方法文章

使用七氟烷麻醉评估幼年大鼠海马p-CREB和c-fos表达以研究学习与记忆的实验方法 幼年大鼠, 学习与记忆, 七氟烷麻醉, 海马, p-CREB, c-fos

DOI：

10.3791/68591

⸱

2025年9月19日

 ,  , 
1Department of Anesthesiology and SICU, Xinhua Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究探讨了七氟醚如何通过NMDAR/p-CREB/c-fos通路损害幼年大鼠海马神经元中的记忆保持能力，并降低p-CREB和c-fos的表达。结果显示，七氟醚可导致短期记忆障碍，并下调突触可塑性相关标志物的表达，这些效应在3天后可逆，且与给药频率无关。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于神经发育的动态性、方法学限制以及情境障碍，研究脑发育过程中的认知功能障碍面临诸多挑战。本研究通过幼年大鼠海马神经元中记忆以及p-CREB和c-fos表达的变化，基于NMDAR/p-CREB/c-fos信号通路，探讨了一种整合性的方法学策略，用于研究七氟烷所致发育中大脑的认知功能障碍。将64只21日龄SD雄性大鼠（体重<80 g）分为五组：正常对照组（n=8）、60% O2组（n=16）、假训练组（n=8）、单次剂量七氟烷组（n=16）和多次剂量七氟烷组（n=16）。两个七氟烷处理组进一步细分为训练后1天处死（sev1a和sev1b组）和训练后30天处死（sev30a和sev30b组），每亚组n=8；其余各组大鼠均在训练后1小时处死。采用Y迷宫实验评估学习与记忆保持能力。通过免疫组织化学方法检测海马组织中p-CREB和c-fos阳性神经元的数量。与60% O2组（记忆保持率为86.33% ± 17.52%）相比，sev1a和sev1b组大鼠的记忆能力显著下降（sev1a：44.29% ± 11.26%；sev1b：62.42% ± 7.27%；所有P<0.05），而sev1b与sev30b组之间无显著差异（sev30a：84.41% ± 14.15%；sev30b：85.21% ± 11.61%；所有P>0.05）。与60% O2组（c-fos：92.83 ± 7.88；p-CREB：72.22 ± 8.89）相比，sev1a组（c-fos：23.13 ± 3.28；p-CREB：22.88 ± 5.18）和sev30组（c-fos：23.22 ± 3.13；p-CREB：25.58 ± 2.26）海马神经元中p-CREB和c-fos的表达均显著降低（所有P<0.05），而sev30a与sev30b组之间无显著差异（所有P>0.05）。七氟烷对幼年大鼠的记忆维持能力具有短期的负面影响，但该影响不随给药频率增加而加重。七氟烷可降低幼年大鼠海马神经元中p-CREB和c-fos的表达水平。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于神经发育的动态性、方法学限制以及环境障碍，研究脑发育过程中的认知功能障碍面临重大挑战。脑发育涉及快速且非线性的变化，使得在关键时期识别功能障碍变得复杂1,2。在资源有限的环境中，照护者文化水平低、语言多样性以及缺乏获取专业工具（如磁共振成像，MRI）的途径等障碍，阻碍了早期筛查1。个体间脑成熟度的差异使得区分病理性偏离与正常发育过程变得困难2,3。例如，唐氏综合征表现为皮层发育异常，但样本量小且组织学数据稀缺，限制了对其机制的理解4。神经发育障碍（如自闭症谱系障碍ASD、注意缺陷多动障碍ADHD）常与焦虑或抑郁共病，干扰了认知评估的准确性5。某些人群严重的沟通障碍限制了标准化测试的应用6。这些特征导致了多项研究设计上的问题。事实上，大多数研究采用横断面设计，无法建模个体随时间的变化。研究过度依赖西方化、受过教育的人群（"WEIRD"样本）7。唐氏综合征研究受限于死后脑组织样本量小，且缺乏适当的年龄匹配对照4。生态瞬时评估工具难以充分考虑影响日常认知表现的情境变量5。

