基于血流动力学改变与高血压的颅内动脉瘤小鼠改良模型

摘要

采用高血压和血流动力学改变等危险因素，在小鼠体内构建颅内动脉瘤（IA）。通过结扎颈动脉的分支诱导血流动力学改变，通过结扎肾动脉的后支实现高血压。采用磁共振血管成像、体视显微镜和病理学分析检测IA的形成。

摘要

颅内动脉瘤（IA）因动脉瘤破裂相关的发病率和死亡率而构成重大的健康风险。然而，IA 发生发展的分子机制尚不明确，亟需建立合适的动物模型。本研究通过结扎翼腭动脉（PPA）以诱导血流动力学的叠加性改变，并结合高血压诱导，建立了一种小鼠 IA 模型。在 C57BL/6 雄性小鼠中，结扎右侧 PPA、颈外动脉（ECA）、枕动脉（OcA）以及左侧对侧颈总动脉（CCA），以诱导血流动力学改变。一周后，结扎双侧肾动脉后支（pRA），并给予 8% 高盐饮食以诱导高血压。在造模三个月后，采用磁共振血管成像（MRA）、体视显微镜观察及免疫组织化学（IHC）染色，评估 IA 的形态学和病理学改变。实验组中有四只小鼠在初次诱导后死亡。在剩余的 11 只小鼠中，有五只在不同部位检测到 IA。显微镜观察和 MRA 检查均证实了 IA 的形成。病理学和 IHC 分析显示内弹力板断裂、胶原纤维断裂以及 CD86 阳性 M1 型巨噬细胞浸润，这些发现与人类 IA 组织中的观察结果一致。该小鼠 IA 模型能够重现人类标本中观察到的病理改变，可能成为研究 IA 形成与进展分子机制的有力工具。

引言

颅内动脉瘤（IA）在普通人群中的患病率估计为3.2%¹。由于其较高的致残率和致死率，IA构成重大的健康风险。IA是一种复杂的多维度病理状态，受血流动力学改变、炎症反应和血管重塑等多种因素影响^2,3。血流动力学改变和高血压与动脉瘤的形成及进展密切相关^4,5。IA常发生于脑动脉分叉处，这些部位存在较高的血流剪切应力⁶，而分叉角度较窄的血管结构在人类中被确认为IA发生的危险因素⁷。尽管血管内治疗和外科手术策略已取得进展，但由IA破裂引起的蛛网膜下腔出血仍具有灾难性后果。因此，探索药物治疗是预防动脉瘤破裂的一种有前景的策略⁸。然而，IA病理形成和进展的机制仍不明确。基于人类危险因素建立合适的IA形成与进展小鼠模型，对于揭示其潜在机制并发现可能的治疗靶点至关重要。本研究旨在构建一种在小鼠中模拟人类IA特征但不发生破裂的IA形成模型。

大脑动脉环（Willis环，CW）连接并沟通右侧颈内动脉（ICA）、左侧颈内动脉（ICA）以及双侧椎-基底动脉。当颈内动脉或椎动脉发生闭塞或狭窄时，CW可发挥代偿作用⁹。蝶腭动脉（PPA）是颈内动脉的一个分支，负责向脑的外部区域供血¹⁰。基于CW的代偿功能，阻塞PPA可增加ICA内的血流。结扎左侧颈总动脉（CCA）、右侧颈外动脉（ECA）和枕动脉（OcA）可进一步增加CW内的血流，尤其是在角度变窄的区域，从而引起血流动力学改变。在此模型中，脑部的血液供应由椎-基底动脉和右侧ICA共同维持。PPA结扎在小鼠中未导致死亡率增加¹¹。

为了通过弹性蛋白酶注射建立动脉瘤 模型，可采用Alzet泵释放血管紧张素II（Ang-II）或脱氧皮质酮乙酸盐（DOCA）-盐方法诱导高血压^12,13。在涉及大量动物的实验中，应考虑Alzet和DOCA的高昂成本。结扎双侧肾动脉的后支和下支，或仅结扎双侧肾动脉后支所达到的高血压水平无显著差异。然而，前者会导致更严重的肾功能障碍¹⁴。因此，对双侧肾动脉后支（pRA）进行结扎被大多数研究者视为一种合理的方法。

