方法文章

使用氧化偶氮甲烷和硫酸葡聚糖钠建立结肠炎相关结肠癌小鼠模型的优化方法用于肿瘤免疫学与治疗研究

DOI：

10.3791/68351

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2025年7月25日

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1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Immunology, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, 4University of Florida Health Cancer Center

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎相关性结肠癌是一种成熟且经济有效的小鼠大肠原位肿瘤建模方法。本文介绍了一项更新的实验方案，并讨论了性别特异性的DSS剂量优化以及微生物组在确保实验严谨性、稳健性和可重复性方面的重要作用。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

氧化偶氮甲烷（AOM，一种DNA损伤剂）和葡聚糖硫酸钠（DSS，一种促进结肠炎的试剂）可在小鼠大肠中高效诱导肿瘤形成。由AOM/DSS诱导的小鼠结肠炎相关性结肠癌（CAC）模型是研究炎症相关结肠癌的金标准，因其能准确模拟人类CAC的临床特征。该模型的优势包括：肿瘤起源于内源性组织、免疫系统完整从而保留了完整的肿瘤-免疫相互作用、适用于多种小鼠品系、潜伏期短（约3个月）以及相对较低的成本。尽管具有上述优势，该实验方案仍存在若干挑战，限制了其有效性。不同研究中DSS剂量及肿瘤发生率的差异导致结果不一致；此外，肠道微生物群的个体差异增加了实验变异性，对统计效能产生负面影响。小鼠对AOM/DSS处理的性别差异进一步增加了结果解读的复杂性。同时，DSS批次间的差异也阻碍了研究结果的可重复性。解决这些问题对于提升该模型在临床前研究中的可靠性与适用性至关重要。为此，我们以C57BL/6J小鼠为模型，优化了现有实验方案，提出一系列有效策略以增强实验的可重复性与不同研究间的可比性。这些策略包括针对雄性和雌性小鼠的DSS剂量滴定建议，以及在每轮DSS处理前实施微生物群均一化措施，以减少笼间肠道菌群异质性。这些改进显著降低了实验变异，提高了可重复性，实现了稳定可靠的CAC诱导。鉴于炎症反应和细胞免疫机制在CAC发展中的关键作用，本方案还详细描述了适用于从结肠肿瘤及周围组织中提取RNA或蛋白质、以及分析炎症性细胞因子谱的组织处理流程。最终，采用本方法可实现更严谨、稳健且可重复的CAC模型构建。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的主要原因之一1,2。与散发性结直肠癌相比，结肠炎相关性结直肠癌（CAC）发生于炎症性肠病（IBD）患者长期反复肠道损伤的基础上3,4，其特征为恶性程度更高，且在较年轻年龄即倾向于多灶性发病。由于这些因素，CAC通常需要更积极的治疗，但临床预后较差5。尽管CAC被认为是一种独立的疾病实体，部分原因在于其突变获得的时间特征独特，且炎症性免疫机制和微生物组发挥着更为显著的作用，但CAC与散发性CRC在整体基因组景观和发病机制特征方面仍存在诸多相似之处。为了增进对结直肠癌（尤其是CAC）的深入理解，并改进治疗策略，建立可靠的临床前模型至关重要。

在用于研究结直肠癌的各种模型中，AOM/DSS诱导的结肠炎相关性癌（CAC）模型应用最为广泛，被公认为当前的金标准6,7. 由AOM强致突变刺激启动，该模型依赖于反复DSS诱导的结肠炎发作，可高度模拟人类炎症性肠病（如克罗恩病和溃疡性结肠炎），而这些疾病是结肠炎相关性结直肠癌（CAC）的明确风险因素8. AOM/DSS 模型相较于其他模型具有多项关键优势 在体 方法。与依赖注射外源性致癌物质以建立皮下或原位肿瘤的方法不同，AOM/DSS诱导的结肠炎相关性癌（CAC）属于自发性肿瘤模型，即肿瘤在体内自然发生，癌变过程在原生组织微环境中展开，更真实地反映了其生物学特性和自然病程。与仅能在免疫缺陷小鼠中移植人源细胞系或患者来源组织的异种移植模型不同，该模型具有完整的免疫系统，可用于研究肿瘤与免疫系统之间的相互作用。与依赖特定遗传驱动突变的基因工程模型不同，该模型不依赖于预设的基因突变，因而能够更广泛地模拟癌症信号通路及免疫教育机制。此外，AOM/DSS模型可便捷地应用于多种不同品系的小鼠，无需复杂的繁育计划，具有时间和成本效益。然而，动物性别、DSS剂量以及肠道微生物群的差异等因素可能引入变异性，影响实验的可重复性，从而限制其在转化研究中的应用。