动物和人类大脑最重要的功能包括学习和记忆，这些功能对人类的发育和生命活动至关重要8。婴儿的大脑处于发育阶段，容易受到药物和麻醉等外界因素的影响9,10。麻醉剂对婴儿记忆功能造成的损害是一个重要的临床研究课题，甚至可能因无法实施麻醉而延误儿科患者的最佳治疗11。与麻醉相关的认知功能障碍（或称术后认知功能障碍，POCD）可能对婴儿产生长期后果12。七氟烷吸入可影响婴儿的记忆功能13,14，但传统麻醉学认为，婴儿脑损伤主要由麻醉期间的脑缺氧引起，尤其是在全身麻醉过程中10。因此，只要脑组织未发生短期或长期缺氧，婴儿中枢神经系统损伤的风险就应降低11。然而，目前对POCD的理解仍不充分。需要手术的婴儿必须接受麻醉，若能更深入地了解相关通路，将有助于设计出可最大限度降低POCD风险的麻醉策略。

一项针对接受非心脏手术的老年患者的研究显示，近25%的患者在术后1周内出现术后认知功能障碍（POCD），3个月后这一比例下降至10%以下，而对照组的POCD发生率分别为3.4%和2.8%15。该研究还表明，大多数POCD病例是可逆的，仅有少数患者出现持续性或永久性POCD15。在中枢神经系统中，谷氨酸是最常见的兴奋性氨基酸16。N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）对长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）的诱导与维持至关重要17。对小鼠的研究表明，兴奋性突触可塑性直接影响脑功能的发育18，其中NMDAR的激活和钙离子内流尤为重要19,20。NMDAR活性增强对突触生长和可塑性的诱导具有重要意义19,20。因此，NMDAR拮抗剂（如七氟烷）对NMDAR的阻断程度越高，学习与记忆能力应越低21。尽管关于七氟烷对成年大脑学习与记忆影响的研究尚未得出明确结论22,23，但七氟烷常用于小儿外科手术的麻醉14。作为一种非竞争性NMDAR拮抗剂，七氟烷可显著影响大脑的学习与记忆功能11,13,14,23,24。然而，除NMDAR外，还有其他通路和蛋白质参与学习与记忆过程，其中磷酸化的cAMP反应元件结合蛋白（p-CREB）和即刻早期基因c-fos在记忆调控中的作用机制正逐渐明确25,26,27，但仍需进一步深入理解，以优化婴幼儿麻醉用药方案。

基于这些理论框架，本研究探讨了一种整合的方法学途径，可用于通过幼年大鼠NMDAR/p-CREB/c-fos信号通路，结合海马神经元中记忆功能以及p-CREB和c-fos表达情况，研究七氟烷对发育中大脑所致的认知功能障碍。研究结果有助于加深我们对全身麻醉后术后认知功能障碍（POCD）及记忆损害的理解。本研究选用21日龄大鼠，因其刚断奶，体重和生理状态高度均一，相当于人类的青春期早期。由于此关键发育阶段神经可塑性增强且更为脆弱，因此该模型可有效模拟手术或麻醉对未成熟大脑引起的认知功能损害28,29。这使其特别适用于研究小儿手术相关的神经认知风险，并探索潜在的干预策略。Y迷宫是评估学习与记忆能力的常用方法30。免疫组织化学技术则常用于研究神经元及其多种神经元蛋白。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究中的所有实验方案均经上海交通大学医学院新华医院伦理委员会审核批准（批准号：XHEC-C-2016-023-2）。

