福尔马林固定石蜡包埋样本中生物分子的质谱成像连续检测

摘要

本文介绍了一种质谱成像方案，用于在福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本中依次检测代谢物、N-连接聚糖和胰蛋白酶肽段。

摘要

组织是复杂的细胞环境，由多种细胞类型和生物分子组成，这些成分相互作用以实现器官的各项功能。传统上，对代谢物、聚糖和蛋白质等生物分子的分析技术通常需要将组织均质化，从而破坏了所有的空间信息。这类传统方法限制了对复杂细胞内和细胞外分子相互作用的全面理解。而质谱成像（MSI）技术不仅能够保留组织中生物分子的空间信息，还可通过对同一组织切片进行连续分析，在接近单细胞分辨率的水平上同时检测多种类型的分析物。这使我们能够更全面地揭示不同类别生物分子之间的分子相互作用。本文所介绍的实验方案详细阐述了在同一组织切片上以20 µm分辨率依次进行代谢物、N-连接聚糖和胰蛋白酶肽段质谱成像的具体步骤。合理规划不同类别分析物的成像顺序，并谨慎处理组织切片以确保其完整性，即可从同一切片获得多组高质量图像。这些数据随后可与来自连续切片的其他空间组学数据（如转录组学、免疫组织化学等）进行整合，从而在相邻切片中对同一细胞进行多维度分析。

引言

质谱成像（Mass Spectrometry Imaging, MSI）是一种强大的技术，能够在无需标记的情况下，对组织切片中的数百至数千种生物分子进行检测与可视化 先验的 了解组织中存在的确切分子，使其成为生物标志物发现的理想工具¹。尽管不同实验室使用多种类型的质谱成像技术，包括解吸电喷雾电离（DESI）^2,3红外基质辅助激光解吸电喷雾电离（IR-MALDESI）⁴，以及二次离子质谱法（SIMS）⁵基质辅助激光解吸/电离（MALDI）仍是目前最常用且最灵活的技术。通过优化样本制备条件，包括组织洗涤/预处理、酶解消化以及所用基质/溶剂，大多数类型的生物分子均可通过质谱成像（MSI）检测。^6,7基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）已用于检测代谢物、脂质、糖类、蛋白质及蛋白水解肽。

微卫星不稳定性（MSI）研究已被广泛应用于多种临床和临床前研究中，以更深入地理解疾病机制^8,9，改进癌症的分级与分期^10,11，预测治疗效果¹²，提高诊断准确性¹³，以及确定肿瘤的分子边界¹⁴等。这些研究大多集中于仅检测单一类别的分析物。然而，通常人们更希望从同一样本中分析多种类别的生物分子。传统上，这通过组织的连续切片来实现。但近年来，已有研究展示了从同一组织切片中依次分析多种分析物类别的方法。例如，Yagnik 等人展示了对冷冻组织进行脂质成像后，再在同一组织切片上进行 MALDI 免疫组织化学分析以实现细胞类型分类¹⁵。Clift 等人展示了在福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织切片上依次应用 PNGaseF、胶原酶和胰蛋白酶，分别用于成像N-连接聚糖、细胞外基质蛋白和普通蛋白质¹⁶。Escobar 等人则展示了从同一冷冻组织切片中依次分析N-连接聚糖、O-GlcNAc 和胰蛋白酶消化肽段¹⁷。这类实验的成功依赖于周密的实验设计，即首先分析组织中最易丢失的分析物，随后分析更稳定的分析物。在许多情况下，用于去除不需要分子类别的洗涤步骤还能增强其他分子类别的信号⁶，这一特性可被充分利用——每次去除先前所用基质的洗涤步骤，同时有助于增强下一类待成像分析物的信号。