我们的目标是优化该实验方案，以减轻结肠炎症程度和结肠炎相关结直肠癌（CAC） tumorigenesis 中不一致性的潜在影响因素。目前在诱导急性炎症、结肠炎或慢性炎症及 CAC 时所使用的 DSS 浓度存在显著差异9,10。DSS 是一种聚合物，其平均分子量在不同批次和不同生产商之间可能存在差异，从而导致实验结果的变异性。因此，对每一批次的 DSS 进行预实验以确保研究间的一致性至关重要。此外，DSS 诱导的炎症程度高度受肠道微生物组的影响，而全球不同小鼠设施之间的微生物组可能存在显著差异，甚至在同一机构内不同饲养区域和品系之间也存在差异11,12。这种微生物组成的差异可能影响模型的结果，并导致实验结果不一致13。在可能的情况下，将不同实验组的动物同笼饲养对于降低变异性至关重要，但这可能不足以完全消除这一混杂因素，因为微生物群落在时间推移中会发生随机漂变，从而在慢性炎症模型中产生笼位效应14。由于 AOM/DSS 实验方案涉及长期处理以维持慢性炎症，我们通过定期混合所有饲养 AOM/DSS 处理动物的笼盒垫料，实施了微生物群均一化措施。该做法有助于均一化微生物环境，从而减少实验变异性。此外，观察表明，DSS 的作用可能因动物性别而异15,16，可能导致炎症和癌症发展中的不同反应。我们通过分别在雌性和雄性小鼠中对 DSS 进行剂量滴定，优化了现有实验方案，为两性选择合适的 DSS 剂量，以确保更一致的实验结果，并为统计效能计算提供关键输入，从而确定雌性和雄性小鼠中的最佳样本量。

总体而言，为了提高AOM/DSS模型的可重复性，我们提出了一套标准化的实验方案指南，以识别并减少这些混杂因素的影响。我们采用了微生物组均一化技术，并详细描述了精确调整DSS剂量的方法，以获得更一致且可重复的实验结果，从而提升AOM/DSS模型的实用性，并促进不同研究之间的标准化。本方案的突出优势在于通过微生物群均一化的饲养笼显著降低了实验变异，并提供了清晰、逐步的操作说明，以实施这些提高可重复性的措施。由于这些方案优化措施降低了组内变异，因此在检测实验组间差异时，达到所需统计效能所需的样本量也随之减少。该优化方案适用于希望将AOM/DSS模型应用于自身小鼠模型和实验设计的研究人员，无论小鼠品系或性别背景如何，均可用于肿瘤发生机制、治疗靶点或免疫细胞动态的研究。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物实验操作必须依照机构批准的方案进行，以确保人道对待并遵守伦理标准。本研究所述研究已获得佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. DSS 剂量的优化

  1. 获取用于主实验的相应品系、来源和年龄的小鼠，雌雄数量应均等。通过耳标、尾部标记或其他经批准的方法对每只小鼠进行个体标识。测量并记录每只动物的初始体重。
    注意：雄性小鼠应在断奶前共同饲养，且不应在不同笼子之间重新分配，以尽量减少打斗行为。
  2. 若使用自动供水系统，在实验开始前一周，将动物转换为使用水瓶供水，同时用无菌塞堵住笼内饮水嘴（笼中的金属吸管），以阻断自动供水。
    注意：任何对供水方式的更改（例如阻断自动饮水装置的出水口）均须经IACUC或负责监督动物人道使用的相关监管机构批准。动物笼具可能需要每日检查，以确保饮水供应持续无中断。
  3. 通过将DSS溶解于高压灭菌的无菌饮用水中，配制浓度为1.5%至5%（w/v）的DSS溶液，使用磁力搅拌器和搅拌板进行搅拌。室温下静置30分钟，使DSS粉末完全溶解。每周新鲜配制DSS水溶液，并于4 °C保存，最多可保存一周。
  4. 在每个浓度下，准备两个50 mL的锥形管，分别装入DSS水溶液（一个用于雄性小鼠，一个用于雌性小鼠），并牢固安装高压灭菌的无菌饮水嘴，防止泄漏。
  5. 将各浓度的DSS水溶液分别给予雌性和雄性小鼠，每笼3只小鼠接受相同浓度的处理。使用不含DSS的无菌饮用水作为阴性对照。每隔一天更换一次DSS水溶液。
  6. 连续给予DSS水溶液7天。每天记录每只小鼠的体重。
  7. 第8天，将所有动物恢复为正常饮用水。
  8. 第8天，根据粪便性状，采用标准化评分系统评估腹泻严重程度（如文献17所述），并记录评分结果。评分为"1"表示粪便质地较软但仍成形；"2"表示粪便非常软；"3"表示腹泻。
  9. 第8天，收集2–3粒新鲜粪便样本，检测隐血（见材料表），并记录样本中是否存在血液。
  10. 根据两项评分标准综合评估肠道出血情况：粪便性状（0–3分）和粪便中是否含血（0–3分），总评分范围为0至6分。
  11. 从第9天到第12天，每天记录每只小鼠的体重，并密切观察DSS处理组动物是否出现显著体重下降或严重腹泻。一旦动物达到或超过人道终点，应立即依据批准的动物使用方案和既定伦理准则，采用二氧化碳（CO2）窒息或其他适当方法实施安乐死。
  12. 从第13天到第18天，继续监测动物状态，并每日记录每只小鼠的体重，直至其体重恢复至实验前水平。
  13. 确定最佳DSS浓度，即导致小鼠体重下降约20%，同时粪便仍为柔软但成形的状态。最佳DSS剂量可能因小鼠性别、品系、年龄、DSS批次及动物设施条件的不同而有所差异。