1. 动物实验总体设计与分组

  1. 选取64只21日龄的雄性SD大鼠（体重低于80 g）。
  2. 将大鼠分为五组：正常组（n = 8）、60% O2组（n = 16）、假训练组（n = 8）、单次剂量七氟烷组（n = 16）和多次剂量七氟烷组（n = 16）（见表1）。
  3. 将大鼠饲养在温度为20–24 °C、湿度为50%–60%、光照自然的动物房中。
  4. 提供充足的食物和饮水。
  5. 确保所有实验方案均经伦理委员会审核并批准。
  6. 准备吸入式麻醉舱（见补充图S1，详见第2.1节）。
  7. 正常组
    1. 将大鼠暴露于60%空气环境中2小时（详见第2.2节）。
    2. 暴露后1天进行Y迷宫测试（详见第4节）。
    3. 行为学测试结束后采集组织样本（详见第5节）。
  8. 60% O2组
    1. 将大鼠暴露于60%空气环境中2小时（详见第2.2节）。
    2. 暴露后30天进行Y迷宫测试（详见第4节）。
    3. 行为学测试结束后采集组织样本（详见第5节）。
  9. 假训练组
    1. 将大鼠暴露于60%空气环境中2小时（详见第2.2节）。
    2. 暴露后1天进行Y迷宫测试，但不进行结构化训练（灯光和电击区域位置随机变化），用于控制光刺激和电刺激对学习与记忆的影响（详见第4节）。
    3. 行为学测试结束后采集组织样本（详见第5节）。
  10. 单次剂量七氟烷组（sev1a组）
    1. 将大鼠暴露于60%空气 + 3%七氟烷环境中2小时（详见第2.2节）。
    2. 暴露后1天进行Y迷宫测试（详见第4节）。
    3. 行为学测试结束后采集组织样本（详见第5节）。
  11. 单次剂量七氟烷组（sev30a组）
    1. 将大鼠暴露于60%空气 + 3%七氟烷环境中2小时（详见第2.2节）。
    2. 暴露后30天进行Y迷宫测试（详见第4节）。
    3. 行为学测试结束后采集组织样本（详见第5节）。
  12. 多次剂量七氟烷组（sev1b组）
    1. 连续7天，每天将大鼠暴露于60%空气 + 3%七氟烷环境中2小时（详见第2.2节）。
    2. 暴露结束后1天进行Y迷宫测试（详见第4节）。
    3. 行为学测试结束后采集组织样本（详见第5节）。
  13. 多次剂量七氟烷组（sev30b组）
    1. 连续7天，每天将大鼠暴露于60%空气 + 3%七氟烷环境中2小时（详见第2.2节）。
    2. 暴露结束后30天进行Y迷宫测试（详见第4节）。
    3. 行为学测试结束后采集组织样本（详见第5节）。

2. 七氟烷吸入

  1. 准备腔室（参见补充图 S1）
    1. 将箱体左侧的孔连接至60% O2/40% N2。
    2. 将氧气供应连接至七氟烷蒸发器。
    3. 将箱体右侧的孔连接至麻醉机的气体分析仪。
    4. 将腔室顶部的孔连接至废气排放系统。
    5. 在腔室底部的网状结构下方放置石灰，并添加脱脂棉。
    6. 将整个装置置于通风橱内。
    7. 在腔室下方放置加热垫。
  2. 吸入麻醉
    1. 打开氧气供应和七氟烷蒸发器。
    2. 调节氧气流速至2 L/min。
    3. 当七氟烷浓度达到3.0%时，维持该气流30分钟，以稳定腔室内的气体环境。
    4. 将一只大鼠放置于腔室的脱脂棉一侧。
    5. 根据分组要求保持大鼠在腔室内（参见步骤1.2）。
    6. 监测皮肤颜色、呼吸频率、心率及脉搏血氧饱和度。
    7. 取出大鼠。
    8. 让大鼠自然苏醒。
    9. 将大鼠放回其笼中。

3. 实验试剂与仪器

  1. 试剂准备
    1. 准备250 mL市售七氟烷用于麻醉给药。
    2. 将原装p-CREB抗体按1:350稀释，制备工作液。
    3. 将原装c-fos抗体按1:200稀释，制备工作液。
    4. 组装免疫组织化学染色试剂盒。
    5. 制备4%多聚甲醛。
      1. 在玻璃容器中加入40 g可溶性多聚甲醛（PFA）和500 mL高纯水，持续加热并磁力搅拌至60–65 °C，直至形成乳白色悬浊液。
      2. 逐滴加入1.0 mol/L NaOH，直至溶液变澄清（pH = 7.0）。
      3. 加入约500 mL PBS，在冰浴或冷水浴中充分混匀。
      4. 再次检测pH值，过滤后定容至1000 mL。
      5. 4 °C保存备用。
  2. 设备设置
    1. 将Y型迷宫置于行为学测试区域（见补充图S2）。
    2. 校准配备集成成像系统的显微镜，用于组织学分析。
  3. 安装切片机，并更换新的刀片用于组织切片。
  4. 按照标准组织处理程序设定脱水机程序。
  5. 根据仪器制造商的说明，为染色机配置顺序染色浴。
  6. 安装灌注装置。
    1. 使用两个塑料包装的生理盐水瓶，从底部开口排出盐水，分别装入PBS和4%多聚甲醛固定液。
    2. 将瓶子悬挂，通过输液装置连接，并在输液装置的粗针端连接一个三通旋塞阀。