最近，我们发表了一种用于代谢物顺序分析的工作流程， N-连接的聚糖以及来自同一部分福尔马林固定石蜡包埋卵巢癌组织的胰蛋白酶肽段¹⁸. 本文介绍了从同一样本组织切片中分析这三类生物分子的详细工作流程；该实验方案的概要如下所示 图1据我们所知，这是首个详细描述从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织进行连续成像工作流程的实验方案。简言之，组织切片经二甲苯脱蜡后，喷涂1,5-二氨基萘基质（10 mg/mL溶于50%乙腈）用于负离子模式代谢物成像。随后去除基质，对切片进行再水化和抗原修复，接着喷加PNGase F（0.1 µg/µL溶于碳酸氢铵缓冲液）以释放 N-连接的聚糖 原位孵育后，切片用α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）基质（10 mg/mL溶于70%乙腈、0.1%三氟乙酸）包被，并在正离子模式下成像。随后再次去除基质，重新水化并重复抗原修复，切片喷洒胰蛋白酶（0.075 µg/µL溶于碳酸氢铵）后孵育，再用CHCA基质（10 mg/mL溶于70%乙腈、0.1%三氟乙酸）包被，并在正离子模式下成像。所有溶液均应现用现配，实验应尽可能在连续3天内完成。若遇延迟，切片应在干燥条件下保存于-80 °C超低温冰箱中。

方案

本方案采用未经治疗的高级别浆液性卵巢癌患者接受初次细胞减灭术时采集的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。所有临床数据均来自德克萨斯大学MD安德森癌症中心妇科肿瘤与生殖医学系卵巢癌样本库，数据获取遵循经机构审查委员会批准的研究方案。患者书面知情同意书由前台工作人员获取，研究严格遵循公认的伦理准则进行。

1. 代谢物成像样品制备

注意：本方案假设福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片（厚度为 4 µm）已经贴附在玻璃显微镜载玻片上，因为临床样本通常需要由组织技术员在临床病理核心实验室中进行切片。由于本文所述工作是在所引用的飞行时间（TOF）仪器上进行的，正交飞行时间检测消除了传统质谱成像（MSI）实验中对导电载玻片的需求。使用标准显微镜载玻片也更符合临床病理实验室中的常规工作流程，同时可利用已存档并贴附在载玻片上的组织样本。

1. 使用金刚石刻划笔在载玻片的四个角上制作定位标记。
2. 将切片浸入组织级二甲苯中脱蜡 3 分钟。
   注意：二甲苯有毒，应在化学通风橱中操作。
3. 将切片浸入新鲜二甲苯中 3 分钟。
4. 让载玻片在室温下自然干燥。
5. 将载玻片放入滑动适配器靶板中。
6. 使用平板扫描仪以 4,800 dpi 的分辨率获取载玻片的光学图像。
7. 通过将 15 mg 的 1,5-二氨基萘（DAN）溶解于 1.5 mL 的 50% 乙腈（ACN）中制备 MALDI 基质。超声处理至完全溶解，约 5 分钟。在将基质溶液注入样品环之前进行过滤。
   注意：DAN 可能具有致癌性，操作时应佩戴适当的个人防护装备。基质喷涂应在化学通风橱中进行。
8. 使用机器人试剂喷涂仪将 DAN 溶液喷涂到载玻片上，参数如下：轨道速度 - 1,200 mm/s；轨道间距 - 3 mm；喷嘴温度 - 60 °C；喷嘴高度 - 40 mm；流速 - 100 µL/min；喷涂次数 - 4；N₂ 压力 - 10 psi；模式 - CC
9. 在载玻片上的已知位置点加 0.5 µL 溶于甲醇的红色磷悬浮液。

