使用电生理平台进行视网膜波的高密度多电极阵列记录

摘要

高密度多电极阵列（HD-MEAs）用于研究自发性视网膜波，这些视网膜波在神经回路发育中起着关键作用。本方案概述了小鼠视网膜组织制备以及在电生理学平台上使用高密度多电极阵列进行电生理记录的步骤。

摘要

自发电视网膜波是发育过程中视网膜网络活动的典型特征，在视觉系统的形成中起着关键作用，影响轴突的精细化、血管通透性以及神经环路的整体成熟。这些电活动波通常在离体（ex vivo）视网膜制备样本中通过多电极阵列（MEAs）进行研究，后者能够对大量视网膜神经节细胞（RGC）的活动进行电生理记录。基于MEA的电生理技术因其操作简便且可快速获取高通量数据，已成为一种强大的研究工具，非常适合在多种实验条件下研究视网膜活动。

在本实验方案中，我们概述了在电生理学平台上使用高密度微电极阵列（HD-MEA）获取电生理数据前制备视网膜组织的关键步骤。该过程首先在生理条件下，从新生动物体内小心分离出完整的视网膜。制备完成后，将视网膜谨慎地安装到HD-MEA芯片上，该芯片包含由26,400个电极组成的阵列，能够同时记录至少1,000个视网膜神经节细胞（RGCs）的胞外电活动。记录可持续数小时。最终，该方法学策略在研究视网膜发育、疾病以及潜在的跨物种比较研究方面具有重要应用价值，有助于推动神经科学和视觉研究的广泛进展。

引言

自发放电波是在视觉发育开始之前，在发育中的视网膜上观察到的周期性同步神经活动爆发。在小鼠中，启动和传播视网膜放电波的神经回路在发育过程中迅速变化，从胚胎期开始，到出生后第14天睁眼时结束¹。随着视网膜回路的发育，视网膜放电波的时空特性发生显著改变^2,3。多项研究支持这些特定的时空特性在视觉系统发育中起指导作用：双眼之间的异步活动指导眼特异性分离⁴，放电波区域的大小指导双眼前脑区域中视网膜拓扑轴突的精细化^5,6，而放电波的传播方向被认为参与指导上丘中的方向选择性回路³。除了对神经回路的影响外，视网膜放电波还负责调控视网膜血管通透性的发育⁷。此外，研究发现II期视网膜放电波可控制视网膜神经节细胞（RGCs）感受野区域的扩展并使其稳定⁸。重要的是，发育过程中异常的视网膜放电波可能是多种神经发育障碍的基础；事实上，在先天性眼球震颤小鼠模型中，视网膜放电波表现出异常³。鉴于其在早期视觉系统发育中的关键作用以及与疾病的相关性，迫切需要能够在任何年龄和任何动物模型中记录视网膜放电波的时空动态  。

研究视网膜波的方法已有多种出现。单细胞电生理学^9,10 和钙成像^{11,12,13,14,15} 均在视网膜波的神经环路及其功能方面取得了开创性发现。本文重点介绍多电极阵列记录技术（MEA），该方法自早期视网膜波研究以来即被采用¹⁶，并作为一项技术持续改进²。MEA能够同时对数百至数千个视网膜神经节细胞（RGCs）的动作电位进行细胞外记录，使研究人员能够追踪波的起始、传播和终止过程，其能力与钙成像相当。由于MEA直接记录RGCs的动作电位，因此可用于研究多种遗传修饰小鼠模型或非模式生物，而无需引入钙指示剂所带来的额外复杂性。组织还可直接在MEA中培养，从而实现极长时间的记录。MEA还具有高度可扩展性，目前的产品可同时支持多达六个活性MEA，有助于快速评估视网膜样本并推动药物发现。MEA最显著的优势或许是其以高采样率同时记录大量细胞的能力，这使得全球各地的实验室能够迅速获得丰富的数据集，但同时也对数据后处理技术提出了较高要求。

本实验方案的主要目标是提供一种详细且可重复的方法，用于制备视网膜组织，并利用单孔高密度微电极阵列（HD-MEA）系统进行离体（ex vivo）自发性视网膜波的电生理记录。该方法可实现高通量、长时间的数据采集，适用于多种发育过程及疾病相关研究。新型基于CMOS的高密度HD-MEA系统可同时支持>1,000个电极位点，相较于传统电生理方法具有多项优势。其高密度电极阵列（共26,400个电极）能够对多达1,012个视网膜神经节细胞（RGCs）进行精确的同步细胞外记录，捕捉精细的空间活动模式。单孔设计确保了记录条件的一致性¹⁷。此外，该系统支持持续数小时的长期记录，可在多种生理和药理条件下研究波动力学特征，且信号质量无明显衰减¹⁸。通过提供标准化操作流程，本研究旨在使神经科学、眼科学和视觉科学领域的更广泛研究人员能够应用HD-MEA技术。该方法代表了视网膜波研究的重要进展，为早期视觉系统发育、疾病机制以及潜在治疗干预的研究开辟了新途径。

