低样本量小鼠原代胆管细胞中染色质状态转换的多组学分析技术

摘要

本论文提供了一种低起始量的ChIP-seq全面实验方案，用于分析少量原代小鼠胆管上皮细胞中的组蛋白修饰，以及通过ATAC-seq评估染色质可及性。

摘要

多囊性肝病（PLD）是一种遗传性疾病，其特征是由胆管上皮细胞衍生的充满液体的囊肿形成，导致疾病进行性发展，并显著降低患者的生活质量。目前对 PLD 的治疗手段尚不充分，凸显了开发新型治疗策略的迫切需求。表观遗传调控在 PLD 进展中的作用，特别是染色质可及性和组蛋白修饰，仍缺乏深入研究。传统的表观遗传分析技术（如 ChIP-seq 和 DNase-seq）需要大量细胞，而从原代胆管上皮细胞中获取足够数量的细胞十分困难。为解决这一问题，我们优化了适用于少量原代胆管上皮细胞的低输入量 ChIP-seq 和 ATAC-seq 实验方案。这些方法能够在细胞用量极少的情况下，实现对组蛋白修饰和染色质可及性的分析。低输入量 ChIP-seq 利用微球菌核酸酶（MNase）进行 DNA 片段化，而 ATAC-seq 则采用 Tn5 转座酶来捕获开放的染色质区域。这些多组学技术为研究 PLD 及其他胆道疾病中胆管上皮细胞命运转变过程中的染色质状态动态变化提供了重要见解。更重要的是，所优化的实验流程可可靠地应用于其他低输入量的原代细胞，从而推动在多种细胞背景下探索表观遗传机制。本研究建立了一种系统性研究染色质状态改变的方法，有助于推动针对 PLD 及相关疾病的基于表观遗传学的治疗策略的发展。

引言

PLD 是一种遗传性疾病，其特征是由胆管细胞衍生出多个充满液体的囊肿。随着这些囊肿逐渐增大，会严重影响患者的生活质量^1,4。目前针对 PLD 的治疗策略尚不充分，仅能带来有限的益处，且常导致较高的复发率和并发症发生率^3,4。因此，迫切需要更安全、更有效的治疗方法，以应对 PLD 治疗中尚未解决的临床挑战。

在正常情况下，胆管上皮细胞处于静止状态，而在多囊肝病（PLD）中，这些细胞表现出过度增殖，这是疾病进展的关键驱动因素^5,6。这种囊性转变背后的分子机制尚不明确。尽管表观遗传调控（包括染色质可及性和组蛋白修饰）在细胞命运转变中发挥着重要作用^7,8，但其在PLD进展中的作用仍研究不足。然而，许多表观遗传谱型分析技术需要大量细胞。传统的ChIP-seq依赖超声波破碎染色质，以及染色质可及性检测方法如DNase-seq和MNase-seq，通常需要超过10⁶个细胞，远超自原代胆管上皮细胞可获得的数量。

本论文提供了一种低起始量ChIP-seq^9,10,11的全面实验方案，用于分析少量原代胆管细胞中组蛋白修饰；同时提供了ATAC-seq^11,12,13方案，用于评估这些细胞中染色质的可及性。低起始量ChIP-seq利用MNase对DNA进行片段化⁹，而ATAC-seq则利用Tn5转座酶捕获来自开放染色质区域的DNA片段¹²。结合这些方法的多组学分析，可深入揭示胆管细胞在胆管增生症（PLD）及其他胆道疾病中细胞命运转变过程中的染色质状态动态变化，从而推动靶向表观遗传疗法的开发。

方案

1. ATAC-seq 所需溶液与胆管上皮细胞的制备

1. 在进行ATAC-seq实验的至少一天前，使用表1中列出的试剂配制ATAC裂解缓冲液。
   注意：ATAC裂解缓冲液可在避光条件下于4 °C保存至少1个月。
2. 对于 freshly isolated primary cholangiocytes¹⁴，在分离后立即使用血细胞计数板对细胞进行计数，并尽快开展ATAC-seq实验。
   注意：为尽量减少对细胞活力的影响，应尽可能快速进行后续操作。但如果将细胞置于冰上，通常在2小时内完成操作并无问题。

