使用可诱导FRET生物传感器检测线粒体相关内质网膜紧密性

摘要

我们描述了一种用于测量靶向内质网（CFP标记）或线粒体（YFP标记）的可诱导FRET生物传感器的FRET值的方法。 体外 用于评估影响Aβ生成的线粒体相关内质网膜（MAMs）的紧密程度，该方法可用于筛选具有调节MAM功能潜力的合成或天然化合物，作为阿尔茨海默病（AD）治疗药物的初步筛选工具。

摘要

多项研究已表明，内质网-线粒体接触（即线粒体相关膜，MAMs）的数量、长度以及间隙宽度（厚度）会影响其生物学功能。我们之前的研究显示，在阿尔茨海默病（AD）的三维（3D）神经模型中，稳定间隙宽度约为7 nm的紧密型MAMs会导致淀粉样蛋白β（Aβ）水平升高，而间隙宽度约为40 nm的松散型MAMs则可减少Aβ的产生。为了研究不同间隙宽度MAMs的作用，研究人员开发了靶向内质网和线粒体的FRET（Förster共振能量转移）生物传感器——分别为ER-CFP（青色荧光蛋白）和Mito-YFP（黄色荧光蛋白），用于量化紧密型MAMs（<10 nm间隙宽度），并与松散型或非MAMs进行对比。当供体荧光基团（CFP）与受体荧光基团（YFP）之间的距离在10 nm以内时，即可发生FRET，因此该系统适用于评估MAM的接近程度。本实验方案详细阐述了利用光谱比率FRET法来测定紧密型MAM形成的程度。

引言

线粒体相关内质网接触点（MERCs）可通过生物化学方法分离为线粒体相关内质网膜（MAMs），其与包括阿尔茨海默病（AD）在内的多种神经退行性疾病相关¹。近期提出的"MAM假说"认为，MAMs在β-淀粉样蛋白（Aβ）的生成过程中发挥核心作用，从而启动AD的致病级联反应。该级联反应包括神经原纤维缠结（NFTs）的形成、钙稳态失调以及神经炎症²。MAMs由富含胆固醇、类似脂筏的微结构域组成，位于内质网和线粒体外膜（OMM），并通过特定的连接蛋白相互连接，这些连接蛋白赋予MAMs结构和功能上的多样性³。内质网与线粒体接触点的稳定化影响多种细胞过程，包括内质网钙信号传导和细胞凋亡^4,5。据估计，5%–20%的线粒体与内质网形成物理接触以构成MAMs⁶。多项研究表明，MAM位点处内质网与线粒体之间的数量、长度以及间隙宽度（厚度）是决定其功能作用的重要因素。冷冻电子显微镜及对小鼠肝脏的活体分析显示，肝细胞的代谢状态可调节MAMs的厚度（范围为14 nm至20 nm）和长度（范围为145 nm至270 nm）⁷。