2. 代谢物成像数据采集

1. 将制备好的载玻片放入 Slide Adapter II 中，并装载至 timsTOF fleX MALDI QTOF 质谱仪。
2. 在 timsControl 中加载用于负离子模式数据采集的适当方法，并将tims 关闭。如果仪器尚未处于负离子模式，则在切换极性后至少等待 25 分钟以完成平衡，然后再进行校准和数据采集。代谢物检测的仪器参数如下：m/z 范围 - 50 - 600；激光扫描范围 - X 和 Y 方向均为 16.0 µm；最终场大小 - X 和 Y 方向均为 20.0 µm；激光脉冲次数 - 150；激光能量 - ~30%；Funnel 1 RF - 150.0 Vpp；Funnel 2 RF - 200.0 Vpp；多极杆 RF - 200.0 Vpp；碰撞能量 - 10.0 eV；碰撞 RF - 500.0 Vpp；传输时间 - 55.0 µs；预脉冲存储时间 - 5.0 µs（补充图 S1）。
3. 在样品载体选项卡上执行目标轮廓（点击立即生成按钮）和聚焦调整（点击立即调整按钮）。如有需要，在激光选项卡中调整X和Y方向的激光位置，以确保激光与十字线完全对齐。
4. 通过对载玻片上的某一点累计至少五组激光脉冲信号，采集红磷的质谱图。
5. 点击校准选项卡上的校准按钮进行校准。移除强度极低或 ppm 误差较高的峰。
   注意：偶数磷簇（P2 和 P4）通常信号非常弱。点击“接受”前，校准得分应达到 100%。若未达标，请清除累计谱图并重新采集。
6. 启动flexImaging软件。图像采集图形用户界面将自动启动。
7. 在选择成像运行窗口中，选择设置新的成像运行。
8. 在选择工作流程窗口中，选择经典工作流程。
9. 在数据存储窗口中，输入成像运行名称和数据的结果目录。
   注意：文件名中不应包含空格。
10. 在采集设置窗口中，选择用户定义的测量区域，并在光栅宽度框中输入20。点击浏览以选择之前创建的timsControl 方法。
11. 在样品图像窗口中，点击浏览以选择使用平板扫描仪获取的光学图像。
12. 在样品教学窗口中，执行光学图像与载玻片之间的三点对齐；然后将样品载体移至载玻片上的第一个刻蚀定位标记处，并在 timsControl 中将十字线与刻蚀中的明显特征对齐。放大图像（建议 100% 缩放），将样品图像设置为设置教学点，然后在光学图像的相同位置点击。重复此过程共三次，总计设置三个教学点。点击下一步完成教学过程。
13. 点击确定退出新建成像运行向导。
14. 通过点击软件中的定位样品载体按钮，检查教学的准确性。放大图像，并在图片中点击第四个（未使用的）定位标记的明显特征；样品载体将在 timsControl 中移动至该位置。确认十字线与所选特征对齐。若未对齐，请在 flexImaging 中清除教学点并重复教学过程以提高准确性。
15. 在软件中选择添加多边形测量区域工具，并勾勒出待成像的组织区域。每次鼠标点击将创建一个锚点。按键盘上的退格键可逐个删除锚点。绘制完成后，双击鼠标以闭合多边形。
16. 通过在组织内部多个位置发射激光来检查信号。使用定位样品载体按钮点击图像中的某个位置（如步骤 2.14 中用于检查教学的方法）。谱图中将主要显示基质在 m/z 157 和 313 附近的峰；放大 m/z 154 以下以及 250–300 区域，可分别观察到多种小分子代谢物和脂肪酸峰。根据需要调整激光能量以获得最佳信号。
17. 保存 timsControl 方法。
18. 点击软件中的启动自动运行按钮，开始成像采集。
    注意：使用 DAN 基质在负离子模式下成像，可检测到三羧酸循环代谢物、氨基酸、脂肪酸等多种代谢物。