2. ATAC-seq

注意：ATAC-seq 实验使用 100,000 个胆管上皮细胞。样品和溶液需保持在冰上。ATAC-seq 实验的整个流程大约需要 2 天时间。

1. 500 × g 离心 g 4 °C下离心5分钟。
2. 弃去上清液，加入含有蛋白酶抑制剂的200 µL ATAC裂解缓冲液，轻轻吹打混匀，冰上孵育20 min。前10 min内，轻轻吹打混匀。
3. 在 1,500 × g 条件下离心 g 4 °C 下离心 10 分钟。
4. 将ATAC DNA文库制备试剂盒中的3 µL酶混合物、10 µL 5x缓冲液和37 µL无核酸酶水混合，配制转座反应缓冲液（50 µL），充分混匀。
5. 小心弃去上清液，将收集的细胞核沉淀置于冰上，并立即加入50 µL转座反应缓冲液。轻轻重悬后，在37 °C孵育60分钟，每隔10分钟轻弹管底混匀。
   注意：在弃去上清液之前，先准备好转座反应缓冲液，以防止细胞干燥。
6. 使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化DNA。
   注意：胆管细胞分离过程中残留的 Protein G 珠¹⁴ 此步骤中可去除。DNA样品可在-80 °C长期保存。
7. 使用ATAC DNA文库构建试剂盒，按照制造商提供的说明书进行文库构建。
   注意：除非另有说明，所有样品和溶液均需置于冰上。尽管不同品牌试剂盒的操作步骤可能有所差异，但均与我们的实验方案兼容。
   1. PCR富集：在PCR管中按以下顺序配制PCR富集混合液（50 µL）：10 µL DNA样本（来自步骤2.6）、14 µL无核酸酶水、10 µL 5x TAB、5 µL PPM、1 µL TAE、5 µL P5引物和5 µL P7引物。轻轻吹打混匀。
   2. 将离心管转移至PCR仪中，并运行以下程序：72 °C 3分钟，1个循环；98 °C 30秒，1个循环；98 °C 15秒，60 °C 30秒，72 °C 3分钟，15个循环；72 °C 5分钟，1个循环；然后于4 °C保存。
   3. 纯化：使用前将DNA Clean磁珠置于室温下30分钟，然后进行两步磁珠纯化。
      1. 第一轮：向PCR产物（来自步骤2.7.2）中加入30 µL DNA纯化磁珠，轻轻吹打混匀，室温孵育5分钟。将PCR管置于磁力架上，静置至溶液澄清（约5分钟）。小心转移上清液至新管中，弃去DNA纯化磁珠。
      2. 第二轮：向收集的上清液（来自步骤2.7.3.1）中加入7.5 µL DNA Clean磁珠，轻轻吹打混匀，室温孵育5 min。将离心管置于磁力架上，静置至溶液澄清（约5 min）。小心弃去上清液。
   4. 将离心管置于磁力架上，用200 µL新配制的80%乙醇在室温下清洗DNA纯化磁珠，每次30秒，共洗两次。每次清洗后小心弃去上清液。保持离心管仍在磁力架上，打开管盖，室温下空气干燥磁珠10分钟。最后，加入22 µL无核酸酶水以洗脱DNA。
      注意：DNA 样本可在 -80 °C 长期保存。
8. 使用标准的下一代测序仪对文库进行测序。
   注意：我们建议获得至少 5000 万条双端测序读段。

低输入量ChIP-seq实验中溶液与胆管上皮细胞的制备

1. 在进行低输入量ChIP-seq实验前至少1天，使用表2、表3、表4和表5中列出的试剂配制ChIP裂解缓冲液、ChIP MNase缓冲液、ChIP终止缓冲液、ChIP 2× RIPA缓冲液、ChIP RIPA缓冲液以及ChIP LiCl缓冲液。
   注意：上述溶液可在4 °C下保存至少1个月。
2. 对于 freshly isolated primary cholangiocytes¹⁴，在分离后立即使用血细胞计数板对细胞进行计数，并尽快开展低输入量ChIP-seq实验。
   注意：为尽量减少对细胞活力的影响，操作越快越好。但如果将细胞置于冰上，通常在2小时内完成后续操作并无问题。