MAMs 还逐渐成为多种疾病（包括癌症和代谢性疾病）的潜在治疗靶点。MAM 的厚度或间隙宽度可调控细胞存活。研究人员设计了两种组成型 MAM 稳定剂 MAM 1X 和 MAM 9X，分别用于稳定紧密型 MAM（间隙宽度为 6 nm ± 1 nm）和松散型 MAM（间隙宽度为 24 nm ± 3 nm）。在一种新型的阿尔茨海默病 3D 神经元培养模型中，研究发现稳定紧密型 MAM 会显著增加 Aβ 的生成，而稳定松散型 MAM 则无此效应。⁸因此，将紧密型线粒体-内质网接触（MAM）转化为松散型MAM可能有助于减轻淀粉样蛋白病理。由于MAM稳定性的结构和功能复杂性，以及缺乏对MAM稳定程度的精确定量分析，使得以MAM为靶点进行药物研发具有挑战性。一种基于活细胞成像和显微分轨技术（kymography）的新方法用于分析与内质网结合的线粒体在轴突中的运动速度，结果表明，线粒体的轴突运动速度可作为定量评估MAM稳定性的指标，因为与游离线粒体相比，与内质网形成更紧密接触的线粒体其轴突运动速度显著降低。^8,9. 在表达 hAPP 的 Neuro 2A（N2A）细胞中使用可诱导的 MAM 稳定剂_APP) 细胞⁸我们发现，以剂量依赖的方式缩小MAM间隙宽度会增加Aβ的生成⁸可诱导的MAM稳定剂是表达质粒，编码融合了雷帕霉素可诱导的FK506雷帕霉素结合（FRB）或12-kDa FK506结合蛋白（FKBP）结构域的生物传感器，其中生物传感器分别带有靶向内质网的CFP（青色荧光蛋白）表位标签和靶向线粒体的YFP（黄色荧光蛋白）表位标签。这些生物传感器分别命名为ER-CFP和Mito-YFP。CFP是一种供体荧光素，当其与受体荧光素YFP之间的距离适当时，可将能量转移至YFP >10 nm。细胞（N2A）_APP) 表达可诱导生物传感器的细胞在雷帕霉素处理后Aβ生成增加⁸，表明增加紧密的线粒体相关内质网膜（MAM）会促进Aβ的生成。这些方法将有助于筛选能够调节MAM的小分子化合物，并确定其有效浓度，以实现对最佳水平紧密MAM的稳定，从而逆转致病性（"Aβ 增加"）到治疗性（"降低 Aβ"在不完全破坏对细胞存活至关重要的内质网与线粒体接触的情况下，分离MAMs。

实验模型
本研究使用了稳定表达APP₇₅₁的Neuro2A（N2A）细胞（N2A_APP）。与未处理的N2A细胞相比，这些细胞可在条件培养基（CM）中释放可检测水平的Aβ。N2A_APP细胞培养于添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、2 mM L-谷氨酸以及200 µg/mL G418的DMEM培养基中，具体方法如前所述¹⁰。

表达质粒
通过将哺乳动物A-激酶锚定蛋白1 [AKAP1(34-63)] 的YFP（黄色荧光蛋白）标记的线粒体靶向序列与磷脂酰肌醇-3-磷酸酶 Sac1磷酸酶 [Sac1(521-587)] 的CFP（青色荧光蛋白）标记的内质网靶向序列融合，并插入编码EGRGSLLTCGDVEENPGP肽序列的自剪切Tav2A序列，构建出一种表达质粒，命名为pYFP-AKAP1-Tav2A-Sac1-CFP⁸。该Tav2A融合表达质粒两侧还分别含有编码FK506雷帕霉素结合（FRB）结构域[EMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPL HAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNV (K²⁰⁹⁵P)DLTQAWDLYYHVFRRISKQ] 或12-kDa FK506结合蛋白（FKBP）结构域（MGVEKQVIRPGNGPKPAPGQTVTVHCTGFGKD GDLSQKFWSTKDEGQKPFSFQIGKGAVIKGWDEGVIGMQ IGEVARLRCSSDYAYGAGGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ）的核苷酸序列。构建的融合质粒FRB-YFP-AKAP1(34-63)-Tav2A-Sac1(521-587)-CFP-FKBP，本文简称为MAM-Tav2A，可实现FRB-YFP-AKAP1(34-63)与Sac1(521-587)-CFP-FKBP的等摩尔表达，用于比率型FRET分析。其中，Sac1(521-587)-CFP-FKBP（记为ER-CFP）为供体荧光蛋白，而Mito-YFP-FRB（记为Mito-YFP）为受体荧光蛋白，当两者间距约为10 nm时可产生FRET⁸。因此，基于FRET的生物传感器可检测紧密连接的线粒体相关内质网膜（MAM）结构（间隙宽度为6–10 nm）。引入FRB和FKBP结构域后，可通过剂量依赖性地添加雷帕霉素诱导MAM间隙宽度缩小，并通过FRET信号增强的程度进行定量测定⁸。

