方法文章

建立与评估一种 体外 肺纤维化的人源高级模型

DOI：

10.3791/67845

⸱

2025年7月22日

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Respiratory Disease, The First Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou National Laboratory

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基于成纤维细胞活化蛋白（FAP）开发了一种成像方法，用于评估人源性精准切割肺组织切片中成纤维细胞的活化状态。该方法建立了一个稳健且可重复的平台，可用于分期纤维化进展，推动转化研究 体外 在保持人类组织微环境保真度的同时，为治疗开发提供模型。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肺纤维化以肺泡结构的不可逆破坏和细胞外基质的过度沉积为特征。尽管动物模型已广泛应用于肺纤维化研究，但目前尚无一种可用模型能够完全模拟特发性肺纤维化（IPF）的进行性病程或其典型的组织学特征，例如成纤维细胞灶。先进 体外 模型，包括精密切割肺片（precision-cut lung slices, PCLS），通常被视为最具生理相关性的肺部测试系统，并已成功用于药物筛选。然而，由于难以区分特发性肺纤维化（IPF）患者肺组织中纤维化的程度，导致所获得的PCLS存在盲区和不确定性。先前研究表明，成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein, FAP）可评估间质性肺病（ILD）的促纤维化活性，有望助力早期诊断及选择合适的治疗窗口。本研究将利用冲击切片机从健康供体和IPF患者获取600 µm的PCLS，并采用靶向FAP的分子探针进行评估，依据荧光信号强度确定成纤维细胞活性程度。该方法提供了一种先进的 体外 肺纤维化研究的模型与评估技术，有助于深入研究疾病机制并评估治疗干预措施。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肺纤维化（PF）是一种病因未明且预后极差的常见类型，其中位五年生存率仅为25%1。目前，经气管注射博来霉素的动物模型是临床前研究中最广泛使用的方法2。然而，博来霉素诱导的纤维化是暂时性的，会随着时间推移而自行缓解，这与特发性肺纤维化（IPF）不可逆的特征形成鲜明对比3。此外，无论采用手术或非手术方式经气管给药，博来霉素模型均存在显著挑战，其纤维化严重程度因给药过程中的不均一性而表现出高度异质性。当前动物模型的这些局限性导致针对IPF的临床试验失败率居高不下4。

精密切割肺组织片（PCLS）已被用于多种疾病的研究，因其能够忠实地保留疾病特异性的细胞互作网络及微环境5,6,7。在肺纤维化研究中，来自特发性肺纤维化（IPF）患者肺组织的PCLS保留了天然的组织结构和细胞异质性，使得多种细胞类型及其与细胞外基质的相互作用得以观察8,9，从而确立了其作为研究肺部病理生理学的代表性ex vivo模型。然而，由于肺纤维化在肺部表现为异质性的纤维化病灶，PCLS取样本质上是盲采，无法通过肉眼判断所获取的组织切片代表的是处于静止期、活动期的纤维化区域，还是正常肺组织。这一局限性凸显了可视化评估与筛选工具的必要性。既往研究发现，成纤维细胞激活蛋白（FAP）在IPF患者肺组织中高表达且具有特异性，提示FAP可用于评估间质性肺病（ILD）的促纤维化活性10。

在本研究中，一种针对FAP的单链抗体被吲哚菁绿（ICG）标记，以开发一种具有增强组织穿透能力的靶向分子成像探针。利用该探针对来自健康供体和特发性肺纤维化（IPF）患者获得的600 µm肺组织切片（PCLS）进行成像，并根据荧光信号强度评估成纤维细胞活性。该成像方法在操作简便性、维持细胞结构完整性和活性方面优于传统的纤维化评估技术（如Western blotting、qPCR、Masson三色染色或免疫荧光），并可实现对致病进程的纵向追踪。更重要的是，该方法操作简便，仅需90分钟即可完成，为PCLS提供了一种先进的筛选工具。 体外 模型，促进肺纤维化研究。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究经广州医科大学第一附属医院伦理委员会批准（2021G-29）。特发性肺纤维化（IPF）的诊断依据为体格检查和胸部高分辨率计算机断层扫描（HRCT）结果，符合ATS/ERS/JRS/ALAT（2022）制定的诊断标准。所有IPF患者的标本均来自肺移植或肺活检。健康肺组织样本取自被诊断为脑死亡的器官捐献者10。在样本采集前，已从每位患者或其家属处获得书面的组织采集知情同意书。有关本实验方案中使用的所有材料、溶液和仪器的详细信息，请参见 材料表.