通过单次立体定位注射，将弹性蛋白酶注入右侧基底脑池的脑脊液中¹²。基于弹性蛋白酶注射的颅内动脉瘤（IA）模型在注射后三周内导致60%–80%的IA破裂^15,16，该时间过短，难以用于研究IA的形成与发展过程。此外，目前尚无证据表明人类在IA形成过程中弹性蛋白酶水平升高。另外，对小鼠进行右侧脑池的立体定位注射伴随较高的死亡率和致残率，对初学者而言操作难度极大。

本研究基于人类风险因素，构建了一种三个月内未发生破裂的动脉瘤小鼠模型。该模型消除了与DOCA和Alzet相关的高昂成本。此外，该模型仅需使用体视显微镜即可完成，且初学者易于掌握。

方案

所有小鼠操作程序均遵循伦理审查委员会的标准，并经上海交通大学实验动物福利与使用委员会批准。C57BL/6雄性小鼠（8周龄，20–25 g）饲养于22 °C环境中，光照/黑暗周期为12 h/12 h。操作流程见图1A。简言之，在麻醉状态下结扎左侧颈总动脉（CCA）、右侧颈外动脉（ECA）、枕动脉（OcA）和蝶腭动脉（PPA），以诱导血流动力学改变。在血流动力学改变开始一周后，通过结扎双侧肾动脉（bRA）诱导高血压，并给予小鼠含8%盐的饮食。血流动力学改变及颅内动脉瘤（IA）形成过程如图1B所示。本研究中所用试剂与设备的详细信息见材料表。

1. 基于血流动力学变化和高血压建立小鼠UIA模型

注意：小鼠在手术前禁食12小时。手术器械通过在70%酒精中浸泡至少30分钟进行消毒。

1. 使用小动物麻醉机，通过吸入含2%异氟烷的氧气混合气体（遵循机构批准的麻醉操作规程）进行麻醉。₂ (1 L/min) 通过维持在 37 °C 的加热垫。
2. 结扎左侧颈总动脉
   1. 沿颈部正中线做1 cm的直线切口。分离皮下组织和颈阔肌以暴露气管。
   2. 将颈静脉牵开，沿气管寻找颈动脉鞘（图2A i,ii）。将左侧颈总动脉与迷走神经分离。使用6-0丝线结扎左侧颈总动脉（图2A iii,iv).
3. 结扎右侧颈外动脉和枕动脉
   1. 暴露右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉、枕动脉、迷走神经和舌下神经的解剖结构。用6-0丝线结扎右侧颈外动脉。图2A iii,iv).
   2. 分离眼动脉，并用8-0丝线结扎图2A v - viii). 使用两把直显微镊断开眼动脉（OcA）。
      注意：起源于颈外动脉近端的甲状腺上动脉位于舌下神经下方（图2A v - viii解剖OcA有助于有效暴露PPA的解剖结构。
4. 连接右侧 PPA
   1. 分离舌下神经与颈内动脉。在舌下神经与颈内动脉之间放置外科棉片，以保护神经免受操作相关损伤。
   2. 使用显微镊子剥离PPA周围的血管周围组织。夹住PPA并轻轻暂时提起。在PPA与ICA之间置入一根8-0丝线缝合线，用于结扎PPA（图2A ix,x).
   3. 结扎PPA，并在结扎部位与PPA起点之间保持足够距离，以确保Willis环的血流通畅图2A x).
      注意：此步骤的主要挑战是在极其狭窄的操作空间内进行PPA结扎，同时避免损伤周围神经和血管结构。暴露PPA时应避免压迫气管。
5. 完成操作
   1. 用聚维酮碘对操作区域进行消毒，并缝合伤口。密切观察小鼠，直至其从麻醉中恢复。
6. 诱导高血压
   1. 在正中做一条2厘米长的切口，位置位于第12^th 背部的椎体水平处。切开背侧肌肉以暴露肾脏。用镊子夹住肾脏周围的脂肪组织，并将肾脏固定在肌肉切口内。图2B i,ii).
   2. 分离肾蒂周围的脂肪组织。辨认与肾静脉紧密相邻的肾周动脉（pRA）。图2B iii,iv用直显微镊夹住pRA并向上牵拉，用另一把显微镊分离pRA与肾静脉之间的筋膜。图2B v,vi).
      注意：操作时需谨慎，以防损伤肾静脉，否则可能导致灾难性出血。
   3. 将 pRA 与 6-0 丝线缝合结扎（图2B 七，八）。结扎后立即观察肾脏上部缺血灶的形成（图2B ix,x缝合肌肉和皮肤切口。