方案

本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 转染

1. 用 MAM-Tav2A 表达质粒转染 N2A_APP 细胞（14–18 小时）。
   1. 实验开始前，将 1 × 10⁶ N2A_APP细胞接种于含玻璃盖玻片的 6 孔板中，每孔一孔，用生长培养基培养 12–16 小时。
   2. 使用 Lipofectamine 转染试剂，按照生产商说明书，转染 1–3 μg MAM-Tav2A 质粒（补充文件 1）。
   3. 转染后 12–16 小时，进行药物处理。
      注意：始终设置仅表达供体（ER-CFP）或受体（Mito-YFP）的表达质粒转染细胞，作为 FRET 背景对照。

2. 药物处理

1. 用雷帕霉素（Rapa）或雷帕类似物（Log）处理表达 MAM-Tav2A 的 N2A_APP 细胞（3–6 小时）。
   1. 处理前，配制 Rapa 和 Log 的储存液（10 mM）。
   2. 更换含 0 nM、100 nM 或 250 nM Rapa 或 Log 的新鲜培养基。
   3. 处理 3 小时后，加入 3.3% 多聚甲醛（PFA）固定细胞。
   4. 在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭剂，制备用于荧光共聚焦显微镜观察的样品。
   5. 将盖玻片覆盖在液滴上，并用镊子轻轻按压。
      注意：玻璃盖玻片易碎，操作需谨慎。可选用玻璃底培养皿作为替代方案，但其主要缺点是无法使用抗荧光淬灭剂，这会导致荧光团淬灭，使成像困难。切勿使用含 DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）的抗荧光淬灭剂，因其蓝色荧光会干扰 CFP 与 YFP 之间的荧光共振能量转移（FRET）。

3. 荧光共振能量转移（FRET）的共聚焦显微镜检测

1. 将载玻片置于倒置显微镜下，调节显微镜焦距，直至细胞可见。
2. 使用440 nm激光激发荧光团，并通过468–503 nm发射波长采集供体CFP（FKBP-CFP-ER）的图像，或通过525–565 nm发射波长采集受体YFP（FRB-YFP-Mito）的图像。
3. 使用内置荧光滤光片调节信号强度，直至背景信号消失（应接近纯黑色）。
   注意：采用共聚焦显微镜结合NIS Element AR软件采集荧光图像，放大倍数为60倍，分辨率为512像素。
4. 将图像保存为.nds文件。
5. 进行光谱比率FRET分析。

4. 比值型FRET分析（6 - 12 小时）

注意：使用共聚焦显微镜检测供体ER-CFP（468-503 nm）和受体Mito-YFP（525-565 nm）的荧光发射。采用ImageJ软件在扣除背景后量化平均像素荧光强度。计算YFP与CFP发射强度的比值，并将其作为光谱FRET分析的读数。

1. 打开 Image J (Fiji)。
2. 将 .nds 文件直接拖入 Image J，或点击 文件 -> 打开，然后选择图像。
3. 在接下来的界面中，勾选拆分通道选项。
4. 点击 C = 0 面板。
5. 点击 分析 -> 测量。
   注意：记录下平均值，用于后续计算。
6. 点击 处理 -> 数学 -> 减去。
7. 输入平均值。
8. 对 C = 1 面板重复第 4 步操作。
9. 点击自由手绘选择工具。
10. 圈选感兴趣的细胞，然后按 Ctrl+T 将其记录到 ROI 中。
11. 在 ROI 窗口底部点击显示全部，以查看已选择的内容。
12. 选中所有已选细胞，点击测量，并将这些数值记录到 Excel 表格中。
13. 点击 C = 1 面板，然后点击显示全部。
14. 选中所有细胞，再次点击测量，并将这些数值记录到 Excel 表格的另一列中。
15. 在 Excel 中创建一个函数，将供体信号值除以受体信号值（C0/C1），即为 FRET 比值。