2. CAC 诱导

  1. 第0–6天：AOM处理 第7-28天：1 st DSS处理周期
    1. AOM 储存液的配制：将 AOM 粉末溶于无菌生理盐水中，配制成 10 mg/mL 的储存液。用 0.45 µm 滤器过滤溶液，分装至 1.5 mL 微量离心管中，每管 1 mL，于 -80 °C 保存，可保存长达一年。
      注意：AOM 是一种挥发性致癌物，必须在生物安全柜中操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），同时遵循制造商的安全建议。AOM 及任何被 AOM 污染的材料应按照机构的危险化学废物处理规程进行处置。研究人员有责任提前获得必要的环境健康与安全审批。
    2. 若使用自动笼具供水系统，在实验开始前1周，封闭自动饮水嘴，并将动物转为使用水瓶供水，以进行适应性驯化，具体操作同步骤1.2。
    3. 第0天，称量并记录每只小鼠的体重，以计算所需AOM的总量。根据每只动物的体重，计算AOM的总体积（终工作浓度为1 mg/mL），使剂量达到10 mg/kg，例如，20 g小鼠需200 µL。
    4. 每次使用前，将所需数量的10 mg/mL AOM新分装样品置于冰上解冻。取1 mL AOM分装液，加入9 mL无菌生理盐水稀释，制成1 mg/mL的工作浓度溶液。
    5. 通过腹腔注射方式向小鼠给予AOM。此操作应在生物安全柜内进行，并穿戴适当的个人防护装备，例如双层手套和N95口罩，以确保最佳防护。
      警告：任何剩余的AOM溶液应按照危险化学品废弃物处理要求予以弃置。
    6. 第3天，将AOM处理的动物转移至清洁的笼具中。处理被AOM污染的笼具及其他材料时，应穿戴适当的个人防护装备以确保安全。
      警告：受污染的笼具垫料和任何剩余食物应根据机构批准的危险化学品废物处理程序进行处置。
      注意：AOM 及其代谢产物在给药后 72 小时内会完全排出体外18此时可处理脏的笼具垫料。
    7. 第7天进行肠道菌群均质化处理，以减少笼具间的差异。具体操作为：取每笼25%的垫料，充分混合后重新均匀分配至各笼中。
      注意：在DSS处理当周及之后五天内避免更换笼具。必要时，与设施的动物饲养笼具更换服务协调安排。
    8. 通过在配备合适喷嘴的50 mL锥形管中提供含DSS的饮用水，开始诱导结肠炎。每天检查小鼠，确保其可自由获取DSS水。每隔一天更换一次DSS水。每天记录每只小鼠的体重。
    9. 第14天，将DSS水更换为普通饮用水瓶。继续密切观察动物的疼痛和痛苦情况。
    10. 在第14至19天，每天称量每只小鼠的体重。若小鼠体重减轻超过25%，或达到经批准的动物护理与使用方案中规定的任何人道终点时，实施安乐死。此外，应监测并记录任何直肠出血的情况。
  2. ​第7-28天：第一轮DSS处理
    1. 第7天进行肠道菌群均质化处理，以减少笼具间的差异。具体操作为：取每笼25%的垫料，充分混合后重新分配至各笼中。
      注意：在DSS处理当周及之后五天内，避免更换笼具。必要时，与设施的动物饲养笼具更换服务协调安排。
    2. 通过在配备合适喷嘴的50 mL锥形管中提供含DSS的饮用水，开始结肠炎诱导。每天检查小鼠，确保其可自由获取DSS水。每隔一天更换一次DSS水。每天记录每只小鼠的体重。
    3. 第14天，将DSS水更换为普通饮用水瓶。继续密切观察动物的疼痛和痛苦情况。
    4. 在第14至19天，每天称量每只小鼠的体重。若小鼠体重减轻超过25%，或达到经批准的动物护理与使用方案中规定的任何人道终点时，实施安乐死。此外，应监测并记录任何直肠出血的情况。
  3. 第29-49天：2 nd DSS处理周期
    1. 重复微生物群均质化操作，并继续给予DSS，遵循与步骤中相同的程序 2.2.1-2.2.4可选：在第二次和/或第三次DSS周期后，按前述方法进行结肠镜检查19.
  4. 第50-70天：3rd DSS处理周期
    1. 重复进行微生物群均质化处理，并按照与步骤中相同的程序给予DSS 2.2.1-2.2.4由于小鼠在第三次DSS处理周期后的第三天体重下降最为明显，因此在此期间应密切监测所有动物的体重过度减轻情况或任何直肠出血迹象，并根据需要提供湿润饲料以进行支持性护理。

