基于胶水的组织微阵列构建用于肿瘤与疾病研究

摘要

本方案介绍了一种基于胶水的组织微阵列构建的低成本制备与高效验证方法，为肿瘤和疾病研究提供了便捷的病理诊断平台。

摘要

组织芯片技术（TMA）是一种高通量平台，可同时检测和分析多个组织样本，有助于高效开展肿瘤和疾病生物标志物研究。然而，传统的TMA构建方法常面临操作复杂、耗时较长以及准确性不稳定等局限性。为此，研究人员开发了一种基于胶水的TMA构建方法，以克服上述挑战，该方法可改善组织芯的固定效果并增强结构稳定性。系统性验证包括组织学评估（HE染色）、目标蛋白的免疫组化分析以及荧光原位杂交（FISH）检测。结果表明，基于胶水的方法能良好维持切片完整性，提高信噪比，并确保批次间的一致性和可重复性。尽管该方法目前仅限于手动操作，但为中等通量的TMA制备提供了一种可靠且经济有效的选择。该方法特别适用于重视实验灵活性和样本多样性而非大规模自动化的研究环境，从而拓展了TMA在学术研究和诊断场景中的应用价值。

引言

组织微阵列（TMA）是一种用于分析组织样本的高通量技术^1,2,3。该技术通过获取多个供体组织芯样，将其从供体石蜡块转移至受体组织块中，从而在理论上相同的实验条件下，对多个样本进行同步的差异性和比较性分子分析^2,4。构建组织微阵列（TMA）的经典方法是使用打孔工具从供体组织样本中提取组织芯，并将其依次排列植入受体石蜡块中。该方法适用于深度相近的供体石蜡块，能够在单一切片上高效地分析多个样本，显著提高研究效率和数据的一致性^5,6,7。然而，该方法仍存在一定的局限性，例如在包埋过程中对组织芯的处理不够完善，可能导致后续分析中样本染色不一致⁸。

组织微阵列构建的第二种方法是胶带法^9,10。该方法通过在倒置的直立组织芯周围包埋成块，从而逆转了构建过程；完成时，无论组织芯长度如何，其表面均与组织微阵列的顶部齐平^11,12。然而，该方法需要确保组织芯的准确定位以及胶带的有效性，且与传统技术相比，可处理的样本数量受限。

本研究提出了一种用于构建组织芯片（TMA）的创新性胶粘方法，旨在解决传统技术中存在的组织芯稳定性不足和操作复杂等问题¹³。该方法利用胶粘剂将多个组织芯精确固定在一起，具有操作简便、样本牢固性强的优点。与传统的切片法或胶带法相比，胶粘法可提高组织芯的保留率并降低使用成本。该方法适用于中等样本量的临床研究，尤其适合需要灵活调整实验方案的研究设计。然而需要注意的是，该方法的处理通量无法满足超高通量的需求⁹。同时，在实际应用过程中，必须建立一套完整的标准化操作规范和质量控制体系。操作人员需接受系统培训并通过专业考核，以确保技术操作的标准化和结果的可重复性。综合分析表明，该技术在操作灵活性、成本效益和技术可靠性之间实现了良好平衡，特别适用于资源有限但仍需保证质量控制的研究场景。

方案

所有供体组织块均来自南京医科大学附属淮安市第一人民医院于2016年至2018年间收集的存档病理标本。样本在使用前已去标识化，并按照批准的方案进行处理（南京医科大学附属淮安市第一人民医院伦理委员会，KY-2024-250-01）。

1. 供体组织的评估与标记

1. 选择厚度 ≥5 mm、面积 ≥15 mm × 15 mm 的组织块。确保边缘保留 2 mm 的安全距离，并排除存在坏死、出血或钙化的区域，以维持组织完整性。
2. 目标区域的识别与标记
   1. 使用光学显微镜观察苏木精-伊红（H&E）染色切片。先通过低倍镜扫描定位目标区域，再转换至高倍镜确认细胞形态学特征，并在玻片上标记目标区域的边界。
   2. 将所选区域的坐标映射至石蜡包埋块表面，完成标记转换。

2. 组织芯提取

1. 穿刺准备与样本预处理
   1. 选择直径为 2 mm 的手持式打孔器，并确认其切割边缘光滑且操作顺畅。
   2. 将供体石蜡块置于 4 °C 的低温平台上冷却 15 分钟。
2. 将针头垂直对准标记点，施加稳定的旋转压力，直至达到限定深度。操作过程中避免倾斜或震动⁷（图 1A）。
3. 缓慢逆时针旋转针头（≤2 转/秒）将其拔出。小心将组织芯从针头中推出，并转移至预冷的 96 孔板的单个孔中。记录每个孔中组织芯的位置（图 1B）。
   注意：若组织芯底部不平整，可用刀片修平。修整后需重新检查其完整性。
4. 在登记表中预先记录所有供体编号及其对应的 ELISA 板孔位（A1–H12）。操作过程中应反复核对，确保供体编号与孔位严格对应。
5. 立即检查组织芯的完整性。丢弃出现断裂、弯曲或直径偏差 >0.1 mm 的组织芯。
   注意：确保组织芯长度一致（变异系数 CV ≤5%），并避免表面划痕或压缩伪影。