3. 用于 N连接聚糖成像的样品制备

1. 从质谱仪中取出样本后，将载玻片浸入100%乙醇（200 proof）中1分钟，以去除DAN基质。
2. 在Coplin染色缸中对载玻片进行再水化：新鲜100%乙醇1分钟；95%乙醇1分钟；70%乙醇1分钟；水3分钟；新鲜水3分钟。
3. 让载玻片干燥约15分钟。
4. 通过将载玻片浸入含500 mL水的脱封闭室（Decloaking Chamber）内的带盖Coplin染色缸中进行抗原修复，其中缓冲液为100 mM Tris缓冲液（将6.06 g Tris碱溶于500 mL水中，并根据需要调节pH至9）。加热至95 °C，持续20分钟。
5. 将Coplin染色缸从脱封闭室中取出，置于实验台面上冷却20分钟。
6. 通过五次更换溶液将载玻片缓冲液置换为水。前三次操作中，倒出一半溶液并用清水替换；最后两次操作中，倒出全部溶液并用清水替换。
7. 让载玻片完全干燥。
8. 在应用PNGaseF后，为载玻片孵育创建一个湿盒。剪裁一张吸水擦拭纸，使其覆盖直径100 mm培养皿底部。将两张实验室擦拭纸卷成卷状，分别置于培养皿两侧作为支撑垫（图2）。加入8 mL水以充分润湿这些擦拭纸，盖上培养皿盖子，并将其放入37 °C烘箱中预热至少30分钟。
   注意：培养皿内部应呈现有蒸汽的状态。
9. 通过将100 µg冻干酶溶解于200 µL 100 mM碳酸氢铵缓冲液（pH 7.8）中来配制PNGaseF，并涡旋混匀。将溶液转移至1.5 mL微量离心管中，并用水稀释至1 mL。
10. 使用机器人试剂喷雾器以以下参数向载玻片喷洒PNGaseF。低体积/低流速应用时使用注射泵：轨道速度 - 1200 mm/s；轨道间距 - 3 mm；喷嘴温度 - 45 °C；喷嘴高度 - 40 mm；流速 - 25 µL/min；喷雾次数 - 15；N₂压力 - 10 psi；喷雾模式 - CC
11. 将载玻片组织面向上放置于预热的培养皿中，两端分别置于两侧的擦拭纸卷上。盖上盖子后用粘性密封膜密封培养皿，并将其放入37 °C烘箱中，同时在培养皿上方放置一个设定为40 °C的爬行动物加热垫。
    注意：此操作可使盖子成为培养皿中最温暖的部分，防止冷凝水在盖子上形成并滴落到组织上，从而避免图像中出现伪影。
12. 孵育载玻片2小时，以完成消化反应。
13. 从培养皿中取出载玻片，并静置干燥约5分钟。
14. 通过将15 mg α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）溶解于1.5 mL 70%乙腈、0.1%三氟乙酸（TFA）、10 mM磷酸铵的混合液中制备MALDI基质。
    注意：TFA具有腐蚀性，应在通风橱内佩戴适当的个人防护装备进行操作。
15. 超声处理至完全溶解，约5分钟。
16. 在将基质溶液注入样品环之前进行过滤。
17. 使用机器人试剂喷雾器以以下参数向载玻片喷洒CHCA：轨道速度 - 1,200 mm/s；轨道间距 - 3 mm；喷嘴温度 - 75 °C；喷嘴高度 - 40 mm；流速 - 120 µL/min；喷雾次数 - 3；N₂压力 - 10 psi；喷雾模式 - HH
18. 在载玻片上的已知位置点加0.5 µL甲醇悬浮的红色磷。