2. IA 检查 通过 磁共振血管造影和体视显微镜

1. 在动脉瘤诱导后三个月进行7.0 T飞行时间法（TOF）磁共振血管成像（MRA），以评估颅内动脉瘤（IA）的形成。
   1. 处死小鼠 通过 异氟烷麻醉后经放血和颈椎脱位处死（遵循机构批准的方案）。在体视显微镜下检测IA，方法如先前报道¹⁷.
   2. 用冷却的PBS灌注样本，随后用4%多聚甲醛固定，再用Microfil灌注以显示血管和动脉瘤。
   3. 将动脉瘤定义为由两位独立的神经外科医生观察到的、向外膨出且直径达到载瘤动脉1.5倍以上的病变。^8,18.

3. 组织学与免疫组织化学分析

1. 在显微镜下分离大脑Willis环。将标本置于4 °C条件下，用4%多聚甲醛固定24小时¹⁹。
2. 将标本处理成石蜡切片和冷冻切片，用于组织学和免疫荧光染色。根据生产商说明书，使用EVG和Masson染色法对石蜡切片进行染色¹⁹。
3. 用封闭液孵育石蜡切片，以减少非特异性结合。
4. 在4 °C条件下，用抗CD86一抗对切片过夜孵育。随后孵育二抗，并通过DAB显色反应使切片呈现棕褐色²⁰。
5. 用苏木精进行复染，并使用水溶性封片剂封片²⁰。

结果

动脉瘤形成率
在实验组（n = 15）中，2只小鼠在初次手术后第一周内因未知原因死亡。另1只小鼠在第二次手术后第3天因背部伤口感染死亡，还有1只小鼠在第38天因未知原因死亡，且未检测到动脉瘤。在对照组（n = 5）中，所有5只小鼠均存活至被处死。在实验组存活的小鼠（n = 11）中，诱导后三个月的收缩压显著高于诱导前（90 ± 1.39 mm Hg 对比 126.63 ± 1.83 mm Hg；P < 0.0001）。在对照组（n = 5）中，诱导前与处死时的血压保持稳定（88 ± 2.34 mm Hg 对比 91.8 ± 1.2 mm Hg；P > 0.05）。

颅内动脉瘤评估与发现
在实验组中，通过对11只存活小鼠进行磁共振血管成像（MRA）和光学显微镜检查，发现其中5只小鼠在不同部位存在颅内动脉瘤。两个动脉瘤位于前 cerebral 动脉-嗅动脉分叉处，两个位于前交通动脉，一个位于后 cerebral 动脉（<...

讨论

本研究提出了一种构建小鼠颅内动脉瘤模型的改良方法 通过PPA连接 以在与高血压联合作用下诱导加性的血流动力学变化。MRA 成像与显微分析显示，威尔利斯环出现显著的动脉瘤样改变。该模型中观察到的病理改变与人类样本中的发现一致。此小鼠模型可作为研究颅内动脉瘤形成与发展分子机制的重要工具。

通过结扎左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、枕动脉（OcA）、甲状腺上动脉（PPA）以及双侧肾后动脉（pRA），并结合高盐饮食，在小鼠中诱导了颅内动脉瘤（IA）。蔡等人采用类似方法建立了一种血压正常的鼠类动脉瘤模型，并观察到脑动脉瘤的形成以及大脑前动脉的扩张²²。宫本等人报道，与仅结扎左侧CCA相比，额外结扎右侧PPA和右侧ECA可显著增加大鼠IA的形成率。结扎ECA和PPA可能通过增加血流量来放大血流动力学变化¹⁸。在人类中，颈动脉闭塞已被证实与颅内动脉瘤的形成相关²³。因此，这种改良的小鼠IA模型可能有助于深入探究IA...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7.0 T 磁共振血管成像	Bruker	BioSpec 70/20
C57BL/6 小鼠	Charles River Laboratories		性别：雄性
CD86 抗体	CST	91882
弹性纤维 Van Gieson (EVG) 染色	Solarbio	G1597
Masson 染色	Solarbio	G1340
显微镊	上海金钟仪器公司
Microfil	Flow Tech Inc.	MV-120
小动物麻醉机	RWD	R500
体视显微镜	上海光学仪器公司	XYH-6B
缝合线	上海金环医疗器械公司		6-0, 8-0