方法文章

小鼠肺腺癌进展过程中肺功能与血流动力学的动态变化：基于全身体积描记法与多普勒超声的检测

DOI：

10.3791/68306

⸱

2025年6月10日

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1School of Clinical Medicine, Chengdu University of TCM, 2Chengdu Xinjin District Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3China Civil Affairs University, 4Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

本文内容

摘要

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本方案采用小鼠肺功能检测和多普勒超声作为研究技术，为肺腺癌的研究提供了一种无创、简便且高效的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肺腺癌（LUAD）是一种常见的恶性肺部肿瘤，其进展会导致通气和血流的改变，凸显了肺脏在病理状态下的独特功能特征。非侵入性全身体积描记法（WBP）系统能够对清醒小鼠的肺功能和气道反应性进行实时监测，避免了气管切开和麻醉带来的干扰。小型动物多普勒超声（DU）利用高频成像技术，可无创地获取微血管结构及肺血流速度的变化，为研究与LUAD相关的通气和灌注异常提供了重要支持。本研究采用100 mg/kg的4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（NNK）在A/J小鼠中建立了LUAD模型，并结合WBP与DU技术对小鼠的肺功能及血流动力学参数进行监测。结果显示，在肿瘤进展过程中，模型组的关键指标显著下降（p < 0.05），包括50%呼气流量（EF50）、每分钟通气量（MV）、峰值呼气流速（PEF）、峰值吸气流速（PIF）、增强暂停指数（Penh）和潮气量（TV），同时肺动脉血流速度也明显降低（p < 0.05）。该联合方法有效捕捉了小鼠LUAD病理发展过程中的功能紊乱，为呼吸系统疾病的研究提供了一种无创且高效的手段。

引言

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肺腺癌（LUAD）是非小细胞肺癌最常见的亚型1。随着环境污染加剧、吸烟率上升以及人口老龄化，全球LUAD的发病率逐年升高2,3,4。目前研究表明，随着LUAD病情进展，患者肺功能呈进行性下降，并出现血流动力学紊乱5,6,7,8。开发无创、高效且经济的方法来监测和评估肺功能及肺动脉血流波动，可为临床LUAD管理提供关键依据。

现有研究表明，肺腺癌（LUAD）肿瘤的生长会逐渐阻塞气道，降低肺容量和通气功能9，并触发炎性细胞因子的分泌，通过局部慢性炎症进一步加重气道狭窄10。因此，肺功能下降会导致低氧血症加剧和血流动力学异常11,12。这些病理变化在临床上常表现为进行性呼吸困难和胸闷。尽管CT成像无法实时捕捉LUAD进展所引起的肺功能参数异常或血流动力学改变，且重复的短期CT扫描还会增加辐射暴露风险13，相比之下，全身体积描记法（WBP）和多普勒超声血流测定技术则具有无创、操作简便和可重复性高的优势，可作为动态监测的补充手段。联合应用这些技术对肺功能和血流动力学进行监测，有望提升对疾病进展的评估能力，并优化治疗决策。

在本研究中，我们利用A/J小鼠建立4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（NNK）诱导的肺腺癌（LUAD）发生与进展模型。通过全身体积描记法（WBP）和多普勒超声（DU），在第4、10和20周时纵向监测肺功能及血流动力学变化。该方法旨在为肺腺癌的病理生理机制及治疗策略提供新的见解。

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方案

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本研究中描述的所有动物实验均经成都中医药大学动物福利伦理委员会批准，并遵循相关动物研究伦理的法律法规（20240616IV）。雌性近交系 A/JGpt 小鼠（7-8 周龄）饲养于 20-24 °C 环境中，相对湿度为 40%-70%。在 12 小时明暗循环条件下，小鼠可自由摄取标准动物饲料和纯化水。实验开始前，动物在此环境中适应 7 天。

1. 动物模型的建立与准备

  1. 将NNK溶于生理盐水中，配制成浓度为10 mg/mL的储备液。
  2. 在第4周（建模后第28天）、第10周（建模后第70天）和第20周（建模后第140天）使用WBP检测肺功能。在第20周（建模后第140天）使用DU测量肺动脉血流速度。每次测量前，将小鼠置于适宜环境中以尽量减少应激反应。

2. 无创肺功能检测

注意：WBP 系统使用专门设计的测量舱，在清醒、自由活动的动物中测量呼吸功能。测量舱装有气流筛，允许空气进出舱内。气流筛造成的空气阻力导致舱内相对于周围环境空气产生微小的压力变化。通过连接一个高灵敏度的压力换能器来测量舱内的这些压力变化，由此可推导出气流（称为箱内气流）。软件可提供流量和容积等呼吸参数，并实现实时报告。