4. N -连接聚糖成像数据采集

1. 将制备好的载玻片放入质谱成像滑座适配器的目标位置，并装入 MALDI QTOF 质谱仪中。
2. 在 timsControl 软件中加载适用于正离子模式数据采集的相应方法。如果仪器此前未处于正离子模式，切换极性后需至少等待 25 分钟以完成平衡，然后再进行校准和数据采集。糖类分析的仪器参数如下：m/z 范围 - 700–3500；激光扫描范围 - X 和 Y 方向均为 16.0 µm；最终场大小 - X 和 Y 方向均为 20.0 µm；激光脉冲次数 - 200；激光能量 - 约 25%；Funnel 1 RF - 450.0 Vpp；Funnel 2 RF - 500.0 Vpp；多极杆 RF - 500.0 Vpp；碰撞能量 - 10.0 eV；碰撞 RF - 2,700.0 Vpp；传输时间 - 140.0 µs；预脉冲存储时间 - 14.0 µs（补充图 S2）。
3. 在样品载体选项卡中执行目标轮廓（点击立即生成按钮）和聚焦调整（点击立即调整按钮）。如有需要，在激光选项卡中调整激光位置的X和Y坐标，确保激光与十字准线对齐。
4. 通过对载玻片上的一个位点进行至少五组激光脉冲信号累加，采集红磷的质谱图。
5. 在校准选项卡中点击校准按钮执行校准。移除强度极低或 ppm 误差较高的峰。
   注意：点击“接受”前，校准得分应达到 100%。若未达到，请清除累加谱图并重新采集。
6. 在软件中打开先前用于代谢物成像的 .mis 文件。
7. 将该文件另存为新名称，以表明其为糖类数据。
8. 在编辑 | 成像运行属性中，将采集方法更改为所需的糖类分析方法。
9. 使用编辑 | 清除教学点清除之前设置的教学点。
   注意：载玻片在从滑座适配器中取出并重新装入后，其位置不会完全一致。
10. 使用编辑 | 设置教学点重新进行教学；设置3 个点，操作方式与原始成像向导（步骤 2.12）相同。
11. 通过点击软件中的定位样品载体按钮检查教学的准确性。放大图像后，点击图像中第四个（未使用）基准点的明显特征。样品载体将在 timsControl 中移动至该位置；请确认十字准线与所选特征对齐。
    注意：若十字准线未对齐，请清除教学点并重复教学过程以提高准确性。
12. 保存文件。
13. 在组织区域内的若干位置发射激光，检查信号强度。使用定位样品载体按钮点击图像中的某一位置（如步骤 4.11 所示），以验证教学准确性。确认谱图中存在丰富的糖类峰，主峰通常出现在 m/z 1,663 和 1,809 处。根据需要调整激光能量以获得最佳信号。
14. 保存 timsControl 方法。
15. 点击启动自动运行按钮，开始成像采集。

5. 胰蛋白酶肽成像的样品制备

1. 将载玻片浸入100%乙醇（200 proof）中约1分钟，以去除CHCA基质。
2. 在Coplin染色缸中对载玻片进行再水化处理，步骤如下：新鲜100%乙醇1分钟；95%乙醇1分钟；70%乙醇1分钟；水3分钟；新鲜水3分钟。
3. 让载玻片干燥约15分钟。
4. 将载玻片浸入含500 mL水的脱封仪（Decloaking Chamber）内的Coplin染色缸中，染色缸内盛有pH 9的100 mM Tris缓冲液，盖子松松地盖上。加热至95 °C，持续20分钟。
   注意：第二次抗原修复步骤对于使蛋白质变性至关重要，可更有效地暴露胰蛋白酶的切割位点。
5. 从脱封仪中取出Coplin染色缸，置于实验台面上冷却20分钟。
6. 通过五次更换溶液将载玻片缓冲液置换为水。前三次更换时，倒出一半溶液并补充等量水；最后两次更换时，倒出全部溶液并补充新鲜水。
7. 让载玻片完全干燥。
8. 将100 µg冻干胰蛋白酶溶于200 µL 100 mM乙酸中，用移液器反复吹打混匀。分装成适合实验的体积（通常为40 µL），并于-20 °C保存。
9. 取40 µL胰蛋白酶分装液，加入350 µL 100 mM碳酸氢铵缓冲液（pH 7.8）和39 µL乙腈（ACN），充分混匀。
   注意：乙腈（10% ACN）相较于纯水溶液可提高胰蛋白酶活性，并降低喷雾溶液的表面张力¹⁹。
10. 使用机器人试剂喷雾仪（Robotic Reagent Sprayer）按以下参数向载玻片喷洒胰蛋白酶。低体积/低流速应用时使用注射泵：轨道速度 - 750 mm/s；轨道间距 - 3 mm；喷嘴温度 - 30 °C；喷嘴高度 - 40 mm；流速 - 10 µL/min；喷雾次数 - 12；N₂压力 - 10 psi；喷雾模式 - HH
11. 在直径100 mm的培养皿底部放置一块吸水垫，确保其四角刚好接触皿壁边缘，并将1 mL水均匀分布在吸水垫上。
12. 将载玻片组织面向上放置于吸水垫上，盖上培养皿盖，并用封口膜密封培养皿。
13. 在37 °C孵育4小时，以完成酶解反应。
14. 从培养皿中取出载玻片，静置干燥约5分钟。
15. 配制MALDI基质：将15 mg α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）溶解于1.5 mL含70%乙腈、0.1%三氟乙酸（TFA）和10 mM磷酸铵的溶液中。
16. 超声处理至完全溶解，约5分钟。
17. 在将基质溶液注入样品环之前进行过滤。
18. 使用机器人试剂喷雾仪按以下参数向载玻片喷洒CHCA：轨道速度 - 1200 mm/s；轨道间距 - 3 mm；喷嘴温度 - 75 °C；喷嘴高度 - 40 mm；流速 - 120 µL/min；喷雾次数 - 4；N₂压力 - 10 psi；喷雾模式 - HH
19. 在载玻片的已知位置点加0.5 µL甲醇悬浮的红色磷。