3. 结肠炎严重程度及结肠炎相关性癌变大体病理学评估

  1. 在第70天，从每只小鼠收集2-3粒新鲜粪便颗粒，检测隐血及炎症标志物（如脂质运载蛋白-220）的存在，以评估结肠炎严重程度。使用适当的试剂或试剂盒（参见材料与设备清单），并按照制造商说明进行检测，具体步骤简述如下。
  2. 为检测粪便样本中炎症标志物脂质运载蛋白-2的水平，将新鲜粪便颗粒放入1.5 mL微量离心管中，加入1 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS），使用涡旋混合器充分溶解，直至形成均匀溶液。在4 °C条件下以10,000 × g离心10分钟。上清液可立即用于脂质运载蛋白-2 ELISA检测，或储存于-80 °C以备后续使用。
  3. 按照试剂盒制造商说明进行小鼠脂质运载蛋白-2 ELISA检测。进行预实验的系列稀释，以确定粪便样本相对于标准品的最佳稀释比例。
    注：与饮用清水的对照组小鼠相比，DSS处理小鼠的脂质运载蛋白-2水平预计至少升高1000倍20。
  4. 采用腹泻评分系统17评估结肠炎严重程度，具体操作见步骤1.8-1.10。
  5. 在第70天，通过CO2窒息或其他经批准的人道方法处死动物。
  6. 用70%乙醇喷洒每只动物的腹部区域，以减少后续操作中的污染风险。
  7. 使用精细外科镊子提起皮肤和腹膜层，用剪刀做一横向切口，暴露腹腔。
  8. 将小肠拉出体外并识别盲肠。用镊子轻轻提起盲肠和结肠，使用剪刀剪开肠系膜及其相关血管，小心分离结肠，注意避免刺破或切断结肠壁。
  9. 剪断骨盆骨及肛门直肠周围皮肤，以充分暴露远端结肠。应完整保留远端结肠进行解剖，因为大多数肿瘤通常发生于该区域。
  10. 将分离出的结肠置于洁净的滤纸条上，轻轻拉直。
  11. 用尺子测量结肠长度，并拍照记录，照片中需包含尺子以提供比例参照。
  12. 清除结肠外表面的派尔集合淋巴结，注意避免刺破组织。
  13. 用冷的无菌PBS冲洗结肠。
  14. 使用石蜡膜将一个200 µL移液器吸头（无滤芯）固定在3 mL注射器上。用此装置吸取无菌PBS，将吸头插入结肠腔内，轻柔冲洗结肠内容物2-3次，确保完全清除粪便颗粒。
  15. 将结肠轻轻拉伸，平铺于一条洁净且预先润湿的滤纸条上。沿纵轴切开结肠，并将其展平置于滤纸上。
  16. 识别较大的肿瘤，这些肿瘤通常表现为从结肠壁突出的明显肿胀，外观呈炎症性红色。
  17. 对于较小的肿瘤，识别时需格外谨慎。可使用无菌细菌接种环轻轻探查结肠表面是否存在不规则突起或肿块，并确认所发现的突起并非位于结肠壁外侧的淋巴结或血管残留物。
  18. 使用数显卡尺测量每个肿瘤的宽度和长度。
  19. 在预先印制的结肠图上记录肿瘤数量、每个肿瘤的大小及其位置。

4. 组织学评估

  1. 使用两把尖头镊子夹住远端结肠的两侧末端。按照其他文献所述的方法21，将结肠从远端向近端卷成瑞士卷状。确保远端位于卷的中心，近端形成最外层。
  2. 用27½号针固定每个瑞士卷状结肠。
  3. 将每个固定的瑞士卷状结肠放入相应标记的组织包埋盒中。
  4. 将含有瑞士卷状结肠的组织包埋盒浸入含4%多聚甲醛（PFA）的无菌PBS中。让组织在固定液中固定24小时。
  5. 24小时后，将组织转移至70%乙醇中。组织可在4 °C条件下于70%乙醇中保存长达三个月。
  6. 瑞士卷可用于多种组织病理学检查，包括常规苏木精-伊红（H&E）染色、免疫组织化学和免疫荧光。