4. Y迷宫与学习/记忆功能检测

  1. 组装Y迷宫
    1. 设置一个具有三个矩形臂（标记为I、II和III）的Y迷宫，三个臂通过一个三角形连接区相连（见补充图S2）。
    2. 在迷宫底部安装间距为1 cm的电栅。
    3. 在迷宫壁上粘贴细铜条（宽2 cm），以模拟危险区域，并安装刺激信号灯。
  2. 定义危险区域与安全区域
    1. 将区域I、II和III通电至16,000 V/m，以表示危险区域（通电时信号灯亮起）。
    2. 用红灯标记未通电的区域，以表示安全区域。
    3. 将各臂之间的连接区定义为非安全区域，大鼠在此区域可能受到电击。
  3. 训练程序
    1. 实验开始时，将大鼠所在区域视为安全区域。
    2. 2–4分钟后，对原安全区域通电，促使大鼠向新的安全区域移动。
    3. 若大鼠从安全区域进入危险区域，将在电击作用下返回安全区，表现出被动回避反应。
  4. 建立主动回避反应
    1. 经过多次训练后，在不施加电击的情况下打开安全区域的灯光。
    2. 观察大鼠向被照亮的安全区域移动的行为，形成明暗辨别条件反射（主动回避反应）。
  5. 将Y迷宫置于光线昏暗且安静的环境中，以尽量减少外界干扰。
  6. 每天在上午9:00–11:00和下午2:00–4:00之间进行训练。
  7. 实验前让大鼠在迷宫内自由活动5分钟，以帮助其适应迷宫环境。
  8. 调整刺激参数
    1. 在测试过程中调整刺激电压（16,000 V/m），确保大鼠在受到电击后10秒内能够逃离。
    2. 保持安全区域信号灯亮起15秒，然后关闭。
    3. 每次电击实验后间隔45秒，再开始下一轮实验。
  9. 信号灯顺序与正确反应
    1. 设定信号灯点亮顺序为I → II → III → I，循环进行。
    2. 定义正确反应为：大鼠在受到电击后10秒内从起始区域直接逃至被点亮的安全区域。
  10. 若大鼠在连续10次试验中，有8次做出正确逃离反应，则认为其已达到学习标准。
  11. 将任何逃向无灯光臂的行为记录为错误反应。
  12. 多次训练与测试
    1. 进行多次训练与测试，以评估学习与记忆能力。
    2. 在固定次数的试验中记录正确与错误反应的次数。
    3. 改变起始区域以增加任务复杂性。
  13. 在不同时间点（例如训练后24小时或48小时）评估记忆保持情况，以检测大鼠的记忆保持能力。