6. 胰蛋白酶肽成像数据采集

1. 将制备好的载玻片放入载玻片适配器中，并装入 timsTOF MALDI QTOF 质谱仪。
2. 在 timsControl 中加载适用于正离子模式数据采集的方法。如果仪器此前未处于正离子模式，则在切换极性后至少等待 25 分钟以完成平衡，然后再进行校准和数据采集。肽段检测的仪器参数如下：m/z 范围 - 600–4500；激光扫描范围 - X 和 Y 方向均为 16.0 µm；最终场大小 - X 和 Y 方向均为 20.0 µm；激光脉冲次数 - 200；激光能量 - 约 25%；Funnel 1 RF - 450.0 Vpp；Funnel 2 RF - 500.0 Vpp；Multipole RF - 600.0 Vpp；碰撞能量 - 10.0 eV；碰撞 RF - 3400.0 Vpp；传输时间 - 180.0 µs；预脉冲存储时间 - 18.0 µs（补充图 S3）。
3. 在样品载体选项卡上执行目标轮廓（点击立即生成按钮）和焦点调节（点击立即调节按钮）。如有需要，在激光选项卡中调整激光位置的X和Y坐标，以确保激光与十字准线对齐。
4. 通过对载玻片上的某一点累计至少五组激光脉冲信号，采集红磷的质谱图。
5. 在校准选项卡上点击校准按钮执行校准。移除强度极低或 ppm 误差较高的峰。点击接受前确认校准评分为 100%。若未达到，清除累加谱图并重新采集。
6. 打开先前用于聚糖成像的 .mis 文件。
7. 将该文件另存为新名称，以表明其为肽段数据。
8. 在编辑 | 成像运行属性下，将采集方法更改为所需的肽段方法。
9. 使用编辑 | 清除教学点清除之前设置的教学点。
   注意：将载玻片从适配器中取出并重新装入后，其位置不会完全与之前一致。
10. 使用编辑 | 设置教学点重新进行教学；设置三个点，操作方式与原始成像向导（步骤 2.12）相同。
11. 通过点击定位样品载体按钮检查教学的准确性。放大图像后，点击图像中第四个（未使用）基准点的明显特征位置。样品载体会在 timsControl 中移动至该位置；请确认十字准线与所选特征对齐。
    注意：若十字准线未对齐，请清除教学点并重复教学过程以提高准确性。
12. 保存文件。
13. 通过在组织区域内多个位置发射激光来检查信号。使用定位样品载体按钮点击图像中的某一位置（如同步骤 6.11 中检查教学时的操作），确认谱图中存在丰富的肽段峰，主峰通常出现在 m/z 944、1,105 和 1,198 处。根据需要调整激光能量以获得最佳信号。
14. 保存 timsControl 方法。
15. 点击启动自动运行按钮开始成像采集。