  1. 获取以下主要组件：WBP 控制器、控制器电源变压器、控制条、长控制条电缆和短控制条电缆、校准柱、WBP 体积描记仪、流量传感器、温湿度探头、雾化头（紫色）、偏置气流滤膜及管路、PC。
  2. 按以下说明组装硬件。
    1. 按以下说明进行后方面板连接。
      1. 使用 USB 2.0 电缆将控制器单元连接到计算机，并确保连接稳定。
      2. 用自来水将校准柱填充至注水线处，连接到控制器背面的端口，并确保管路干燥。
      3. 将电源变压器插入控制器背面，确保连接牢固。
      4. 根据控制条的放置位置，选择长或短的控制条电缆连接至控制器背面。
      5. 将控制器单元就位，并合理安置校准柱和电源变压器。
    2. 按以下说明进行前面板连接。
      1. 将每个流量传感器插入标有“Sensor”的端口。将每个偏置气流滤膜及管路插入前面板上标有“Bias Flow”的控制器端口。将偏置气流隔离电阻连接至偏置气流管的开放端。
    3. 按以下说明进行腔室连接。
      1. 将腔室放置在控制器单元前方，确保其置于坚固、稳定且无振动的表面上。
      2. 将流量传感器连接至腔室，并调整传感器方向，使 DSI 标志朝上。
      3. 将带隔离电阻的偏置气流管路连接至体积描记仪底部的端口。
      4. 移除体积描记仪顶部的堵头，并替换为雾化头（紫色）。
  3. 按以下说明设置软件。
    1. 启动控制程序软件并登录。在控制器主页上，点击 Hardware Configuration。点击 New Configuration 启动配置向导，然后选择 WBP（序列号：DEMO-061），并点击 Next。
    2. 在“Species”下拉菜单中选择 Mouse。将流量设置为默认值。选择 4 sites （每个站点对应一个腔室，每轮实验最多支持 4 个腔室）。确保所有激活站点的偏置气流速率保持一致。将软件中的站点与 WBP 控制器上的实际端口匹配。最后点击 Finish 完成配置。
  4. 数据采集
    1. 打开主程序并对腔室进行校准，此步骤至关重要。将鼠标悬停在硬件上以显示黄色工具图标。点击该图标进入校准界面，然后点击 All 同时对四个动物的腔室进行校准。
    2. 在“Create Study Options”中选择 Dose Response Study，创建所需的研究方案。将 GLP 配置设置为 not follow GLP。
    3. 点击 New Parameter 打开参数构建器，以配置测量参数和任务序列，并添加需要测量的参数。任务序列使用默认设置。
    4. 前往工作站中的 My Laboratory 页面，将准备好的研究方案拖放至用于小鼠的 WBP 模块中，以开始数据采集。
    5. 点击每个站点的红色三角按钮以开始数据采集。若需同时启动全部四个站点，请点击 Session > Acknowledge all sites。启动采集后，工作站将打开“Configure Acquisition”页面，可用于编辑每个采集站点中小鼠的信息。
    6. 依次点击 Session > Acknowledge all Sites 以开始数据采集。为确保实验结果真实可靠，实验前需将实验小鼠置于安静环境中适应稳定 30 分钟。
    7. 将安静状态的小鼠放入完全密封的测试罐中。在系统中点击 Start 选项开始数据采集。系统每 2 秒采集一次数据，因此至少采集 10 分钟，取中间 4 分钟的数据进行分析。本实验中每组测试 5 只动物，重复实验 3 次。
    8. 在“Study”页面点击 Create Report，并选择报告类型。将实验数据以电子表格格式保存。本实验中采用呼气峰流速（PEF）、吸气峰流速（PIF）、增强呼气暂停（Penh）和潮气量（TV）来评估小鼠肺功能。

3. 肺动脉血流速度测量

  1. 动物准备
    1. 将小鼠放入麻醉诱导室，使用 5% 异氟烷（流速：1 L/min）进行麻醉。将小鼠固定在动物操作平台上，维持平台温度在 35–37 °C，以保持其体温。
    2. 将小鼠的口鼻置于麻醉面罩中，以 1%–2% 异氟烷（流速：0.6–1 L/min）维持麻醉。当小鼠保持稳定的仰卧位，心率稳定，呼吸节律规则，肌肉完全松弛，四肢无活动，无触须抽动反应，足底回缩反射消失，黏膜呈粉红色，且瞳孔无散大时，视为已达到适当的麻醉深度。
    3. 此时，使用无菌棉签将 2–3 mg 眼膏涂抹于下结膜囊内。轻柔地上下滑动眼睑以促进闭合，避免压迫眼球，确保眼膏在角膜表面均匀分布。
  2. 成像区域准备
    1. 使用脱毛膏和脱毛装置去除胸部毛发。用湿润纱布或湿巾清洁处理区域，然后用棉签均匀涂抹预热至 37°C 的耦合剂，使其厚度保持在 0.3 mm，确保无可见气泡。
  3. 多普勒超声成像
    1. 使用 40 MHz 多普勒超声探头从胸骨旁长轴切面测量肺动脉血流速度。将探头向左倾斜 45°，操作台向右倾斜 15°。从胸部右侧降低探头，并微调 X 和 Y 轴，根据右心室与肺动脉的解剖空间关系、形态特征及血流动力学方向，定位右心室和肺动脉。
    2. 按下 CF 按钮切换至多普勒模式。观察肺动脉血流的蓝色信号。将取样线置于肺动脉处，按下 PW 按钮以显示肺动脉血流频谱。
    3. 按下 Freeze 按钮冻结图像，然后按下 Measure 按钮，在触摸屏上选择 Velocity 选项。将测量线置于频谱峰值处，获取肺动脉最大血流速度。
  4. 数据采集
    1. 使用离线分析软件选取肺动脉脉冲多普勒数据。进入心脏功能测量包（Cardiac Package measurement pack），选择 RV and PV Function，输出肺动脉血流速度及保存的图像。