低输入量ChIP-seq第1天：细胞裂解、MNase消化及抗体孵育

注意：低输入量 ChIP-seq 实验的整个流程大约需要 3 天。

1. 将胆管上皮细胞按每管100,000个细胞分装至各管中，并将样品和溶液置于冰上。
   注意：若需对多种组蛋白修饰进行低起始量的ChIP-seq实验，在加入组蛋白修饰抗体前可按比例相应增加体积。后续步骤中的试剂用量均基于含有1 × 10⁵个细胞的一管样品。
2. 在4 °C下以2,000 × g离心5分钟。
3. 弃去上清液，加入19 µL含蛋白酶抑制剂的ChIP裂解缓冲液，轻轻吹打混匀，冰上孵育10分钟。避免产生气泡。
4. 加入19 µL ChIP MNase缓冲液，轻轻吹打混匀。
5. 加入2 µL MNase（0.01 U/µL），轻轻吹打混匀，37 °C孵育5分钟。
   注意：孵育时间至关重要。MNase的终浓度为0.0005 U/µL。MNase的最佳浓度可根据细胞类型和数量确定。
6. 立即将样品置于冰上，加入5 µL ChIP STOP缓冲液以终止消化反应，轻轻吹打混匀。
7. 加入45 µL含蛋白酶抑制剂的ChIP 2x RIPA缓冲液，轻轻吹打混匀，继续在冰上孵育10分钟。
8. 在4 °C下以20,000 × g离心15分钟，缓慢将上清液转移至新管中。
   注意：此步骤可去除胆管上皮细胞分离过程中残留的Protein G磁珠¹⁴。
9. 加入40 µL ChIP RIPA缓冲液。
10. 对于免疫沉淀（IP）样品，每管加入1 µg抗体，于4 °C在旋转仪（20 rpm）上孵育过夜。
11. 对于Input样品，不加任何抗体，于4 °C在旋转仪（20 rpm）上孵育过夜。

5. 低起始量ChIP-seq第2天：免疫沉淀与洗涤 和洗脱

注意：对于免疫沉淀（IP）样品，请执行步骤 5.1-5.7；对于输入（Input）样品，请执行步骤 5.8-5.12。

1. 用 1 mL 冰冷的 ChIP RIPA 缓冲液预洗 Protein G 磁珠。
2. 向样品中加入 400 µg Protein G 磁珠，于 4 °C 在旋转器上（20 rpm）孵育 2 小时。
3. 在旋转器上（20 rpm）用 150 µL 冰冷的 ChIP RIPA 缓冲液洗涤磁珠，4 °C 洗涤 5 次，每次 5 分钟。使用磁力分离器去除上清液。
4. 在旋转器上（20 rpm）用 150 µL 冰冷的 ChIP LiCl 缓冲液洗涤磁珠，4 °C 洗涤 5 分钟。使用磁力分离器去除上清液。
5. 加入 30 µL ChIP 洗脱缓冲液（29 µL 无核酸酶水和 1 µL 蛋白酶 K）重悬磁珠，于 55 °C 以 900 rpm 振荡 90 分钟。每隔一段时间轻轻弹动离心管，使磁珠保持悬浮状态。
6. 使用磁力分离器收集上清液，并缓慢转移至新离心管中。于 72 °C 孵育 40 分钟以灭活蛋白酶 K。
7. 使用荧光计测定 DNA 浓度。
   注意：DNA 样品可在 -80 °C 长期保存。
8. 对于 Input 样品，加入 1 µL 蛋白酶 K，于 55 °C 以 900 rpm 振荡 90 分钟。
9. 使用苯酚-氯仿法纯化 DNA。加入 130 µL DNA 提取试剂，剧烈涡旋至溶液变为粉红色。于 20,000 × g 离心 5 分钟。
10. 将上清液转移至新离心管，加入 130 µL 冰冷的异丙醇，再加入 1 µL 甘油原和 6.5 µL 3M NaAc。于 20,000 × g 离心 15 分钟。
11. 弃去上清液，用 1 mL 70% 乙醇洗涤一次，于 20,000 × g 离心 15 分钟。干燥沉淀后，用 30 µL 无核酸酶水重悬。
12. 使用荧光计测定 DNA 浓度。
    注意：DNA 样品可在 -80 °C 长期保存。