方案

本方案概述了从新生小鼠中分离和制备视网膜组织的步骤，用于在Maxwell Biosystems HD-MEA平台上进行视网膜波的 MEA 记录。该操作流程旨在维持生理条件，确保视网膜组织结构完整、无损伤，并为电极提供良好的接触状态。本研究已获得范德堡大学动物护理与使用项目（批准号：M2200056-00）的批准。实验所用小鼠（1至2周龄，雌雄均有）饲养于12小时明/暗循环的动物房中，并给予标准饲料喂养。

1. 视网膜组织的制备

1. 视网膜的分离
   注意：有关本实验方案中使用的材料、设备和试剂的详细信息，请参见材料表（另见图1）。
   1. 准备实验区域
      1. 配制人工脑脊液（aCSF）：125 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH₂PO₄、26 mM NaHCO₃、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、10 mM 葡萄糖，用碳合气（95% O₂/5% CO₂）持续通气至pH为7.4，渗透压为290 ± 10 mOsm），4 °C保存。在解剖前，将aCSF置于冰上并继续通氧10分钟。
         注意：CaCl₂应在溶液用碳合气通气10分钟后最后加入。
      2. 开始对新鲜的冰冻aCSF进行至少10分钟的通氧处理。
      3. 准备解剖器械和显微镜。
   2. 根据机构指南对动物实施安乐死。
   3. 使用弯头弹簧剪摘除眼球-
      1. 由于出生后幼鼠的眼睑在P11-13之前是闭合的（小鼠），需小心打开眼睑，使用显微镊夹住眼睑，用弹簧剪剪除。使用弹簧剪小心取出眼球，避免损伤眼部组织。
      2. 剪断视神经，并将眼球置于充氧的aCSF中。使用移液器轻轻将眼球在培养皿之间转移。
         注意：在后续的解剖过程中，每10分钟需更换一次充氧的aCSF。
   4. 在解剖显微镜下，
      1. 用镊子固定眼球，再用针头在角膜上做一个小切口。
      2. 沿巩膜边缘轻轻撕开，钝性分离角膜。
      3. 移除虹膜和晶状体。若幼年动物中视网膜与晶状体粘连，可用镊子轻轻分离。
         注意：在幼年动物中，视网膜有时会与晶状体粘连。使用一对镊子夹住晶状体轻轻拉出，同时用另一对镊子轻压视网膜外缘以固定视网膜，防止其随晶状体移动而受损 。
   5. 确定视网膜方位。
      1. 利用脉络膜组织识别腹侧（详见Sondereker等¹⁹中关于方位确定的详细方案），并将视网膜腹侧朝向研究者，神经节细胞层（RGC层）朝上放置。
      2. 使用弯头手术刀，在腹侧轴逆时针45°方向做一参考切口。
      3. 使用精细镊子，轻轻将视网膜从视网膜色素上皮层（RPE）和巩膜上分离。
         注意：在幼鼠中，RPE容易从视网膜上剥离；而在成年鼠中，RPE与视网膜粘连更紧密。若在大部分视网膜上的RPE已被去除后，仍通过视神经与视网膜相连，则使用弹簧剪切断该连接，以避免损伤视神经附近的视网膜组织。
   6. 新生鼠视网膜几乎无玻璃体，但成年鼠存在玻璃体（表现为视网膜边缘的棕色丝状结构，且纤维在玻璃体内部相互连接）。使用精细镊子去除位于RGC层上方的玻璃体组织。
      注意：该纤维层有时在移除晶状体时会一并脱落。若未脱落，则必须尽可能彻底清除，否则会影响RGC与电极之间的良好接触。
   7. 使用手术刀在视网膜上做四个减张切口，以帮助视网膜在培养皿中平铺。为便于后续识别和保持方向，可用手术刀修剪腹侧象限的两个角。