结果

对表达 MAM-Tav2A 的 FACS 富集 N2A_APP 细胞进行的比率型 FRET 分析显示，经雷帕霉素处理后，Aβ40 水平呈剂量依赖性升高⁸。雷帕霉素通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路发挥作用，进而下调小胶质细胞中髓系细胞表达触发受体 2（TREM2）的表达，导致阿尔茨海默病 5XFAD 小鼠模型中 Aβ 斑块清除减少¹¹。雷帕霉素类似物 AP21967，通常称为雷帕霉素类似物（rapalog，Log），对 mTOR 的亲和力较低，因此对细胞相对无毒。然而，由于在 FRB 结构域中引入了补偿性空腔形成突变（K2095P），AP21967 仍能以与雷帕霉素相同的亲和力结合 FRB 结构域¹²。

Rapa 和 Log 处理增加了 FRET 比值（图1）。该处理对APP或其他MAM蛋白（如IP3R3或VDAC1）的水平几乎没有或没有影响。因此，增强紧密（<10 nm）MAMs 增加了 Aβ 的生成 体外⁸值得注意的是，在未处理的 N2A 细胞中进行的 FRET 检测也获得了类似的结果。

图1：缩小MAM间隙宽度可增加体外Aβ的生成。（A）可诱导的MAM稳定剂CFP-FRB-ER-Tav2A-Mito-FKBP-YFP（MAM-Tav2A）示意图，该蛋白可发生自剪切，产生等摩尔水平的供体（CFP-FRB-ER或ER-CFP）和受体（Mito-FKBP-YFP或Mito-YFP），当其结合到内源性紧密MAM上，或通过雷帕霉素（Rapa）或其类似物Rapalog（Log）诱导FRB与FKBP相互作用以增强紧密MAM形成时，可促进FRET/FLIM。（B）表达MAM-Tav2A（Tav2A）的细胞的免疫印迹（IB），显示自剪切后CFP-ER（蓝色框）和Mito-YFP（黄色框）呈等摩尔表达。（C）过表达MAM-Tav2A的细胞经DMSO（Veh）或Rapa（250 nM）处理后的共聚焦图像。（D,E）未经处理（Veh）或经100 nM雷帕霉素（Rapa）（D）或Rapalog（Log）（E）处理的细胞的比率型FRET分析。FRET值以通道2（465–500 nm）与通道1（525–555 nm）的荧光强度比值表示。每次FRET分析随机选取40–50个细胞，逐个细胞生成ROI。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。***p < 0.0001。（F）表达MAM-Tav2A的N2A_APP细胞经24小时利斯的明（Riv：0或50 µM）处理后的代表性Western blot图像。MAM-Tav2A产生等摩尔水平的供体（CFP-ER）和受体（Mito-YFP）。（G）对经载体处理（0 µM）或利斯的明处理（50 µM）细胞的供体与受体之间的FRET比值进行定量分析。（H）经载体处理（0 µM）或利斯的明处理（50 µM）细胞的条件培养基（CM）进行Aβ ELISA（Wako）检测，结果显示50 µM利斯的明处理后Aβ₄₀（pM）水平显著降低。n = 6，p < 0.001。（I）FRET比值和Aβ（pM）数值汇总成表。该图改编自Zellmer等⁸。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充文件 1：MAM-Tav2A 质粒序列文件。编码内质网靶向 Sac1 序列（⁵²¹FLALPIIMVVAFSMCIICLLMA GDTWTETLAYVLFWGVASIGTFFIILYNGKDFVDAPRLVQ KEKID⁵⁸⁷）与 FKBP 和 CFP 序列相连，并与线粒体靶向 AKAP1 序列（³⁴SSHDEQQVEAGAVQLRADPAIKEPLPVEDV⁶³）与 FRB 和 YFP 序列相连，两者通过自剪切 Tav2A 序列（EGRGSLLTCGD VEENPGP）连接的表达质粒的 DNA 序列。请点击此处下载该文件。

