PBS或1×缓冲液稀释至适当浓度（通常OD₆₀₀为0.1–0.5）。
      ​注：1×缓冲液指流式细胞术染色缓冲液（1×），成分为：1× PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，1.8 mM KH₂PO₄，pH 7.4），添加2–5%（v/v）热灭活FBS（或1% BSA作为替代）和2 mM EDTA。
   2. 将稀释后的混合菌液在300 x g下离心2 min，弃上清。将沉淀重悬于1 mL无菌PBS或1×缓冲液中，轻柔混匀。通过35 µm细胞滤网过滤，去除聚集体，确保获得单细胞悬液。
   3. 开启流式细胞仪，预热激光并校准仪器。
      1. 设置检测参数：使用488 nm激光激发GFP。检测通道：FL1（通常使用530/30 nm滤光片检测GFP荧光）。设置前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）参数以区分细菌细胞。
      2. 以未标记的E. coli作为阴性对照，调节电压和增益，确保GFP阴性群体位于荧光信号基线水平。
   4. 轻柔混匀过滤后的样品，取100 µL转移至流式细胞仪专用管中。
      1. 使用以下仪器设置进行样品分析：将FSC-H阈值设为19,000以排除碎片，增益值设为100（FSC）、110（SSC）和80（FITC）。
      2. 在FSC-A vs. SSC-A散点图中初步排除碎片和非目标信号，随后在FITC通道中进行群体分析。每个样本至少采集目标群体（由FSC/SSC特征定义）的10,000个事件。
   5. 使用流式细胞术分析软件（如FlowJo、BD FACSDiva）分析数据。
      1. 绘制FSC与SSC散点图以圈定目标细菌群体。绘制FL1荧光直方图以区分GFP阳性和GFP阴性群体。
      2. 计算GFP阳性细胞百分比和平均荧光强度（MFI）。
   6. 将剩余的混合菌液在300 g下离心2 min，弃上清。将沉淀重悬于10 µL无菌水中，并点样于无抗生素的LB琼脂平板上。
   7. 37 °C避光孵育5 h后，刮取菌斑并重悬于500 µL 1× PBS中。取100 µL重悬液，适当稀释后进行流式细胞术检测，重复步骤6.4.4–6.4.5。
   8. 比较共培养前后GFP阳性细胞百分比和荧光强度，评估WT^R-和ΔtssM突变株对E. coli（GFP）的杀伤效应。
      注：确保获得单细胞悬液，避免细胞聚集影响检测结果。检测前需校准仪器，以保证荧光信号的准确性和可重复性。实验过程中避免样品暴露于强光下，防止GFP荧光淬灭。每个样本至少进行三次重复实验，以保证数据可靠性。

结果

检测T6SS活性的传统方法通常包括在无抗生素的LB琼脂平板上共培养捕食菌株和靶标菌株5小时，随后刮取菌斑，重悬并进行系列稀释。将稀释后的细菌悬液点样于选择性琼脂平板上。通过次日计数平板上靶标菌株的菌落数量，可对T6SS活性进行定性评估。然而，该方法存在诸多局限性，包括操作繁琐、依赖人工菌落计数以及难以实现定量分析。为克服这些不足，本研究创新性地引入了一种基于荧光的定量检测方法。具体而言，我们用荧光蛋白（GFP或荧光素酶）标记靶标菌株（例如E. coli），将捕食菌株与靶标菌株按1:1比例混合后进行稀释。在共培养前后分别测定混合细菌悬液的荧光值，并根据荧光值的变化定量评估T6SS活性，如图1所示。与传统方法相比，这种基于荧光的检测方法具有操作简便、结果可定量以及高重复性等优势。

A. baumannii ATCC 17978 依赖 T6SS 抑制细菌生长
A. baumannii ATCC 179...

讨论

VI型分泌系统（T6SS）是一种复杂的多蛋白分子机器，其功能主要通过分泌效应蛋白来实现。这些效应蛋白通过杀死或抑制其他细菌物种，介导细菌间的竞争，从而为宿主细菌在微生物群落中提供竞争优势¹⁵。除了在竞争中的作用外，研究表明T6SS还参与多种细胞过程，包括细菌定植、环境适应、生物膜形成、黏附特性修饰以及免疫逃逸¹⁶。值得注意的是，T6SS功能的调控具有多层次性，涉及转录水平、转录后水平以及翻译后水平的复杂调控机制¹⁷。

在T6SS研究领域，Acinetobacter calcoaceticus 和 Acinetobacter baumannii 因其独特优势已成为模式菌株。首先，A. baumannii 的基因组已被广泛测序和注释，为研究人员提供了丰富的遗传信息¹⁸。其次，该菌株具有高度功能化的T6SS，其关键组分（如Hcp）的结构与功能已得...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10%、15% SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒	Epizyme	PG112
-20 °C 冰箱	Haier	HYCD-290
37 °C 培养箱	Bluepard	181254254
4 °C 冰箱	Haier	HYC390
-80 °C 超低温冰箱	Haier	DW-86L726G(726L)
96 孔板	JET	TCP010096
琼脂	Biofrox	8211KG001
过硫酸铵（APS）	Thermo	7727-54-0
生物安全柜	ESCO	AC2-4S1
电子天平	Sartorius AG	BSA124S-CW
电泳仪	BIO-RAD	POWER PAC1000
片冰机	GRANT	XB70
流式细胞仪	BECKMAN COULTER	AW38143
流式细胞术染色缓冲液	proteintech	PF00018
凝胶成像系统	BIO-RAD	Gel Doc 2000
甘氨酸	Zike	ZK-L2577
高速离心机	Eppendorf	5405IN106358
HRP 标记兔/鼠二抗	proteintech	SA00001-2
LB 培养基	Solarbio	L8291
低温高速离心机	Thermo	17R
甲醇	Thermo	R40121
微量紫外-可见分光光度计	Thermo	Nanodrop one
微量离心机	allsheng	Mini-6k
酶标仪	Bio-Tek	H1M
NuPAGE LDS 上样缓冲液	Thermo	NP0007
磷酸盐缓冲液（PBS）	Zike	ZK-L1649
Precision Plus Protein 双色蛋白标准品	Bio-Rad	1610374
SDS 上样缓冲液	Beyotime	poo15L
脱脂奶粉	Thermo	LP0033B
十二烷基硫酸钠（SDS）	Zike	zk6885
恒温水浴锅	JingHong	DK-420S
转膜仪	Bio-Rad	PowerPac HC
三羟甲基氨基甲烷（Tris）	Zike	ZK-L2557
垂直电泳仪	Bio-Rad	Mii-PROTEAN Tetra