2. 将视网膜安装到MEA芯片上

1. 视网膜的安装-
   1. 使用剪去尖端的移液管，将视网膜从培养皿轻柔地转移至MEA芯片上。确保芯片中有足够的aCSF，以覆盖井底。
   2. 使用单根毛刷轻柔地调整视网膜位置，使其位于电极上方，节细胞层（RGC层）朝向电极。
   3. 使用10 µL移液器轻柔地吸除视网膜组织周围的多余aCSF。将芯片倾斜以去除多余的aCSF。
      注意：切勿让移液器尖端接触电极或放大器。随着aCSF被移除，视网膜会逐渐展平。如果视网膜有任何部分折叠在下方，请使用单根毛刷轻柔地插入所需叶片下方将其展开。为防止在展开叶片时视网膜移动，可使用第二根单根毛刷在视网膜中心（即视神经连接处）施加轻柔压力以固定。
   4. 通过将芯片倾斜至45°角，并吸除积聚在倾斜区域的最后残留aCSF，尽可能使井内干燥。
      注意：这将增强视网膜与电极之间的接触。
   5. 使用滤纸轻柔地蘸吸并擦干视网膜边缘。将MEA芯片放入记录室中。
2. 增强电极接触-
   1. 使用可更换的组织固定器插件，轻柔地将视网膜压向电极，以确保最佳接触并提高信噪比。
      注意：一旦组织固定器插件接触到视网膜（接触点处会出现明显的"湿润斑点"），应立即停止继续下压。进一步降低电极固定器可能损伤视网膜组织。应尽快从步骤2.1.4过渡到2.2.1，以尽量缩短视网膜处于无氧合aCSF环境的时间；此步骤至关重要，需尽可能迅速完成。在芯片上展平视网膜时速度必须快，但同时也必须确保大部分来自解剖过程的aCSF已被去除，以便视网膜与电极形成良好接触。若过快进入氧合阶段，可能导致与记录电极接触不良；若过慢，则可能导致视网膜细胞缺氧死亡。我们发现耗时30–60秒可实现良好的电极接触并保持视网膜健康（例如，可观察到典型的视网膜波活动）。
   2. 使用所述灌流系统，以2 mL/min的流速开始向MEA芯片的井内灌注含氧aCSF。
      注意：推荐使用开放式灌流系统，因其电噪声较低，并能为视网膜持续提供新鲜的aCSF。请确保在灌流装置中连接在线加热系统，以将aCSF加热至生理温度条件。
   3. 开启灌流系统的在线加热器，将aCSF加热至32–34 °C。

3. 电生理记录

1. 细胞外记录-
   1. 打开记录系统。
   2. 在采集计算机上，依次双击 Server 图标和 Scope 图标以启动程序。
   3. 在 Scope 界面中点击 Initialize 图标，并输入MEA芯片ID，以开始使用MEA系统进行细胞外记录。
   4. 在 Scope 界面中点击 Offset 图标，以设置偏移量。
   5. 调整增益和滤波器设置以优化信号检测。默认设置为增益512、高通滤波300 Hz；采样率设为20 kHz。
   6. 选择合适的记录配置。可采样的总有效面积为3.85 × 2.1 mm²。软件允许用户自定义电极间距的配置；为遵循本实验方案，请使用默认设置，即将记录电极均匀分布在最大有效区域内，以便尽可能覆盖视网膜组织。此设置下，每个记录电极的间距为87.5 µm。
   7. 让视网膜在记录室中适应60分钟。
   8. 通过进入 Assay 选项卡并点击 Create New Assay 图标，开始对 RGCs 进行自发活动记录。选择 Network 类型的实验，指定合适的文件名，然后点击 OK 保存配置。通过调整 Record time (sec) 参数设定所需的记录时长。启用 Only Spike 选项以专注于尖峰数据，然后点击 Run Assay 图标开始记录。
      注意：对于持续10分钟或更长时间的视网膜波记录，我们建议使用 spikes only 模式，该模式仅保存动作电位的时间戳，利用内置的尖峰检测工具，而不保存每个通道的完整原始电生理轨迹。这是因为跨越1,024个通道的长时间记录（>10分钟）很容易产生TB级别的数据文件，技术上难以分析，并显著拖慢研究进度。我们已证实，使用 spikes times only 模式保存的原始数据能够重现视网膜波已知的时空特性：对于II期波，我们观察到大范围波形覆盖大部分视网膜，其发生频率与先前报道一致（见 图2）。需指出的是，若研究项目需要对尖峰波形进行更深入分析，则必须记录完整的原始电生理轨迹。
   9. 定期监控正在进行的记录，确保数据采集按预期进行且系统正常运行。

4. 清理步骤

1. 记录完成后，数据已保存，先关闭管路加热器，然后关闭灌流系统。
2. 小心取出组织支架插件，并取出MEA芯片。用70%乙醇冲洗芯片进行清洁，随后用去离子水（DI水）冲洗。
3. 为防止管路堵塞，用去离子水（DI水）冲洗灌流系统15分钟。