5. 从肿瘤及周围结肠组织中收获组织以提取蛋白质和RNA

  1. 在冰上操作，并使用预冷的离心管和试剂，以保持生物材料的完整性。
  2. 完成肿瘤评估后，将肿瘤组织解剖并收集到预冷且预先标记的离心管中，加入适量缓冲液（见下文），并置于冰上。根据实验设计，可将同一动物的所有肿瘤组织合并，或分别处理。如需要，同样收集约 1 cm 长的周围非肿瘤结肠组织。
  3. 蛋白质提取
    1. 向每根组织匀浆管中加入 0.5 mL 800 µm 玻璃珠和 400 µL 裂解缓冲液（含 1% NP-40、150 mM NaCl、20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 以及 1% 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物），然后将结肠/肿瘤组织转移至各管中。
    2. 使用基于珠子的组织匀浆仪以 6 M/S 速度匀浆 30 秒，重复两次以实现完全匀浆。
      注意：每次匀浆循环之间将离心管置于冰上，以防止机械匀浆过程中样品过热。
    3. 匀浆完成后，吸取 150 µL 裂解液（上清液），转移至洁净的 1.5 mL 微量离心管中。
    4. 在 4 °C 条件下以 10,000 g 离心，使不溶性物质沉淀。如需要，将上清液转移至新的洁净离心管中。
    5. 采用二辛可宁酸（BCA）法或其他适当方法测定总蛋白浓度。
    6. 如需要，用相同的裂解缓冲液将各样品的总蛋白浓度调整至 4 mg/mL。
    7. 立即使用蛋白裂解液进行后续实验（如免疫印迹或细胞因子分析），或于 −80 °C 保存以备后续使用。
  4. RNA 纯化：
    1. 解剖后，将结肠/肿瘤组织放入 1.5 mL 微量离心管中，并浸入 200 µL 适当的 RNA 保存试剂中。
      注意：可暂停步骤：新鲜的结肠/肿瘤组织可用液氮速冻后于 −80 °C 保存，以备后续处理。
    2. 将结肠/肿瘤组织在冰上解冻。
    3. 将结肠/肿瘤组织转移至含有 500 µL 适用于 RNA 提取的裂解缓冲液和 200 µL 玻璃珠的组织匀浆管中。
    4. 使用基于珠子的组织匀浆仪以 6 M/S 速度匀浆 30 秒，共进行三次，每次间隔两分钟。
      注意：每次匀浆循环之间将离心管转移至冰上，以防止机械匀浆过程中因过热导致 RNA 降解。
    5. 取 300 µL 裂解液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。
    6. 根据需要采用适当的 RNA 纯化步骤提取总 RNA。根据后续实验要求，测定 RNA 浓度、纯度及质量/完整性。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们针对实验条件进行了DSS剂量优化。DSS给药剂量需根据每个动物设施、小鼠品系、研究设计及DSS批次重新校准。本研究中，C57BL/6J小鼠饲养于屏障环境动物房的通风笼具中， 随意摄取 标准辐照18%蛋白质啮齿类动物饲料。无论雄性还是雌性小鼠，从饮用DSS水第5天开始出现体重下降，在停用DSS水后第3天达到最低体重图1A, C）。在体重下降最显著的一天，雄性小鼠的体重减少了约15%，而雌性小鼠的体重减少了约20%（图1B，D）。根据这些结果，我们确定在本实验条件下，雌性小鼠的最适剂量为3.0%，雄性小鼠为3.25%。AOM/DSS的处理方案如下所示： 图2A，每次DSS处理周期开始时均进行微生物组均质化，直至实验结束，以减少笼养效应和个体间变异。整个实验期间动物体重减轻与恢复的典型动态变化如图所示 图2B动物在停止DSS给药后两周内体重可完全恢复至原始水平。经过良好校准的DSS结肠炎模型表现为粪便松软但仍成形（粪便性状评分1-2分），粪便中偶可检测到隐血，提示存在亚临床出血，少数情况下可见粪便中带血（便血评分1-2分）。17为进一步评估结肠炎的严重程度，收集粪便样本以分析炎症标志物脂质运载蛋白-2（lipocalin-2）的水平。在整个实验过程中，饮用普通饮用水的小鼠未检测到隐血，而DSS处理的小鼠则呈阳性。图 2C）。一致地，与仅接受AOM/水处理的对照组小鼠相比，AOM/DSS处理小鼠体内的脂质运载蛋白-2（lipocalin-2）水平升高约1,000倍（图 2D).

在实验终点，我们解剖结肠并使用肿瘤记录图统计肿瘤数量（图3A）。与仅接受AOM/水处理的对照组相比，DSS性结肠炎导致结肠长度显著缩短（图3B）。此外，AOM/DSS处理的小鼠会形成可见的结肠肿瘤，其中大多数位于远端结肠（图3C）。对H&E染色的结肠组织切片进行组织学检查，发现AOM/DSS小鼠出现明显的上皮细胞侵蚀、免疫细胞浸润和溃疡（图4A）。结肠组织病理学严重程度可通过已建立的DSS诱导小鼠结肠炎相关癌（CAC）评分系统进行量化，该系统基于四个参数（图4B）：免疫细胞浸润和水肿（0–3分）、溃疡（0–3分）、结肠上皮形态（0–4分）以及新生物（0–4分）22,23,24。将该评估方法应用于图4A中的组织学示例，其结果如图4C所示。通过Ki67染色的免疫组织化学分析评估结肠上皮细胞增殖情况，结果表明DSS处理可促进结肠上皮细胞的增殖。此外，结肠组织切片还可用于多种标志物的免疫荧光染色，例如血管生成标志物CD31（图4D、E）。

我们进一步评估了微生物群均质化对各实验终点的影响，包括结肠炎症程度、体重减轻以及每只动物的累积肿瘤负荷。一组小鼠在第0天通过混合并重新分配污染的垫料以实现微生物群均质化，而对照组小鼠所在笼具则未进行该操作。两组动物均饮用含2.5% DSS的水，持续7天。尽管在第8天时，每笼粪便中炎症标志物脂质运载蛋白-2（lipocalin-2）的平均水平在两组之间无显著差异（Welch's t-检验），但我们观察到经过微生物群均质化处理的笼具中，数据点之间的变异性显著降低（图5A，采用Welch's F检验比较方差，p<0.0001）。一致地，在第8天时，所有动物相对于第0天基线均表现出相似程度的体重下降。然而，微生物群均质化组小鼠的体重减轻变异性低于对照组（图5B）。此外，在为期10周的结肠癌变（CAC）诱导方案（图2A）中，每次DSS处理周期前进行（微生物群均质化组）或不进行（对照组）笼具垫料混合，结果显示，与对照组相比，微生物群均质化组每只小鼠的累积肿瘤负荷更为一致，而对照组的个体间差异显著更大（图5C）。总体而言，这些数据提供了有力证据，表明微生物群均质化可显著提高AOM/DSS模型的稳健性和可重复性。