5. 免疫组织化学

  1. 麻醉大鼠
    1. 训练后1小时，按0.4 mL/100 g剂量经腹腔注射10%水合氯醛以麻醉大鼠。根据当地法规处理水合氯醛溶液。
    2. 行胸廓切开术以充分暴露心脏31。
  2. 用生理溶液灌注麻醉后的大鼠
    1. 将含有PBS的针头插入左心室并朝向主动脉方向，用止血钳固定针头，并立即剪开小鼠右心耳以释放静脉血。
    2. 快速注入PBS，直至流出液变清亮，肝脏和肺部呈现白色。
    3. 随后快速继以缓慢灌注500 mL的10%甲醛溶液，直至动物身体僵硬，完成甲醛固定。
    4. 根据当地法规处理甲醛溶液。
  3. 取出脑组织
    1. 迅速打开颅骨32。
    2. 轻柔地从颅腔中提起脑组织，在基底部切断血管和脊髓，完整取出全脑，避免损伤半球（如补充图S3所示）。
  4. 分离海马体
    1. 解剖双侧海马体。
      1. 在小鼠枕骨大孔处用剪刀切断整个脑组织。
      2. 小心将剪刀斜向插入枕骨大孔，剪断顶骨。
      3. 用止血钳撬开两侧顶骨。
      4. 用剪刀剪断一侧视神经，并探至颅底。
    2. 将海马体置于10%甲醛溶液中固定12小时。
    3. 将标本浸入含梯度蔗糖（10%、20%、30%）的甲醛溶液中。
    4. 于4°C下过夜，直至组织沉降至容器底部。
  5. 包埋并切片
    1. 将标本包埋于石蜡中。根据当地法规处理甲醛溶液。
    2. 将包埋后的标本切成4 µm厚切片。
  6. 脱蜡和水化切片
    1. 将切片浸入50 mL二甲苯中脱蜡，每次15分钟，共3次。
    2. 依次浸入50 mL的100%、90%、70%和50%乙醇中，每次10分钟。
    3. 用50 mL的0.01 mM PBS冲洗3次，每次3分钟。
  7. 抗原修复
    1. 将切片置于50 mL柠檬酸缓冲液（PBS，pH 6.0）中。
    2. 将切片放入不锈钢高压锅中加热至120 °C。将切片置于支架上，完全浸没于缓冲液中。密封高压锅，加热并维持高压3分钟。
    3. 从热源移开高压锅，在室温下自然冷却后再打开锅盖。
    4. 用PBS（pH 7.2）冲洗切片，每次2分钟，重复3次。
    5. 在载玻片上的切片区域滴加约100–200 µL的3% H2O2，室温孵育5–10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。
    6. 用PBS冲洗2分钟，重复3次。
  8. 一抗孵育
    1. 在切片上加入200 µL一抗（用0.01 mol/L PBS按1:150稀释）。
    2. 于4°C孵育过夜。
  9. 二抗孵育
    1. 用PBS冲洗切片，每次3分钟，共3次。
    2. 在载玻片上的切片区域加入约100–200 µL聚合物增强剂，37 °C孵育20分钟。
    3. 用0.1 mol/L PBS冲洗切片，每次2分钟，共3次。
    4. 加入约100–200 µL多聚过氧化物酶-抗小鼠/兔IgG，37 °C孵育20分钟。
    5. 用PBS冲洗切片，每次3分钟，共3次。
  10. 显色
    1. 在载玻片上的切片区域加入约100–200 µL二氨基联苯胺（DAB）溶液（足以覆盖切片）进行显色。
    2. 反应约3分钟。
  11. 复染与封片
    1. 滴加约100–200 µL苏木精溶液进行复染，确保每张载玻片上的切片完全覆盖。
  12. 脱水与封片
    1. 将切片依次浸入50 mL的50%、70%、90%和100%乙醇中脱水，每次10分钟，最后浸入50 mL二甲苯中10分钟。
    2. 按标准程序透明并封片。
  13. 显微镜观察
    1. 计数每组大鼠海马体中p-CREB和c-fos阳性神经元的数量33,34。
    2. 在400倍放大倍数下用显微镜观察切片。
    3. 根据每只动物三个无重叠切片的计数结果，记录每张切片中阳性神经元的平均数量。
      注：所有数据均录入计算机电子表格。所有分析均使用统计软件完成。结果以均值±标准误（SEM）表示，并采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合SNK-q和Dunnett T3事后检验进行分析35。SNK-q检验常用于探索性研究，适用于多个样本均值之间的两两比较，不依赖预设假设，适合对所有组间均值进行全面比较36。Dunnett T3检验通常用于具有预设假设的验证性研究，适用于多个处理组与对照组的比较，或对具有特定专业意义的均值进行比较35,37。当ANOVA检验的P值≤0.05时，进行两两事后检验以确定哪些组之间存在显著差异。双侧P值<0.05被认为具有统计学意义。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究利用该研究所获得的数据作为示例，展示了此方法框架所能生成的结果类型，包括具有代表性的免疫染色图像以及来自不同组别的行为学和分子数据。重点在于呈现该方法所产生的典型或预期结果，而非对其生物学意义进行解释。

各组大鼠学习和记忆测试结果
与60% O2组相比，单次剂量七氟烷组（sev1a）和多次剂量七氟烷组（sev1b）大鼠在测试后1小时处死的记忆表现显著下降（所有P < 0.05），而测试后3天处死的大鼠则未见显著差异（所有P > 0.05）（表2）。

大鼠海马中 c-fos 和 p-CREB 蛋白的表达
正常组大鼠海马神经元中 c-fos 的水平低于其他各组，假手术训练组大鼠海马神经元中 p-CREB 的水平低于其他各组。与 60% O2 组相比，sev1a 和 sev1b 组（即训练后 1 小时处死）、假手术训练组...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究探讨了七氟烷通过NMDAR/p-CREB/c-fos信号通路对幼年大鼠海马神经元中p-CREB和c-fos表达的调节作用及其对记忆的影响。结果表明，七氟烷对幼年大鼠的记忆维持能力具有短期（训练后1小时，而非3天后）的负面影响，且该效应不受给药频率（单次给药或连续7天每日给药共七次）的影响。七氟烷显著降低了幼年大鼠在训练后1小时海马神经元中p-CREB和c-fos的表达水平。