结果

利用高密度微电极阵列进行视网膜波的高通量记录与分析
我们进行了长达1小时的高密度微电极阵列（HD-MEA）记录，以检测自发性视网膜波活动（图2）。神经元活动的点阵图显示了视网膜波的有序模式，其中每个点代表从单个电极检测到的动作电位（图2A，底部）。将所有电极的活动进行叠加后得到一条单一轨迹，便于观察在1小时记录期间视网膜波的时间动态（图2A，顶部）。代表平均神经元活动的热图表明，我们能够对视网膜的大范围区域进行采样（图2B）。我们对HD-MEA记录数据进行了分析，以研究视网膜波的时空特性，包括波的起始位点（图2C）、波间间隔（IWI）（图2D）、波持续时间（

讨论

本文所述方案提供了一种可重复且高通量的视网膜组织制备及HD-MEA记录方法，为研究视网膜神经网络活动提供了可靠的技术手段。相较于传统的电生理和成像技术，HD-MEA技术具有显著优势，尤其体现在高通量数据的获取能力上。HD-MEA能够以毫秒级时间精度实时记录自发性视网膜波动态，从而精确表征波的起始、传播和同步化过程。此外，与膜片钳技术相比，HD-MEA可同时记录数千个视网膜神经节细胞（RGCs）的活动，实现对神经网络整体活动的观测。这种可扩展性，结合其操作简便性和长期记录稳定性，使HD-MEA成为发育研究中不可或缺的工具。本方案经适当调整后，亦可适用于大鼠和灵长类动物视网膜的MEA记录。最后，HD-MEA记录的高通量特性在药物发现领域具有广阔应用前景，其高密度电极阵列可实现对药物诱导的视网膜活动变化的精确监测。

该方案中最关键的步骤之一是视网膜的正确分离与安装。确保视网膜完整且无撕裂或孔洞，对于获得高质量的记录至关重要²⁰。应迅速完成解剖和制备操作，以维持组织的活性。在解剖显微镜下仔细检查视网膜，确保其表面清洁、平滑：视网膜神经节细胞（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3 mL 一次性移液管（末端剪除）	Fisherbarnd	13-711-9CM	协助在培养皿之间转移视网膜。
人工脑脊液（aCSF）			维持视网膜组织的生理条件；由 NaCl、KCl、NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、MgCl2、葡萄糖组成，并用碳合气饱和。
CaCl2	Fisher Chemicals	C79-500	用于配制人工脑脊液（aCSF）
碳合气供应（95% O2，5% CO2）			用于氧合 aCSF 并维持组织活性。
弯刃手术刀（#10）	Integra	4-110	用于精确切割组织。
解剖显微镜（体视显微镜）	Zeiss	Stemi 508	可视化和操作视网膜组织所必需。
葡萄糖	Fisher Chemicals	BP350-1	用于配制人工脑脊液（aCSF）
在线加热器	Multichannel System	TC02	将 aCSF 加热至 32–34°C，以提供最佳条件。
Ismatec 灌流系统	Ismatec	ISM4208	维持含氧 aCSF 的连续流动。
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	用于配制人工脑脊液（aCSF）
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5504-100g	用于配制人工脑脊液（aCSF）
MaxOne 记录单元	Maxwell Biosystems	MX1-BRD	MaxOne 芯片与系统的接口。
MaxOne 系统	Maxwell Biosystems	MX1-SYS	基于微电极阵列（MEA）的电生理记录核心系统。
带三轴微操纵器和可更换插件的 MaxOne 组织固定装置	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	确保视网膜在 MEA 芯片上的精确定位。
MEA 芯片（MX1-S-CHP，MaxWell Biosystems）	Maxwell Biosystems	MX1-S-CHP	用于记录神经元活动的高密度微电极阵列。
MgCl2	Fisher Chemicals	M33-500	用于配制人工脑脊液（aCSF）
NaCl	Fisher Chemicals	S271-1	用于配制人工脑脊液（aCSF）
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500	用于配制人工脑脊液（aCSF）
针头（30 G × ½）	BD Biosciences	305106	用于在角膜上制作切口。
新生动物（P1–P14；小鼠）			用于视网膜研究的模式生物，如小鼠、大鼠或其他动物。
配备 MaxLab Live Scope 软件的 PC	HP	Z4	用于记录数据的采集与分析。
培养皿（35 mm 或 60 mm）	Pyrex	3483E12	用作解剖操作的工作平台。
Roboz 微型 Adson 镊子（RS-5232，4.75” 长，1 × 2 齿，0.5 mm 尖端）	Roboz	RS-5232	用于精细解剖的专用镊子。
Roboz 弹簧剪刀（RS-5671，10 mm 刃口，0.15 mm 尖端宽度，总长 3¾"）	Roboz	RS-5671	用于切割精细组织的精密剪刀。
单毛刷			经改造为单根毛发的小型画笔，用于操作精细组织。
两把尖头镊子	Roboz	RS-5060	用于精细组织操作。
Whatman 滤纸（#1），裁成小片	GE Healthcare	1001-042	用于操作和干燥视网膜组织。