低输入量 ChIP-seq 第3天：文库构建与测序

1. 根据制造商说明书，使用 ChIP DNA 文库构建试剂盒进行文库构建。
   注意：步骤包括末端修复、接头连接和文库扩增。文库构建时取 5 ng ChIP 样品（Input 和 IP 样品）。除特别说明外，所有样品和溶液均需置于冰上。尽管不同品牌试剂盒的操作可能有所差异，但均适用于本方案。
2. 末端修复：在 PCR 管中配制末端修复反应缓冲液（65 µL），加入 5 ng DNA 样品（来自步骤 5.6 或步骤 5.11）、15 µL 末端修复混合液 4、6.5 µL Tris EDTA 和无核酸酶水，定容至 65 µL。轻柔吹打混匀。将 PCR 管放入 PCR 仪中，运行以下程序：20 °C 反应 15 分钟，65 °C 反应 15 分钟，然后保持在 4 °C（热盖温度：105 °C）。
3. 接头连接：将 DNA 接头 S 按 1:100 比例稀释。在 PCR 管中配制接头连接反应缓冲液（100 µL），加入 65 µL 末端修复产物（来自步骤 6.2）、25 µL 快速连接缓冲液 2、5 µL 快速 DNA 连接酶和 5 µL 稀释后的 DNA 接头 S。轻柔吹打混匀。将 PCR 管放入 PCR 仪中，运行以下程序：20 °C 反应 15 分钟，随后保持在 4 °C（热盖温度：105 °C）。
4. 纯化：
   1. 使用前将 DNA Clean 磁珠于室温放置 30 分钟。向接头连接产物（来自步骤 6.3）中加入 60 µL DNA Clean 磁珠。轻柔吹打混匀，在室温孵育 5 分钟。
   2. 将 PCR 管置于磁力架上，静置至溶液澄清（约 5 分钟）。小心弃去上清液。
   3. 保持 PCR 管在磁力架上。用 200 µL 新配制的 80% 乙醇在室温下清洗 DNA Clean 磁珠两次，每次 30 秒。每次清洗后小心弃去上清液。
   4. 保持 PCR 管仍在磁力架上，打开管盖，室温晾干磁珠 5 分钟。最后加入 22.5 µL 10 mM Tris-HCL（PH 8.0）洗脱 DNA。
5. 文库扩增：在 PCR 管中配制文库扩增反应缓冲液（50 µL），加入 20 µL 纯化产物（来自步骤 6.4）、2.5 µL i5 PCR 引物、2.5 µL i7 PCR 引物和 25 µL 扩增混合液。轻柔吹打混匀。将 PCR 管放入 PCR 仪中，运行以下程序：95 °C 预变性 3 分钟（1 个循环），98 °C 变性 20 秒、60 °C 退火 15 秒、72 °C 延伸 30 秒（18 个循环），72 °C 延伸 5 分钟（1 个循环），然后保持在 4 °C。
6. 纯化：使用前将 DNA Clean 磁珠于室温放置 30 分钟，然后进行两步磁珠纯化。
   1. 第一轮：向文库扩增产物（来自步骤 6.5）中加入 30 µL DNA Clean 磁珠。轻柔吹打混匀，在室温孵育 5 分钟。将 PCR 管置于磁力架上，静置至溶液澄清（约 5 分钟）。小心将上清液转移至新管中，弃去 DNA Clean 磁珠。
   2. 第二轮：向收集的上清液中加入 7.5 µL DNA Clean 磁珠。轻柔吹打混匀，在室温孵育 5 分钟。将 PCR 管置于磁力架上，静置至溶液澄清（约 5 分钟）。小心弃去上清液。保持 PCR 管在磁力架上。用 200 µL 新配制的 80% 乙醇在室温下清洗 DNA Clean 磁珠两次，每次 30 秒。每次清洗后小心弃去上清液。保持 PCR 管仍在磁力架上，打开管盖，室温晾干磁珠 10 分钟。最后加入 22.5 µL 10 mM Tris-HCl (PH 8.0) 洗脱 DNA。
      注意：DNA 样品可于 -80 °C 长期保存。
7. 在标准的高通量测序仪上对文库进行测序。
   注意：建议获得至少 1000 万至 2000 万条双端测序读长。