小鼠DSS诱导的体重减轻；比较图与图表分析；雄性和雌性数据探索。
图1。雄性和雌性小鼠中DSS剂量滴定。（A-D）与第0天相比，14周龄雄性（A, B）和雌性（C, D）C57BL/6J野生型小鼠在饮用含指定浓度DSS（雄性：1%、1.5%、2%、2.5%、3%；雌性：2%、3%、4%）的水后体重变化百分比。（A, C）动物接受DSS处理7天，并持续监测至第12天的体重减轻情况。B和D分别显示雄性小鼠在DSS处理第8天（B）和雌性小鼠在第9天（D）的体重减轻情况。数据以平均值±标准误表示；n=3（A & B），n=4（C & D）。请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠AOM DSS处理时间线、体重减轻曲线、脂钙素-2水平及粪便隐血试验结果。
图2．AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结直肠癌（CAC）时间线及监测指标。（A）AOM/DSS诱导结肠炎相关性结直肠癌（CAC）的实验时间线。（B）经AOM/DSS处理（红色）或对照组（仅AOM，无DSS，黑色）的雌性C57BL/6J野生型小鼠在实验期间相对于第0天的体重变化。所有动物均接受一次AOM（10 mg/kg）注射，随后随机分为两组：一组接受三个周期的3% DSS处理（红色），另一组饮用正常饮水（对照组，黑色），实验共持续70天。数据以平均值±标准误（SEM）表示，n=2 和 11。（C）对照组（仅AOM）或DSS处理组（AOM加1.5% DSS）雌性小鼠的粪便隐血试验结果。（D）第70天时，6只对照组（仅AOM，黑色）和35只处理组（AOM加1.5% DSS，红色）雌性小鼠的粪便脂钙素-2水平。数据以平均值±SEM表示。请点击此处查看该图的放大版本。

结肠肿瘤分析，包含肿瘤记录图、标本图像、实验结果对比示意图。
图 3．结肠的大体评估。（A）肿瘤记录图示例。（B）第70天时对照组（仅使用AOM）或DSS处理组（AOM联合1.5% DSS）雌性小鼠的代表性结肠图像。结肠长度缩短表明DSS处理组动物炎症更严重。标尺－5 mm；****，p=0.002，Mann-Whitney秩和检验；n=12 和 30。（C）第70天时经AOM和3% DSS处理的雌性小鼠结肠肿瘤大体病理图像（肿瘤以圆圈标出，并用黑色三角标记）。标尺－5 mm。插图－肿瘤所在远端结肠区域的放大视图；标尺－1 mm）。请点击此处查看该图的放大版本。

AOM/DSS 结肠组织学 H&E 结果；指标表；免疫染色分析；显微镜图像。
图 4．结肠炎相关性结肠癌（CAC）组织学评估。（A）AOM/DSS 处理组与对照组（仅 AOM）小鼠在第 70 天的瑞士卷结肠 H&E 染色代表性切片，右侧显示 3 只动物远端区域的放大图像。对照组结肠显示完整的结肠隐窝结构。AOM/DSS 处理组小鼠的结肠表现为黏膜下层增厚（箭头）、免疫细胞浸润（箭头）、隐窝结构破坏或缺失（星号）、上皮层糜烂、上皮增生或异型增生上皮（圆圈），并可见腺瘤和腺癌形成（虚线圈出）。标尺 — 500 µm。（B）用于评估 CAC 表型严重程度的组织病理学评分系统。（C）来自 A 图中仅 AOM 或 AOM/DSS 处理小鼠的结肠组织学评分示例。（D）AOM 处理动物经 1 或 3 个 DSS 周期后，瑞士卷结肠中 Ki67 增殖标志物的代表性免疫组化染色。增殖的 Ki67 阳性细胞（棕色）定位于结肠隐窝底部，但随着 CAC 的启动和更严重的病理进展，细胞向上扩散并侵入隐窝内部。标尺 — 100 µm。（E）基于 CD31 内皮标志物（红色）进行免疫荧光染色以评估血管化，并用 DAPI 复染以显示细胞核（蓝色），样本来自 AOM/DSS 处理小鼠的结肠切片。标尺 — 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

显示微生物群均一化对脂质运载蛋白-2、体重和肿瘤负荷影响的小提琴图。
图 5．微生物群均一化降低结肠炎症和结肠炎相关癌症（CAC）肿瘤负荷的变异性。（A）第8天接受2.5% DSS处理的小鼠粪便中脂质运载蛋白-2的平均水平。采用Welch's t-检验比较两组间粪便脂质运载蛋白-2平均水平（p=0.137，n=6 和 12 个笼子）。此外，对两组方差进行F检验，得到p值为0.0001，表明两组间的方差存在显著差异。（B）AOM/DSS处理动物在第8天饮用DSS水后的平均体重下降情况。两组间的平均体重下降无显著差异（Welch's t-检验，p=0.194，n=6 和 12），但组内方差显著不同（F检验，p=0.027）。（C）AOM/DSS处理10周后每只小鼠的肿瘤负荷。采用Welch's t-检验评估各组间平均肿瘤负荷的差异（p=0.211，n=8 和 18），并使用F检验分析方差间的差异（p=0.013）。（A–C）蓝色小提琴图表示接受微生物群均一化处理的组，绿色小提琴图代表对照组（未进行微生物群均一化），ns — 无显著性差异。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