4. 数据分析

  1. 使用 R4.4.2 和 GraphPad Prism 9.5.1 进行数据分析并绘制图表。组间肺功能数据的比较采用独立样本 t 检验，组内比较则采用重复测量方差分析（ANOVA）。组间肺动脉血流速度的比较使用独立样本 t 检验，统计学显著性设定为 p < 0.05。

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结果

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为验证肺功能及肺动脉血流评估方法的可行性、准确性和可重复性，我们绘制了空白组在第4周监测期间每分钟的平均曲线，包括吸气峰流速（PIF）、呼气峰流速（PEF）以及50%肺活量时的呼气流速（EF50，放大10倍）（图1A）。如该图所示，三条对应曲线在形态上表现出高度一致性。尽管绝对变化较小，尤其是EF50，这些细微变化仍被准确捕捉，表明全身体积描记法（WBP）在采集小鼠关键呼吸参数方面具有高敏感性。这三个参数相互独立，无需依赖其他指标进行计算。PIF和PEF主要反映整体气道功能和气流速度，而EF50更侧重于小气道功能的评估14。PEF通常最高，因为在呼气过程中，肺和胸壁肌肉的快速收缩产生显著的压力差，促使气体迅速排出。相比之下，PIF通常低于PEF，因为吸气是一个主动过程，需克服肺的弹性回缩力，且伴随胸腔扩张所产生的压力差相对较小。EF50在呼气中期测得，其值通常低于PEF和PIF，因为此时肺容积已减小，导致气流速度降低15。图1A

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讨论

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本研究根据既往报道，选用NNK联合A/J小鼠构建肺腺癌模型。相关研究表明，NNK联合A/J小鼠在第10周开始可出现微小肿瘤形成th 周，并在第16周形成稳定的肿瘤th 至 20th 周18,19因此，我们选择了在4进行的测试th 注射后一周观察肿瘤早期发展阶段肺功能和肺动脉血流的变化，并在第10周继续进行检测th 周，以评估小鼠肿瘤发育初始阶段检测指标的变化，最后在肿瘤发育稳定阶段（第20周）进行最终检测th 周，以客观比较三种测试的结果。

本研究成功利用全身体积描记技术结合多普勒超声，在NNK诱导的肺腺癌小鼠模型中监测了肿瘤进展过程中肺功能的动态变化。结果表明，随着肿瘤生长，小鼠出现显著的阻塞性通气功能障碍。此外，肺动脉血流速度明显降低，可能提示肺血管阻力增加及肺血流灌注减少，这可能是肿瘤生长及其占位效应共同作用的结果，其中占位效应为...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢成都中医药大学基础医学院黄聪教授的支持。本研究由四川省科技计划项目（项目批准号：2024YFFK0173）资助

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A/J 小鼠GemPharmatech LLC.N000018
0.5 ml EDTA 管Labshark 130201070
1-丁酮，4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)Gu Shi Gong Yuan 医疗设备有限公司N589770
75% 乙醇成都 Chron Chemicals 有限公司2023052901
麻醉诱导室上海塔湾智能科技有限公司MZ-MR
脱毛膏上海宇燕仪器有限公司20230623
脱毛装置上海宇燕仪器有限公司3180
异氟烷上海杜马生物科技有限公司DM-M9462
医用胶带北京兰博康斯科技有限公司19-5023
医用三录仪MedChemexpress69652
PBS 缓冲液上海福生有限公司A-RY5256
生理盐水（药品）北京百奥莱科技术有限公司GL1736‌
超声耦合剂启盛（上海）医疗设备有限公司20212060273