7. ATAC-seq 和低输入量 ChIP-seq 的数据分析

1. 准备分析用虚拟环境（miniconda）
   1. 使用以下命令从网站下载 Miniconda3，并按照 Miniconda 的安装说明进行安装。
      wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
      bash Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
   2. 为 ATAC-seq 和 ChIP-seq 的分析流程创建虚拟环境。
      conda create -n NGSpipeline
      conda activate NGSpipeline
      conda install bioconda::fastqc bioconda::multiqc bioconda::trim-galore bioconda::bowtie2 bioconda::samtools bioconda::macs2 bioconda::deeptools bioconda::picard bioconda::igv
   3. 下载参考基因组序列文件，并为 bowtie2 比对构建索引。
      wget https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M25/GRCm38.p6.genome.fa.gz
      gunzip GRCm38.p6.genome.fa.gz
      bowtie2-build-s GRCm38.p6.genome.fa GRCm38_bowtie2_index
2. 使用 FastQC 对 ATAC-seq 和 ChIP-seq 的测序读段进行质量控制，并使用 MultiQC 汇总质量控制报告，以确保测序结果无显著 GC 偏向性，并具备足够的文库复杂度以支持下游分析。若文库的质量控制结果存在显著差异，则应予以剔除。
   fastqc -o <输出目录><seqfile1> <seqfile2> …… <seqfileN>
   multiqc <输出目录>
3. 使用 trim_galore 去除测序接头。
   trim_galore -q 20 --phred33 --stringency 3 --length 25 -e 0.1 --paired -j <线程数> -o <输出目录> <成对末端读段 1> <成对末端读段 2>
4. 使用默认参数将修剪后的读段比对至 mm10 参考基因组组装，由于 ATAC-seq 片段长度分布较广，对 ATAC-seq 数据在 bowtie2 中额外添加参数（--very-sensitive -X 2000）。
   1. 对于 ATAC-seq：
      bowtie2 -p <线程数> --very-sensitive -X 2000 -x <第 7.1.3 步生成的基因组索引> -1 <第 4.2 步处理后的 clean fastq 文件 1> -2 <第 4.2 步处理后的 clean fastq 文件 2> | samtools view -S -O BAM -@ <线程数> -o <输出 bam 文件>
   2. 对于 ChIP-seq：
      bowtie2 -p <线程数> -x <第 7.1.3 步生成的基因组索引> -1 <第 4.2 步处理后的 clean fastq 文件 1> -2 <第 4.2 步处理后的 clean fastq 文件 2> | samtools view -S -O BAM -@ <线程数> -o <输出 bam 文件>
5. 去除比对得分较低（q30）的读段，以及比对到线粒体基因组和非常规染色体上的读段。
   samtools view -bh -q 30 -f 2 <输入 bam 文件> | samtools view -h | grep -v 'chrM' | grep -v 'random' | grep -v 'chrUn' | samtools sort -l 9 -O BAM -o <输出过滤后 bam 文件>
6. 使用 Picard 的 MarkDuplicates 命令去除 PCR 重复读段。
   picard MarkDuplicates I=<输入过滤后 bam 文件> O=<输出去除重复 bam 文件> M=<去除重复报告文件> REMOVE_DUPLICATES=true
7. 使用 MACS2 的 callpeak 命令，参数设置为 -f BAMPE -g mm -B -q 0.01，进行峰呼叫。
   macs2 callpeak -f BAMPE -t <去除重复 bam 文件> -g mm -n <输出前缀> -B -q 0.01
8. 使用 Deeptools 的 BamCoverage 命令生成 BigWig 文件。
   samtools index <去除重复 bam 文件> -@ 4
   bamCoverage -b <去除重复 bam 文件> -o <输出 BigWig 文件> -bs 50 -p <线程数> --effectiveGenomeSize2652783500--normalizeUsing RPGC -e -ignoreDuplicates
9. 使用 IGV 基因组浏览器查看来自 macs2 的 narrowPeak 文件和来自 Deeptools BamCoverage 的 BigWig 文件。

结果

为了获得原代胆管上皮细胞的染色质图谱，我们优化了适用于少量（约100,000个）原代胆管上皮细胞的低起始量ChIP-seq和ATAC-seq实验方案。原代胆管上皮细胞的琼脂糖凝胶电泳结果显示，使用1 × 10⁵个原代胆管上皮细胞时，在37 °C条件下使用0.02 U MNase消化5分钟可有效产生单核小体，该条件被确定为最佳酶浓度（图1）。

WT 或 PLD 小鼠胆管细胞中 ATAC-seq 与 H3K9ac/H3K9me3 低输入量 ChIP-seq 分析概述
对 WT 和 PLD 胆管细胞中染色质可及性水平的全基因组分析获得了高质量的 ATAC-seq 和 ChIP-seq 数据。所有测序实验（包括 ATAC-seq 和低输入量 ChIP-seq）均设置两个生物学重复，以确保结果的可重复性。使用 FastQC 对 ATAC-seq 和低输入量 ChIP-seq 进行质量控制分析，结果显示测序读段质量较高（表 6）。ATAC...