1. 人肺切片的制备

注意：在进行肺移植或活检前，患者需常规筛查HIV、HCV或梅毒等病毒，且必须检测结果为阴性后方可进行后续实验，以确保实验室工作人员的职业安全。

  1. 溶液配制
    1. 配制磷酸盐缓冲液（1× PBS），并在 4 °C 预冷。
    2. 配制 2% 琼脂糖溶液。称取 2 g 琼脂糖，转移至锥形瓶中。加入 100 mL PBS，充分混匀后，放入微波炉加热至剧烈沸腾（≥95 °C），直至溶液完全澄清、均匀，无可见颗粒或条纹。加热过程中应不时摇动锥形瓶，防止过度沸腾。将溶液置于 37 °C 水浴中备用。
  2. 精密切割肺组织切片
    1. 用 PBS 清洗肺组织外表面，以去除多余的杂质和血液。
    2. 使用 20 mL 注射器（1.2 mm 针头）吸取适量琼脂糖溶液，插入气管。缓慢将琼脂糖注入肺叶，直至肺组织完全膨胀。当遇到明显阻力时停止注射，以防琼脂糖泄漏。
      注意：每 5 × 2 × 1 cm 的组织块约需 10 mL 琼脂糖，避免溢出。对于较小的组织样本，可使用 5 mL 注射器及包埋模具（如硅胶模具、塑料托盘或截短的离心管）辅助包埋。在模具中倒入 1–2 mm 厚的琼脂糖底层，使其半凝固。将肺组织轻轻放置于半凝固的琼脂糖上，再缓慢倒入额外的琼脂糖完全覆盖组织，避免产生气泡。待琼脂糖完全凝固。
    3. 将肺组织置于冰上约 30 分钟，使琼脂糖充分聚合。通过检查胸膜是否变硬和冷却来确认聚合是否完成；必要时继续冷藏。
    4. 使用锋利刀片将肺组织切成 1–2 cm 的片状。
    5. 将冰浴托盘置于切割台中央，并提前加入冰块进行预冷。
    6. 打开电源开关，按住 UP 按钮将样品台升至合适位置。
    7. 小心将刀片安装至刀架上。
      注意：操作刀片时应谨慎，避免受伤。使用后的刀片应丢弃至指定的锐器容器中。
    8. 剪取一段长约 3 cm、宽约 1 cm 的胶带。将粘性面贴附于托盘上，并将非粘性面均匀涂上氰基丙烯酸酯胶水。
    9. 用镊子夹取一块肺组织，用吸水纸轻轻吸干表面水分，将其放置于涂有胶水的胶带上。轻压以确保牢固粘附。
    10. 待胶水固化后，将托盘放入冰浴托盘中。加入预冷的 PBS，直至组织块完全浸没。
    11. 将振动频率设置为 "10"，切割速度设置为 "2"。按下 FWD 按钮开始切片。第一片完全切下后，按下 STP 按钮停止，再按下 RVE 按钮使刀片回缩。弃去第一片切片。
    12. 手动旋转转盘 6 圈，设定切片厚度为 600 µm。按下 FWD 按钮继续切片，切完后按下 STP 按钮停止。按下 RVE 回缩刀片，用镊子取出肺组织切片。将切片置于含 1% 青霉素/链霉素（P/S）的 PBS 中，并保持在冰上。
    13. 重复上述切片步骤，获得多片厚度约为 600 µm 的肺组织切片（PCLS）。
    14. 当当前组织块即将用尽时，更换新的组织块，并重复步骤 1.2.4 至 1.2.13。

FAP 抗体的纯化

注意：如前所述生成带有C端His标签的FAP特异性单域抗体11,12。

  1. 通过噬菌体展示技术，对组合文库进行多轮筛选，针对固定化或溶液相靶标，实现FAP特异性抗体片段（scFv）的高通量筛选。通过严格洗涤和洗脱回收结合的噬菌体。通过重新感染E. coli扩增噬菌体，并在3-4轮循环中富集靶标结合子。采用噬菌体ELISA和DNA测序验证克隆，以鉴定高亲和力抗体12。
  2. 将编码抗FAP单链可变片段的DNA序列克隆至pET-28a(+)载体中，与His标签融合，用于在E. coli中表达13。
  3. 将重组质粒转化至E. coli BL21 (DE3)细胞中。在20 °C下过夜培养摇瓶培养物，使用异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达14。
  4. 使用镍-氮川三乙酸（Ni-NTA）树脂从上清液中纯化FAP抗体。使用PBS进行缓冲液置换，用于后续应用。
  5. 通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）评估抗体纯度。在预期分子量处出现单一主条带表明纯度较高。