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AOM/DSS 方案最早由 Okayasu 等人于 1996 年提出25，此后被公认为是一种优秀的结肠癌建模方法，能够真实模拟从正常组织到腺瘤样改变，最终发展为癌变的全过程。Suzuki 等人在 2006 年的研究26中证实了该模型在结肠炎症背景下的高度模拟性。后续研究进一步评估了 AOM 和 AOM/DSS 在不同小鼠品系中的效应，以及不同处理周期对肿瘤表型和外显率的影响26,27,28。2018 年，Christopher Williams 及其团队发表了一项更新的实验方案29，为该方法学的发展奠定了重要基础。近年来的进展进一步证明，通过整合肠道免疫浸润细胞的分离技术以及流式细胞术进行免疫表型分析，AOM/DSS 模型在黏膜免疫研究中具有重要应用价值30。

AOM/DSS 方案的主要优势之一在于其几乎可轻松适用于任何品系的小鼠，从而促进了对不同遗传背景影响的研究。因此，Suzuki 等人通过结肠腺瘤外显率作为检测指标，比较了四种不同小鼠品系对 AOM/DSS 诱导结肠癌变的易感性，结果如下：BALB/c > C57BL/6N > DBA/2N = C3H/HeN26。其他研究发现，与 C57BL/6J 和 129/SvJ 品系相比，FVB/N 小鼠在重复 AOM 处理后更易发生结肠肿瘤27。值得注意的是，在为期 10 周的 AOM/DSS 结肠炎相关癌（CAC）诱导方案中，FVB/N 小鼠几乎达到 100% 外显率地发展出分化良好的结肠腺癌31。这些发现共同表明，不同小鼠品系对 AOM/DSS 处理的易感性可能并不相同，这会导致肿瘤发生存在差异，并进一步凸显了建立统一指南以实现跨小鼠品系、饲养设施及其他变量间 AOM/DSS 方案标准化和可重复性的必要性。其中，肠道微生物组的显著变异性阻碍了聚焦于炎症和肿瘤外显率研究的可重复性9,10。具体而言，肠道微生物组的组成，包括 Duncaniella muricolitica 和 Alistipes okayasuensis 物种，可能对 DSS 结肠炎的严重程度产生重大影响13。另一项研究通过证明 NLRP3 缺陷型小鼠表现出加重的结肠炎表型——其特征是细菌门 Bacteroidetes（特别是 Prevotellaceae 科）和 TM7 的丰度增加——突显了微生物群组成在 CAC 诱导中的重要性10。

尽管该方法广受欢迎，但现有的AOM/DSS方案尚未解决实验组内动物间存在显著变异性的关键问题32。为应对这一挑战，我们提出了一系列优化和标准化实验方案的建议，包括实施DSS剂量滴定（考虑动物性别的影响）以及微生物群均质化。我们的方法旨在降低变异性，提高AOM/DSS模型在不同动物品系、实验设计和终点指标中的可重复性。虽然我们无法针对样本量提供具体建议，但实验重复次数应根据具体的研究设计以及各实验预期的效应量来确定。通过上述优化所实现的组内变异性的降低，意味着在每种条件下需要更少的动物即可达到相同的统计检验效能，从而检测出这些差异。我们预计，这些改进将进一步促进实验动物的伦理使用、科研经费的负责任管理，并减少人力投入，提高研究效率。

AOM/DSS 模型在研究人类结肠炎相关性结直肠癌方面具有重要的转化价值。鉴于人类结直肠癌（CRC）病因复杂，建模存在诸多挑战，需要强调的是，尽管 AOM/DSS 模型可能为散发性 CRC 的发病机制提供一定见解，但它最适用于炎症相关性恶性肿瘤的研究。此外，AOM/DSS 诱导的肿瘤转移发生率较低33,34，因此不适合用于转移性扩散的研究。尽管存在这些局限性，AOM/DSS 模型仍具有高度外显率、可靠性高、能呈现与人类疾病相关的组织病理学特征，并能准确模拟从炎症到异型增生再到腺癌的疾病进展过程，同时具备成本效益。在本方案中，我们基于现有工作流程8,35，提出了生成可重复结果并最大限度减少混杂因素的建议。

通过剂量-反应预实验确定最佳DSS剂量，并将动物性别作为生物学变量加以考虑16,36,37，是建立稳定可靠的AOM/DSS实验方案的第一步（图1）。我们发现，雌性小鼠经3% DSS处理7天后体重下降更为显著（约20%），高于雄性小鼠（约15%）（图1B、D）。然而，雄性小鼠对DSS的敏感性可能高于、低于或等同于雌性小鼠。这种差异可能源于不同小鼠品系以及各动物设施间肠道微生物组组成的差异，因此需要根据每组具体实验条件重新调整DSS浓度。最佳DSS浓度应在最大化结肠炎症和肿瘤诱导效果与不超出可耐受毒性之间取得平衡。根据我们的经验，当DSS剂量导致第一个处理周期后体重下降约20%时，最有可能实现这一平衡。动物在第二个处理周期中体重下降通常较少，但在第三个DSS处理周期中体重下降更为明显，这可能与结肠内肿瘤形成有关。因此，可将体重下降25%作为机构动物使用规程中的仁道终点。此外，经过良好控制的DSS结肠炎模型表现为粪便松软但仍成形，而非腹泻，隐血试验偶呈阳性，粪便中可见血迹的病例较少，且在停止DSS给药后，动物通常可在两周内完全恢复。