讨论

为了系统而全面地绘制囊性胆管细胞状态转变过程中染色质状态的动态变化，我们成功优化了适用于少量原代胆管细胞的低输入量ChIP-seq和ATAC-seq技术。尽管本研究聚焦于原代胆管细胞，但我们确信该方案也可应用于其他存活率高但数量有限的原代细胞。类似地，虽然本研究仅展示了H3K9ac和H3K9me3的ChIP-seq分析结果，但该方案同样适用于其他组蛋白修饰，包括激活型标记如H3K4me1、H3K4me3、H3K9ac和H3K27ac，以及抑制型标记如H3K9me3、H3K27me3和H3K36me3。实验成功执行依赖于若干关键步骤。

第一个关键步骤是确保原代胆管上皮细胞分离的高存活率。ATAC-seq 和低输入量 ChIP-seq 均需要高存活率的细胞，因此细胞在分离后必须立即计数并进行后续处理。胆管上皮细胞分离过程中残留的任何 Protein G 磁珠均不会影响实验结果，因为这些磁珠可在后续步骤中被去除（低输入量 ChIP-seq 的第 4.8 步和 ATAC-seq 的第 2.6 步）。低输入量 ChIP-seq 的第二个关键步骤是使用 MNase 消化染色质。MNase 的浓...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA	Solarbio	E1170
1 M Tris-HCl （pH=7.5）	Solarbio	T1140
1 M Tris-HCl （pH=8.0）	Solarbio	T1150
3 M NaAc	Beyotime	ST342
8 M LiCl	Sigma	L7026
琼脂糖凝胶	Biosharp	BS081
ATAC DNA 文库制备试剂盒	Vazyme	TD501
CaCl2	Sangon Biotech	A501330	1 M 储备液
ChIP DNA 文库制备试剂盒	Vazyme	ND607
DNA 清洁珠	Vazyme	N411
DNA 提取试剂	Solarbio	P1012
EGTA	Solarbio	E8050	100 mM （pH = 8） 储备液
荧光计	Invitrogen	Q33226
糖原	Thermo Scientific	R0561
血细胞计数器	QIUJING	XB。K.25。
Igepal CA-630	Sigma	I8896	10% 库存
磁选机	Promega	Z5342
MgCl2	Sangon Biotech	A100288	1.5 M 库存
MNase	Sigma	N3755	0.01 U/µL 原液
NaCl	Sangon Biotech	A610476	5 M 原液
NP40	Solarbio	N8030
无核酸酶水	Life Technologies	AM9937
PCR 仪器	Applied Biosystems	4484073
PCR 纯化试剂	QIAGEN	28106
蛋白酶抑制剂	罗氏	04693132001
蛋白 G 微珠	Invitrogen	10004D
蛋白酶 K	TransGen	GE201-01
旋转器	Kylin-Bell	QB-528
SDS	Solarbio	S8010	10%  库存
脱氧胆酸钠	Sigma	S1827
热混合器 舒适	Eppendorf	5355
Triton X-100	Solarbio	T8200
吐温-20	Solarbio	T8220
软件	Citation （PMID）/Company	版本	Website
Bowtie2	22388286	2.3.5.1	https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Deeptools	27079975	3.4.3 https://deeptools.readthedocs.io/en/latest/
FastQC		0.12.1	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
IGV	21221095	2.12.3	https://igv.org/
MACS2	18798982	2.2.7.1	https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_peak_calling_macs.html
Miniconda	Anaconda	4.7.12.1	https://www.anaconda.com/
MultiQC	27312411	1.23	https://seqera.io/multiqc/
Picard		2.27.5	https://broadinstitute.github.io/picard/
samtools	33590861	1.6	https://www.htslib.org/
修剪丰富		0.6.6	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/