3. 组织芯固定

1. 使用防水记号笔直接在模具表面绘制网格，确保线条清晰且间距均匀。
   1. 使用有效底面积为 3.0 cm × 2.5 cm 的标准模具，每侧预留 1.5 mm 的空白边界区域。
   2. 使用 0.5 mm 细尖防水记号笔，在水平和垂直方向上分别绘制九条等间距的平行线，形成一个 9 × 9 的定位网格（共 81 个交点）。
      注意：开始前，用浸有二甲苯的棉签清洁模具内部，以去除残留的石蜡，防止脱层。绘制过程中，使用钢尺确保线条粗细均匀，并使交点清晰可辨。
2. 用移液器吸取 5 µL 胶水，轻轻滴加在预先标记好的载玻片中心，形成单个液滴。立即使用精细镊子以 90° 角垂直夹取组织芯，并缓慢将其垂直压入胶滴中（图 1C）。
3. 用镊子将组织芯插入模具上对应网格的交点处，轻轻按压 5 秒，以确保牢固粘附（图 1D）。
4. 若组织芯发生移位，需在胶水凝固前（30 秒内）立即使用精细镊子进行微调并重新定位。对于已凝固且位置不正的组织芯，应予以弃用，以保证制备质量，同时尽可能保留珍贵样本。

4. 匣盒安装与石蜡包埋

1. 将组织包埋盒垂直放置在钢制模具上，确保与核心尖端接触但不施加压力。使用磁性夹具在四个角固定包埋盒，并用熔融石蜡密封接缝处。
2. 以45°角沿锯齿形路径注入熔融石蜡，保持1 mL/s的流速。确保石蜡液面高出核心尖端2 mm（图1E）。
3. 将包埋块迅速置于4 °C冷板上冷却5分钟，以形成坚固的支撑层。随后将包埋块转移至22 °C环境中静置20分钟，以降低内部应力。最后，使用40 °C热风枪轻轻加热表面，使表面平滑并消除收缩痕迹。
4. 轻微加热石蜡使其软化，然后沿包埋盒边缘小心切割以松动包埋块。轻柔提起包埋盒，清除残留石蜡，确保组织芯的完整性（图1F）。

结果

在本研究中，采用胶粘法构建了高质量的组织微阵列。为验证该方法的有效性，进行了一系列实验，包括H&E染色，特定蛋白质的免疫组织化学检测，以及荧光检测 原位 杂交（FISH）分析。构建过程中的一个关键环节是组织芯点应位于预期位置并保持适当间距，这通过肉眼观察进行评估。对TMA蜡块的目视检查显示，各TMA中的组织芯均存在且排列规则。图2A）。H&E染色显示，所有组织芯排列整齐，间距均匀，大小一致，且含有丰富的目标组织（图2B）。免疫组织化学染色结果表明，在组织微阵列中，10 种前列腺癌相关蛋白（ZCCHC24、SMAD9、TARBP1、CDHR4、CRTAC1、DNASE1L3、GPR146、IGSF10、ITIH1 和 CDK1）均呈现强表达，染色强度一致，背景干扰极低。图3）。此外，FISH分析显示探针信号清晰，背景干净。在明确的肿瘤区域中，识别至少两个浸润性癌区域，并在至少20个浸润性癌细胞中随机计数GSP HER2（红色）和...

讨论

作为一种构建组织微阵列（TMA）的创新方法，胶粘法因其操作简便和成本低廉而展现出显著优势。与依赖精密仪器的传统针阵法相比^14,15，胶粘法通过胶合实现样本固定，仅需基本工具即可完成，大大降低了技术门槛。与传统的包埋方法相比，胶粘法采用局部点胶固定，显著缩短了组织芯的定位时间，并避免了高温对敏感抗原的破坏^16,17（表2）。

然而，在实际操作过程中，存在许多复杂且精细的步骤。这些步骤不仅耗时较长，而且对操作人员的技术水平和经验提出了极高的要求。从供体组织的选取与标记，到组织芯的提取、固定及石蜡包埋，每一步均需精确的操作流程和严格的质量控制^18,19。在组织切片与石蜡包埋过程中常见的技术问题包括组织块芯偏...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乳腺癌HER2检测试剂盒	Anbiping	2502001	乳腺癌HER2检测试剂盒
CDHR4抗体	Abcam	ab166914	CDHR4抗体
CDK1抗体	Abcam	ab265590	CDK1抗体
CRTAC1抗体	Abcam	ab254691	CRTAC1抗体
DNASE1L3抗体	Abcam	ab203669	DNASE1L3抗体
包埋机	P.S.J MEDICAL	BM450A	包埋机
全自动组织脱水机	Leica Biosystems	ASP3005	全自动组织脱水机
玻璃显微镜载玻片	Citotest	250124A1	玻璃显微镜载玻片
胶水	TIZO	200	胶水
GPR146抗体	Abcam	ab117104	GPR146抗体
IGSF10抗体	Abcam	ab197671	IGSF10抗体
ITIH1抗体	Abcam	ab233032	ITIH1抗体
低剖面切片刀片	Thermo Fisher	3052835	低剖面切片刀片
标记笔	Deli	SK109	标记笔
切片机	Leica Biosystems	HistoCore BIOCUT	切片机
石蜡	Solarbio	YA0012	石蜡
SMAD9抗体	Abcam	ab262940	SMAD9抗体
TARBP1抗体	Abcam	ab115896	TARBP1抗体
ZCCHC24抗体	Abcam	ab88756	ZCCHC24抗体