讨论

线粒体相关内质网膜（MAMs）的调控是一个新兴的研究领域，可能对癌症、代谢性疾病和神经退行性疾病等多种疾病具有重要意义¹³。许多药物，包括动力蛋白拮抗剂LDC-3/Dynarrestin、降糖药二甲双胍以及抗癌剂莱菔硫烷，均可破坏MAMs结构，目前正处于癌症和代谢性疾病的临床前及临床试验阶段。这些药物通过调节MAM锚定蛋白（如PTPIP51、VAPB、VDAC1、PACS2、MFN2、VDAC1和IP3R3）之间的相互作用，来调控内质网与线粒体之间的接触或MAM接触宽度^{14,15,16,17,18,19,20}。σ-1受体（S1R）拮抗剂（NE-100）可下调MAMs，并在一种阿尔茨海默病（AD）的三维神经元模型中显著降低轴突中的Aβ水平²¹。最近一项研究显示，S1R的缺失会增加松散型MAMs并减少紧密型MAMs，提示S1R可能是调节MAM紧密程度的一个治疗靶点^8,9。

活体FRET（荧光共振能量转移）成像显示，源自阿尔茨海默病（AD）转基因大鼠的神经元中，紧密连接的MAMs（线粒体相关内质网膜）结构发生显著破坏<10 nm），而松散型MAMs（约20 nm）无明显变化，与野生型对照组相比。¹可诱导的基于FRET/FLIM的MAM稳定剂，包含雷帕霉素（Rapa）/雷帕类似物（Log）可诱导的FRB和FKBP二聚化结构域，在N2A细胞中表达_APP 细胞实验表明，Rapa/Log处理以剂量依赖性方式增强了MAM的紧密性，并增加了Aβ40的生成^8,9这首次证明了缩小MAM间隙宽度可促进淀粉样蛋白生成性加工。目前正处于针对轻度至中度阿尔茨海默病的临床前研究阶段的FDA批准抗遗忘药物利斯的明^22,23，显著降低了 Aβ40 水平（p < 0.001），且不改变VDAC1或BACE1的表达水平，也不影响CFP-ER与Mito-YFP之间的共定位频率^8,9. 利斯的明似乎通过调节MAM锚定蛋白线粒体融合蛋白-2（MFN2）的水平来影响MAM的稳定性²⁴这一发现与其他研究结果一致，这些研究报道卡巴拉汀可降低培养神经元和阿尔茨海默病小鼠模型（3xTg）中的 Aβ 水平^25,26由于MAM间隙宽度调控着细胞存活所必需的多种细胞过程²⁷因此，与完全破坏MAM稳定性（可能导致意外的不良反应）相比，靶向调节MAM稳定性可能为对抗Aβ积聚提供更有效的治疗策略。

该方法的一个主要局限性在于，比率型FRET技术依赖于供体和受体的等摩尔表达。共转染编码供体或受体的表达质粒将导致结果不一致。使用自剪切的Tav2A连接供体和受体生物传感器可确保生物传感器的等摩尔表达。然而，在进行FRET分析之前，已通过Western印迹分析检测了生物传感器的表达水平。

雷帕霉素（Rapamycin，Rapa）可能并不适合用于评估线粒体-内质网接触（MAM）紧缩对 Aβ 生成的影响，因为它会抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路，导致小胶质细胞中髓系细胞表达触发受体 2（TREM2）下调，从而在阿尔茨海默病（AD）小鼠模型（5XFAD）中减少 Aβ 斑块的清除¹¹。作为替代方案，可使用雷帕霉素类似物 AP21967，通常称为雷帕类似物（rapalog，Log）。Log 对 mTOR 的结合亲和力较低，因此对细胞的毒性相对较小。然而，由于在 FRB 结构域中引入了补偿性空腔形成突变（K²⁰⁹⁵P），Log 仍能以与雷帕霉素相似的亲和力结合 FRB 结构域¹²。