3. FAP 抗体亲和力的评估

  1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养人胚肾293T（HEK 293T）细胞。
  2. 将过表达人成纤维细胞活化蛋白（hFAP）的慢病毒加入至90%汇合度的293T细胞中，孵育96小时以建立稳定的293T-hFAP细胞系。
  3. 用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化293T细胞和293T-hFAP细胞，并收集细胞。
  4. 用PBS洗涤细胞，随后与FAP抗体孵育，再加入Alexa Fluor 488标记的抗His IgG抗体。
  5. 使用NovoCyte流式细胞仪分析荧光强度15,16。

4. scFv-FAP-ICG 分子探针标记

  1. 使用 PBS 将 FAP-scFv 的浓度调整至 2 mg/mL。
  2. 加入吲哚菁绿 NHS 酯（ICG-NHS），使摩尔比达到 5:1（ICG-NHS:FAP-scFv）。
  3. 通过涡旋振荡和摇动充分混匀。
  4. 在室温下避光孵育反应 2 h。
  5. 使用脱盐柱去除未结合的染料。将最终的偶联产物在 4 °C 避光保存。

5. 用于评估PCLS中成纤维细胞活性程度的scFv-FAP-ICG分子探针

  1. 切完PCLS后，将每个切片放入12孔板的每个孔中。每孔用1 mL PBS冲洗两次 mL PBS 以去除残留血液和碎片。
  2. 将PCLS浸入1 mL DMEM（不含FBS），加入scFv-FAP-ICG至终浓度为5 µg/mL。室温下在摇床上孵育1 在避光条件下轻轻振荡孵育 h。
  3. 用 PBS 洗涤样品三次，每次 5 分钟 最小
  4. 使用ICG荧光成像技术获取PCLS的荧光图像 体内 动物成像系统，设置如下：激发波长为785 nm，发射波长为810 nm
  5. 基于荧光强度评估PCLS的纤维化活性。使用兼容软件定义感兴趣区域（ROI），荧光辐射强度以光子数/秒/平方厘米表示2/sr.
    1. 点击 选择感兴趣区域 按钮，使软件自动勾勒出伪彩色区域的轮廓。如果感兴趣区域（ROI）的放置不准确，请手动调整。单击 计算 用于确定该区域内信号强度。若选择了多个子区域，则对所有子区域的数值求和。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人肺组织PCLS的制备流程如图1所示。将人肺组织包埋于琼脂糖中，随后使用剃刀将其修整成大小约为1 cm3的组织块。修整并压平的组织被固定于切片平台上，利用切片机切出厚度为600 µm的切片（图1A，B）。PCLS被置于12孔板中进行孵育（图1C）。

靶向成纤维细胞活化蛋白（FAP）的单链抗体scFv-FAP的制备与亲和力表征方法如下所示 图2scFv-FAP 通过 293F 表达系统进行纯化。对纯化后蛋白的分子量和纯度进行了评估 通过 SDS-PAGE凝胶的考马斯亮蓝染色。观察到的scFv-FAP分子量约为28 kDa，与单链抗体的预期大小一致图 2A，左侧）。如 SDS-PAGE 凝胶所示，使用脱盐柱纯化后，与 ICG 偶联的 scFv-FAP ...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过上述研究方法，制备了来自健康供者和特发性肺纤维化（IPF）患者的肺切片（PCLS）。同时，利用哺乳动物细胞表达FAP的单链可变片段，并验证了其纯度和特异性。采用靶向FAP并标记吲哚菁绿（ICG）的分子探针检测FAP的表达水平，以反映成纤维细胞的活化程度。该方法为肺纤维化的治疗提供了先进的评估手段。