7. 组织学染色

注意：苏木精和伊红染色有多种方法。此处介绍的是本实验室常用的一种改良卡氏染色法。

1. 将载玻片浸入100%乙醇中1分钟，以去除CHCA基质。
2. 按以下步骤对载玻片进行染色：95%乙醇30秒；70%乙醇30秒；水30秒；苏木精2分钟；水30秒；70%乙醇30秒；95%乙醇30秒；伊红1分钟；95%乙醇30秒；100%乙醇30秒；二甲苯2.5分钟；用封片介质加盖盖玻片。
3. 让载玻片干燥>1小时，并通过轻轻按压盖玻片去除任何气泡。
4. 使用数字切片扫描仪进行数字化。

8. 数据可视化

注意：SCiLS Lab 可进行大量分析，但本方案不涉及这些内容。本文仅介绍基本的文件创建、数据可视化，以及通过数据库比对峰信号以进行初步鉴定。

1. 启动 SCiLS Lab 2025b，然后选择 新建。
2. 选择要加载到软件中的数据文件。
   注意：使用 SCiLS Lab Pro 时，可同时加载多个使用相同参数采集的数据文件，以便相互归一化并同时进行可视化。
3. 按所需布局排列样本。通过左键单击并拖动来移动样本，通过右键单击并拖动来旋转样本。选择 下一步。
4. 在 质荷比轴设置 窗口中进行必要的调整。对于 timsTOF 数据，通常默认值即可获得良好效果。点击 下一步。
5. 在 特征峰识别 窗口中，设置导入过程中自动峰提取的适当参数。点击 下一步。
   注意：该步骤对来自福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的代谢物数据效果不佳，应跳过。
6. 导入设置将在 导入摘要 窗口中显示。点击 导入。
7. 提供文件名及保存 SCiLS 文件的位置。
   注意：根据文件大小，导入过程可能需要几分钟到数小时不等。
8. 完成后，将显示一个 摘要窗口。点击 打开已导入的数据集 以操作该 SCiLS 文件。
9. 在软件右上角，点击 归一化 旁边的 下拉菜单，并选择 均方根归一化。
   注意：鉴于导入的质心数据稀疏性，这是针对 timsTOF 数据最合适的归一化方法，可提供最佳可视化效果。
10. 在 文件 | 文件属性 下，将 区间宽度 设置为适当值，对于 timsTOF 数据通常为 10 - 15 ppm。通过检查该值是否覆盖平均谱图中峰的宽度，确认其合适性。
11. 通过单击并拖动或向前滚动鼠标滚轮，放大软件底部的平均谱图。
12. 将十字光标移至峰顶，左键单击鼠标滚轮，以选择要可视化的峰。
13. 按下 Ctrl + 空格键，将感兴趣的离子添加到当前离子图像列表中。
14. 点击软件右侧 离子图像 窗口底部的 另存为特征列表 按钮，保存已整理的特征列表。
15. 点击 文件 | 特征表 打开已保存的特征列表，并在安装和配置了 MetaboScape 的情况下，通过 MetaboScape 搜索可能的代谢物或聚糖鉴定结果。或者，将 SCiLS 文件转换为 .imzML 文件，导入 METASPACE（https://metaspace2020.org/）进行可能的鉴定。
    注意：有关 SCiLS Lab 功能的完整说明，请参阅 帮助 菜单中的用户手册。

结果

完成本方案后，应从同一组织切片获得三个可靠的质谱成像（MSI）数据集。在对代谢物数据的全谱进行可视化时，谱图中将主要由基质峰（m/z 157 和 315）主导，这对于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织而言是正常现象。通过将观察范围缩放至 m/z <155 以及 250 至 300 区间，可观察到大量代谢物和脂肪酸信号。图3 展示了全谱及局部放大范围的示例，突出了从组织中获得的复杂代谢物谱图。通常情况下，采用本样品制备方法，在负离子模式下可从 FFPE 组织切片中检测到 700 至 900 个代谢物峰。

PNGaseF 消化应在组织中检测到约 2-300 个糖链峰。来源于糖链、质荷比（m/z）在 1,000-2,000 范围内的峰，由于其原子组成，其小数质量应为 0.3-0.7。该小数质量有助于将糖链峰与样品制备过程中可能出现的基质簇峰区分开来。图 4A 展示了具有丰富峰的强糖链信号示例，尤其是 m/z 1,127.55、1,325.58、1,663.58 ...