所描述的方法具有重要意义。尽管已有若干项临床前研究证实，合成或天然的小分子MAM调节剂在癌症和代谢性疾病中表现出有前景的治疗效果，但目前尚未开展任何临床试验。其主要原因之一在于缺乏一种能够定量测量MAM稳定性的可靠方法，而定量评估正是开发有效疗法的前提条件。对MAM结构与功能关系的量化需要获得细胞的完整视图，而传统透射电子显微镜（TEM）或其他高分辨率显微技术无法实现成熟神经元的全面成像，但低倍率成像可实现这一目标²⁸因此，传统的透射电子显微镜（TEM）、冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）或扫描电子显微镜（SEM）技术虽可在纳米尺度上检测细胞结构，但由于线粒体具有高度动态的特性，这些方法在测量线粒体相关内质网膜（MAM）稳定程度方面存在局限性²⁹ 和内质网^30,31 使MAM结构具有瞬时性^32,33,34为了研究线粒体-内质网接触位点（MAM）的结构与功能关系，测量与内质网相连的线粒体的轴突运输速度 通过 采用活细胞成像与线扫描分析技术研究线粒体相关膜结构的紧密或松散状态已被提出^8,9这与已有研究报告一致，即阿尔茨海默病脑源性皮层神经元中线粒体的轴突运输减少³⁵ 分化后的AD胞质杂交细胞³⁶尽管活细胞成像技术具有较高的定量准确性，但其可能不适用于高通量药物筛选。相比之下，FRET/FLIM分析未来可作为一种比现有活细胞成像或高分辨率显微镜更快的定量技术，用于筛选阿尔茨海默病的小分子治疗药物。

本文所述的FRET实验方案已证明特别适用于人工诱导内质网与线粒体之间形成连接的情况。该方法的简便性使其能够高效评估内质网与线粒体接触的稳定性，并研究由此对淀粉样蛋白病理产生的影响，这正是本方法的主要目标。我们计划进一步利用该技术，在近期开发的三维（3D）阿尔茨海默病药物筛选平台³⁷中，筛选一系列潜在的MAM调节小分子化合物库。研究结果将极大有助于筛选出潜在的抗Aβ小分子MAM调节剂¹³ in vitro，并为将来拓展至in vivo或临床研究奠定基础。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BSA	弗舍科学公司	501781532
共聚焦显微镜	奥林巴斯 FV3000RS（日本东京）	N/A
含GlutaMAX补充剂的DMEM培养基	吉布科/赛默飞世尔科技公司	10564011
EDTA	生命技术公司	41116134
Falcon 6孔板	VWR国际公司	41122107
GAPDH多克隆抗体	赛默飞世尔科技公司	PA1-988
明胶	VWR国际公司	9000-70-8
遗传霉素（G418硫酸盐）	吉布科/赛默飞世尔科技公司	10131035
GFP单克隆抗体	英潍捷基公司	MA5-15256
Graphpad Prism N/A	Prism 9，版本9.5.0	N/A
肝素	西格玛-奥德里奇公司	H0200000
ImageJ软件	ImageJ 1.53a	N/A
倒置共聚焦显微镜	尼康（C2 Eclipse Ti2）	N/A
Lipofectamine2000	英潍捷基公司	11668027
MS Excel	微软Excel，版本2302	N/A
NaCl	弗舍科学公司	7647145
NuPAGE 4–12% Bis-Tris凝胶	英潍捷基公司	NP0321BOX
青霉素/链霉素/两性霉素B	隆扎公司	17-745E
Photoshop	Adobe Photoshop CC 20.0.10	N/A
Tris-HCl，pH 7.6	波士顿生物制品公司	42000000
Triton X-100	西格玛-奥德里奇公司	T8787
胰蛋白酶-EDTA	吉布科/赛默飞世尔科技公司	25200056
Tween 20	弗舍科学公司	501657287