DSS 是一种分子量介于 36,000 至 50,000 Da 的聚合物。由于不同批次 DSS 的生产存在批间差异，因此对每一批新到的 DSS 产品都必须进行剂量重新校准实验。为保持实验一致性，建议估算整个研究所需的 DSS 总用量，并从同一批次中采购。此外，本方案还描述了在结肠炎相关性结直肠癌（CAC）诱导过程中，对实验小鼠群体的肠道微生物群组成进行标准化的步骤，以减轻潜在的笼养效应，降低实验变异性。作为进一步减少笼养效应的预防措施，建议在条件允许的情况下将不同实验组的动物同笼饲养。根据具体的实验目标和动物伦理使用政策，这些考虑因素应在预实验中予以体现。潮湿笼具中因饮水瓶泄漏导致的垫料更换也可能引发微生物群漂移。在给予 DSS 期间及其后五天内，应尽量避免更换笼具。使用 50 mL 离心管进行 DSS 水溶液给药可降低泄漏风险，并减少 DSS 浪费。这些后勤方面的考虑可能需要研究人员与负责笼具更换及动物饲养的技术人员密切协作。

本方案中，我们还提供了组织和细胞收获以及数据收集的基本操作流程。这包括检测隐血的存在（图2C）和肿瘤定位（图3A）。AOM/DSS模型适用于免疫功能完整的动物，由于其免疫系统完全健全，因此相较于异种移植方法，该模型是研究肿瘤免疫微环境的理想体系38,39。值得注意的是，该模型可方便地对免疫系统或基质成分进行实验性干预，无论是通过细胞类型特异性的基因敲入/敲除或报告基因盒的遗传性Cre-Lox系统，还是通过特定细胞群体的移植或清除。例如，我们先前通过将AOM/DSS模型与骨髓移植相结合，研究了造血系统中的突变如何调控结肠炎相关结直肠癌（CAC）的严重程度和肿瘤负荷40。为支持此类研究，已有优秀的已发表方法可用于分离具有活性的肿瘤浸润性白细胞，适用于后续分析，如免疫表型分析、功能检测以及单细胞多组学分析41。最后，由于该模型具有高外显率和稳定的潜伏期，因此适用于以总肿瘤负荷为主要评估指标的临床前治疗研究。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 R01 DK121831（OAG）和 R01 AI067846（DA）。OAG 还获得了 Edward P Evans 基金会和 Oxnard 家族基金会的支持。DA 获得了 Merit Society 奖项的支持。UFHCC 是美国国家癌症研究所（NCI）指定的癌症中心（P30 CA247796）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
偶氮甲烷粉末Sigma-AldrichCAS 25843-45-2, Cat# A4586用于诱导结肠肿瘤的致癌物
台式微量离心机NA NA用于样品制备 
C57BL/6J 小鼠Jackson Laboratory000664品系和年龄应根据具体研究需求选择
50 mL 锥形管Fisher14955239用于给予 DSS 水溶液
葡聚糖硫酸钠盐，分子量约 40,000Cayman Chemical 23250用于诱导结肠炎症 
70% 乙醇Fisher 43655223用于消毒工作台面和解剖工具
研磨玻璃珠，800 µm VWR12621-148用于促进结肠/肿瘤组织的匀浆化
HemoCue America Beckman Coulter Hemoccult ICT 免疫化学粪便隐血检测试剂盒HemoCue America 395065A目录号 23280010用于检测粪便中的隐血
胰岛素注射器 27G×5/8 1CC BD 3294-12用于 AOM 注射
Lixit 阻断器NANA用于阻断小鼠笼具的自动供水系统（如存在，由动物设施提供，无菌） 
磁力搅拌子和搅拌板 NANA用于溶解 DSS 
微量管珠磨匀浆仪，BeadBlaster 24 BenchmarkD2400用于匀浆化结肠/肿瘤组织
小鼠脂质运载蛋白-2/NGAL DuoSet ELISA 试剂盒R&D Systems目录号 DY1857用于检测粪便样本中的脂质运载蛋白-2
NP-40 溶液，10%Thermo Fisher Scientific85124用于裂解肿瘤/结肠组织
Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒Thermo Fisher ScientificA65453用于测定总组织裂解液中的蛋白浓度，或其他合适的定量方法
蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液 FisherPI78440用于制备细胞因子/蛋白分析样品 
RLTplus 缓冲液Qiagen1053393用于 RNA 提取，或其他合适的 RNA 分离方法
RNA laterThermo Fisher ScientificAM7021用于 RNA 提取前组织样本的保存
RNeasy 微量提取试剂盒 QIAGEN74004用于 RNA 提取，或其他合适的 RNA 分离与纯化方法
啮齿类动物饮水瓶喷嘴（30 mm）Vision型号 E用于给予水或 DSS 溶液
无菌剪刀和镊子NANA用于组织解剖
注射器针头，27G × 1/2 英寸（短）BD 305109用于结肠瑞士卷组织固定 
鲁尔锁式注射器，3 mLBD 309657用于解剖和分期前冲洗结肠
TapeStationAgilent用于 RNA 浓度及质量/完整性评估
Teklad 2918Evigo BioproductsT.2918M.15标准啮齿类动物饲料，含 18% 蛋白质，经辐照处理
组织包埋盒VWR#87002-472用于保存样本以进行包埋
上皿式实验室天平，量程 0–220 gNANA用于称量动物体重
Whatman 印迹纸VWR InternationalCat# 28298-020用于解剖后结肠的大体病理学分期及肿瘤计数

参考文献

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