本研究探讨了七氟烷与学习和记忆保持之间的关系，旨在为研究学习和记忆的整合方法提供概念验证。Ca2+可通过NMDA受体（NMDARs）或电压依赖性钙通道进入细胞，并通过多种信号通路触发一系列即早基因（IEGs）的转录，例如c-fos和p-CREB13。这些基因随后被翻译为相应的蛋白质产物，作为转录因子进一步调控靶基因的转录，从而参与突触可塑性过程。CREB是其活性受磷酸化调控的转录因子之一，定位于细胞核，在所有类型的脑细胞中均有表达。丝氨酸133位点（p-CREB）的磷酸化在启动多种下游基因转录过程中起关键介导作用

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

叶江和李国辉设计了本研究。叶江和江蕾收集并分析了数据，起草了手稿。叶江和李国辉对手稿进行了修改。所有作者均审阅并批准了提交的最终稿。 本工作得到了上海市浦江人才计划（项目编号：23PJD057）对李国辉的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
实验动物
Sprague-Dawley (SD) 大鼠Charles River Laboratories (中国北京)N/A21日龄，雄性
标准大鼠饲料Keao Xieli Feed (中国北京)N/A标准实验室动物饮食
化学试剂与试剂
水合氯醛Sinopharm Chemical Reagent (中国上海)80113818终末灌注用麻醉剂
柠檬酸盐缓冲液 (10x)ZSGB-BIO (中国北京)ZLI-9064抗原修复液，pH 6.0
乙醇 (100%)Sinopharm Chemical Reagent (中国上海)100092683组织学脱水剂
苏木精染色液Baso Diagnostics Inc. (中国珠海)BA-4041免疫组化复染剂
过氧化氢 (H2O2)Sinopharm Chemical Reagent (中国上海)100112183% 溶液，用于阻断内源性过氧化物酶
中性树胶Solarbio (中国北京)G8590载玻片封片介质
氮气 (N2)Shanghai Medical Gas Co. (中国上海)N/A高纯度，用于混合气体
氧气 (O2)Shanghai Medical Gas Co. (中国上海)N/A医用级，用于混合气体
石蜡Leica Biosystems (Nussloch, Germany)39601006组织包埋介质
多聚甲醛 (PFA)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)158127组织灌注与固定的固定剂
磷酸盐缓冲液 (PBS)Gibco (Waltham, MA, USA)7001104410x 储存液，pH 7.4
七氟烷AbbVie Inc. (North Chicago, IL, USA)N/A吸入性麻醉剂
钠石灰W. R. Grace and Co. (Columbia, MD, USA)22-01-0010吸入室用 CO2 吸收剂
氢氧化钠 (NaOH)Sinopharm Chemical Reagent (中国上海)10019818用于调节 PFA 溶液的 pH
蔗糖Sangon Biotech (中国上海)A502693用于脑组织的冷冻保护
二甲苯Sinopharm Chemical Reagent (中国上海)10023418组织学透明剂
抗体与试剂盒
c-Fos 抗体Abcam (Cambridge, UK)ab190289兔抗小鼠，一抗
DAB 显色试剂盒ZSGB-BIO (中国北京)ZLI-9018HRP 显色底物
p-CREB (Ser133) 抗体Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)9198兔抗小鼠，一抗
聚合物 HRP 检测试剂盒ZSGB-BIO (中国北京)PV-9000免疫组化二抗及检测系统
设备
麻醉机RWD Life Science (中国深圳)R500用于控制混合气体输送
自动组织处理仪Leica Biosystems (Nussloch, Germany)ASP6025用于自动脱水与透明
冷冻切片机/切片机Leica Biosystems (Nussloch, Germany)CM1950用于冷冻/包埋脑组织切片
显微镜系统Olympus (Tokyo, Japan)BX53用于免疫组化切片成像
灌注泵Longer Precision Pump Co. (中国保定)BT100-2J用于心脏灌注的蠕动泵
七氟烷蒸发器RWD Life Science (中国深圳)R510PS用于精确控制七氟烷浓度
Y迷宫装置Med Associates Inc. (St. Albans, VT, USA)MED-VFC-S-Y带电栅与灯光，用于主动回避实验
软件
GraphPad PrismGraphPad Software (San Diego, CA, USA)版本 9统计分析与数据可视化
ImageJNational Institutes of Health (Bethesda, MD, USA)版本 1.53用于细胞计数的图像分析软件
Microsoft ExcelMicrosoft Corporation (Redmond, WA, USA)Office 365用于数据整理的电子表格软件

参考文献

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