参考文献

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  1. Melocchi, V., et al. Aggressive early-stage lung adenocarcinoma is characterized by epithelial cell plasticity with acquirement of stem-like traits and immune evasion phenotype. Oncogene. 40 (31), 4980-4991 (2021).
  2. Cardoso, D., Painho, M., Roquette, R. A. A geographically weighted regression approach to investigate air pollution effect on lung cancer: A case study in Portugal. Geospat Health. 14 (1), (2019).
  3. Cockburn, M. G., Wu, A. H., Bernstein, L. Etiologic clues from the similarity of histology-specific trends in esophageal and lung cancers. Cancer Causes Control. 16 (9), 1065-1074 (2005).
  4. Liu, B. D., et al. Expert consensus on image-guided radiofrequency ablation of pulmonary tumors: 2018 edition. Thoracic Cancer. 9 (9), 1194-1208 (2018).
  5. Chen, Y., et al. Club cells employ regeneration mechanisms during lung tumorigenesis. Nat Comm. 13 (1), 4557(2022).
  6. Yang, M., et al. Alveolar type I cells can give rise to KRAS-induced lung adenocarcinoma. Cell Rep. 42 (12), 113286(2023).
  7. Roche, O., et al. Identification of non-coding genetic variants in samples from hypoxemic respiratory disease patients that affect the transcriptional response to hypoxia. Nucleic Acids Res. 44 (19), 9315-9330 (2016).
  8. Zhai, R., Yu, X., Shafer, A., Wain, J. C., Christiani, D. C. The impact of coexisting COPD on survival of patients with early-stage non-small cell lung cancer undergoing surgical resection. Chest. 145 (2), 346-353 (2014).
  9. Chang, W. H. Complete spontaneous resolution of a giant bulla without rupture or infection: a case report and literature review. J Thoracic Dis. 9 (6), E551-E555 (2017).
  10. Wang, X., et al. SAA suppresses α-PD-1 induced anti-tumor immunity by driving TH2 polarization in lung adenocarcinoma. Cell Death Dis. 14 (11), 718(2023).
  11. Best, S. A., et al. Distinct initiating events underpin the immune and metabolic heterogeneity of KRAS-mutant lung adenocarcinoma. Nat Comm. 10 (1), 4190(2019).
  12. Fujimoto, J., et al. Development of Kras mutant lung adenocarcinoma in mice with knockout of the airway lineage-specific gene Gprc5a. Int J Cancer. 141 (8), 1589-1599 (2017).
  13. Zhang, D., et al. Reducing radiation dose to selected organs by selecting the tube start angle in MDCT helical scans: a Monte Carlo based study. Med Phys. 36 (12), 5654-5664 (2009).
  14. Yang, X. X., et al. Pharmacological effects of Bufei Jianpi granule on chronic obstructive pulmonary disease and its metabolism in rats. Front Pharmacol. 13, 1090345(2022).
  15. Hankinson, J. L., Odencrantz, J. R., Fedan, K. B. Spirometric Reference Values from a Sample of the General U.S. Population. Am J Resp Crit Care Med. 159 (1), 179-187 (1999).
  16. Quindry, J. C., Ballmann, C. G., Epstein, E. E., Selsby, J. T. Plethysmography measurements of respiratory function in conscious unrestrained mice. J Physiol Sci. 66 (2), 157-164 (2016).
  17. Rivera, D. A., Buglione, A. E., Ray, S. E., Schaffer, C. B. MousePZT: A simple, reliable, low-cost device for vital sign monitoring and respiratory gating in mice under anesthesia. PloS One. 19 (3), e0299047(2024).
  18. Song, M., et al. Dietary 5-demethylnobiletin inhibits cigarette carcinogen NNK-induced lung tumorigenesis in mice. Food Function. 8 (3), 954-963 (2017).
  19. Upadhyaya, P., Kenney, P. M., Hochalter, J. B., Wang, M., Hecht, S. S. Tumorigenicity and metabolism of 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol enantiomers and metabolites in the A/J mouse. Carcinogenesis. 20 (8), 1577-1582 (1999).
  20. Hu, P., et al. Haemoptysis as a prognostic factor in lung adenocarcinoma after curative resection. British J Cancer. 109 (6), 1609-1617 (2013).
  21. Popper, H. Primary tumor and metastasis-sectioning the different steps of the metastatic cascade. Transl Lung Cancer Res. 9 (5), 2277-2300 (2020).
  22. Jin, C., et al. Commensal Microbiota Promote Lung Cancer Development via γδ T Cells. Cell. 176 (5), 998-1013.e16 (2019).
  23. Zhao, S., et al. Clinical manifestations of pulmonary mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma: single-center experience with 18 patients. OncoTargets Ther. 11, 555-561 (2018).
  24. Liu, C. H., et al. Lipopolysaccharide-Mediated Chronic Inflammation Promotes Tobacco Carcinogen-Induced Lung Cancer and Determines the Efficacy of Immunotherapy. Cancer Res. 81 (1), 144-157 (2021).

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