PCLS 在维持组织活性的同时，保留了天然的细胞组成、细胞间相互作用以及细胞-基质关系5,6,7此外，连续切片的均匀厚度和相似形状有助于提高实验结果的可重复性8然而，肺切片（PCLS）制备在技术上仍存在挑战，尤其是在冷冻琼脂糖包埋方案中，琼脂糖聚合前需要实现均匀的组织渗透，这要求进行精细的控制。可能需要对组织块采取额外的外部固定措施，以增强结构刚性，并确保切片过程中的位置稳定性。尽管已有这些改进，肺纤维化的研究仍然面临困难。 体外 使...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢国家自然科学基金（82470061）、广州实验室青年科学家项目（QNPG23-15）以及呼吸疾病国家重点实验室自主项目（SKLRD-Z-202305）对本工作的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25 % 胰蛋白酶-EDTAGibco15050-057
2× Color SYBR Green qPCR Master Mix (ROX2)EZBioscienceA0012-R2
20 ml 注射器WinnerV532159
293T 细胞BeyotimeC6008
502 胶水卓立德D-40
低凝胶温度琼脂糖Sigma AldrichA9414-25G
抗胶原蛋白 I 抗体abcamab138492
抗纤维连接蛋白抗体abcamab2413
抗 His 标签单克隆抗体-Alexa Fluor 488MBLD291-A48
BL21BeyotimeD1009S
刀片Gillette7in83a7Q
Color 逆转录试剂盒（含基因组 DNA 去除剂）EZBioscienceA0010CGQ
考马斯亮蓝超快染色液BeyotimeP0017F
DMEMGibco12800017
锥形瓶四川顺博GG-17
FAP 兔单克隆抗体CST66562
FBSGibco10099-141
镊子RobozRS-5135
ICG-NHS瑞禧生物R-TE-157
IPTGMCE367-93-1
微量天平SecuraSecura225D-1CN
微波炉MideoPM2002
多功能活体动物成像系统BioLightAniView600
Ni-NTAGenscriptL00250
NovoCyte 流式细胞仪ACEA BiosciencesNovocyte
PBSGibco10010023
青霉素-链霉素Gibco15140122
SDS-PAGEBeyotimeP00528
通用RNA纯化试剂盒EZBioscienceEZB-RN4
振动切片机DOSAKADTK-1000N
β-actin 兔多克隆抗体翊圣生物30102ES
引物
β-actin 引物-FiGenebook BiotechCATGTACGTTGCTATCCAGGC
β-actin 引物-RiGenebook BiotechCTCCTTAATGTCACGCACGAT
FAP 引物-FiGenebook BiotechTTGAGTGGATGGGAGGGAT
FAP 引物-RiGenebook BiotechGCTGTGCTCGTGGATTTGT
胶原蛋白-I 引物-FiGenebook BiotechGAGGGCCAAGACGAAGACATC
胶原蛋白-I 引物-RiGenebook BiotechCAGATCACGTCATCGCACAAC
纤维连接蛋白引物-FiGenebook BiotechCGGTGGCTGTCAGTCAAAG
纤维连接蛋白引物-RiGenebook BiotechAAACCTCGGCTTCCTCCATAA

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raghu, G., et al. An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement: Idiopathic pulmonary fibrosis: Evidence-based guidelines for diagnosis and management. Am J Respir Crit Care Med. 183 (6), 788-824 (2011).
  2. Jenkins, R. G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: Use of animal models for the preclinical assessment of potential therapies for pulmonary fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 56 (5), 667-679 (2017).
  3. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), L152-L160 (2008).
  4. Spagnolo, P., Maher, T. M. Clinical trial research in focus: Why do so many clinical trials fail in IPF. Lancet Respir Med. 5, 372-374 (2017).
  5. Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Mol Ther Methods Clin Dev. 10, 245-256 (2018).
  6. Ferren, M., et al. Hamster organotypic modeling of SARS-CoV-2 lung and brainstem infection. Nat Commun. 12, 5809(2021).
  7. Bai, Y., et al. Cryopreserved human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking: A viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. Am J Respir Cell Mol Biol. 54 (5), 656-663 (2016).
  8. Price, A. R., Green, A. J., Brown, K. Precision-cut tissue slices: Applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
  9. MacKenzie, B., et al. Pre-clinical proof-of-concept of anti-fibrotic activity of caveolin-1 scaffolding domain peptide LTI-03 in ex vivo precision cut lung slices from patients with idiopathic pulmonary fibrosis. bioRxiv. 28, (2024).
  10. Yu, P., et al. Comprehensive analysis of fibroblast activation protein expression in interstitial lung diseases. Am J Respir Crit Care Med. 207 (2), 160-172 (2023).
  11. Han, Y., et al. Efficient generation of recombinant anti-HER2 scFv with high yield and purity using a simple method. Biotechnol J. 19 (7), e2300745(2024).
  12. Seo, P., Song, E. W. Phage display screening of therapeutic peptide for cancer targeting and therapy. Protein Cell. 10 (11), 787-807 (2019).
  13. Neuhaus, V., et al. Precision-cut lung slices: An integrated ex vivo model for studying lung physiology, pharmacology, disease pathogenesis and drug discovery. Respir Res. 25, 231(2024).
  14. Huang, Z., et al. ImmunoPET imaging of human CD8+ T cells with novel 68Ga-labeled nanobody companion diagnostic agents. J Nanobiotechnol. 19 (1), 42(2021).
  15. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 49 (10), 1457-1973 (2019).
  16. Rosen, O., et al. A high-throughput inhibition assay to study MERS-CoV antibody interactions using image cytometry. J Virol Methods. 265, 77-83 (2019).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

视频即将推出

相关文章