讨论

从单个组织切片采集连续的质谱成像（MSI）数据需要格外注意细节。有几个步骤对于获得高质量数据至关重要。首先，若同时制备多个载玻片，需特别小心。将载玻片放入或在考普林瓶（Coplin jars）之间转移时，应避免将两张载玻片插入瓶中的同一位置，否则会导致组织表面溶剂暴露不充分，或一张载玻片刮擦掉另一张上的组织。其次，更换分析极性后，仪器必须至少平衡25分钟，这一点至关重要。在此期间，所测分子的质荷比（m/z）值会略有漂移。在平衡过程中喷洒调谐混合液（tune mix）可观察到这一现象，即质谱峰的质量会轻微变化。如果在系统未完全平衡时即开始成像，则图像的前段部分所检测到的峰将出现质量漂移，若校准恰好在此稳定期间进行，会导致校准错误。

此外，在 PNGaseF 孵育期间保持培养皿顶部温暖极为重要。在高湿度环境下孵育 2 小时的过程中，水分可能在培养皿盖上冷凝并滴落到载玻片上的组织样本上。一旦发生这种情况，组织中将出现明显的区域，基质无法结晶，且无法检测到聚糖信号。具有此类伪影的样本图像会呈现痘斑状外观。另外，基质在装入喷雾装置的样品环之前应进行过滤，以防止系统堵塞。一次性注射器滤器适用于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,5-二氨基萘	Fisher Scientific	D010125G	用于代谢物成像的MALDI基质
乙腈	Fisher Scientific	A955-4	用于基质制备的LC-MS级溶剂
α-氰基-4-羟基肉桂酸	Sigma-Aldrich	70990-1G-F	用于聚糖和肽成像的MALDI基质
碳酸氢铵	Fisher Scientific	A643-500	酶用缓冲液
磷酸铵	Sigma-Aldrich	467782-50G	成像过程中减少基质团簇的添加剂
Decloaking Chamber NxGen	Biocare Medical	N/A	用于组织抗原修复
乙醇	Fisher Scientific	04-355-223	用于基质制备和染色的LC-MS级溶剂
M5 机器人试剂喷涂仪	HTX Imaging	N/A	用于向组织施加酶和基质
甲醇	Fisher Scientific	A456-4	用于制备红磷悬浮液的LC-MS级溶剂
质谱级胰蛋白酶	Fisher Scientific	PI90058	用于蛋白质消化的酶
MTP 载玻片适配器 II	Bruker Daltonics	8235380	将显微镜载玻片插入质谱仪的适配器
NanoZoomer SQ 数字切片扫描仪	Hamamatsu Corp	N/A	用于生成染色组织的数字显微图像
Perfection V600 平板扫描仪	Epson	N/A	用于生成载玻片的光学图像以进行质谱成像数据采集
Petri-seal	Fisher Scientific	50-212-518	用于在酶消化过程中密封培养皿
PNGaseF	Bulldog Bio	NZPP550LY	用于从蛋白质上切割N-连接聚糖的酶
红磷	Sigma-Aldrich	04004-250G	适用于正负离子模式的MALDI校准物
SCiLS Lab (2025b)	Bruker Daltonics	N/A	用于质谱成像数据可视化的软件
timsTOF fleX QTOF 质谱仪	Bruker Daltonics	N/A	用于质谱数据采集
三氟乙酸	Fisher Scientific	85183	降低pH值以用于正离子模式成像的基质添加剂
Tris碱	Fisher Scientific	BP152-500	用于抗原修复的缓冲液
水	Fisher Scientific	W64	用于基质、酶和染色的LC-MS级溶剂
WypAll X60	Fisher Scientific	19-413-113	用于加湿酶孵育的吸水擦拭布
二甲苯	Fisher Scientific	X3P-1GAL	染色用透明剂