基于亮氨酸拉链的细胞分选法用于纯化双载体转导细胞

摘要

本文介绍一种从共转导的T细胞混合物中选择性纯化双转导T细胞的实验方案。该方法结合使用两种逆转录病毒载体，每种载体编码基于成对亮氨酸拉链的细胞分选技术中的一个组分，从而实现对双载体转导细胞的选择性免疫磁珠纯化。

摘要

包括嵌合抗原受体（CAR）T细胞在内的过继性T细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面已显示出显著的临床疗效，并在实体瘤治疗中展现出良好前景。尽管取得了这些成功，但仍发现多种限制T细胞免疫治疗疗效的耐药机制，包括靶抗原的缺失或弱表达、T细胞耗竭的发生以及免疫抑制性肿瘤微环境的存在。目前已开发出多种细胞工程策略以克服这些耐药机制。然而，多种耐药机制可能同时发生，因此需要联合应用多种工程策略以优化抗肿瘤活性。载体包装容量的限制阻碍了向T细胞递送大量遗传信息，使得多种工程化结构的共表达面临挑战。本文介绍一种利用两种载体共转导T细胞以编码多个转基因的实验方案，从而增加工程化功能的数量。通过共表达一种基于亮氨酸拉链的细胞分选方法（称为Zip-sort），我们实现了对已整合两种不同载体的双转导细胞进行选择性免疫磁珠纯化。

引言

CAR T细胞疗法彻底改变了B细胞白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤的治疗^1,2。目前，CAR T细胞也正在被研究用于实体肿瘤恶性疾病³。然而，已发现CAR T细胞疗法失败的多种反复出现的机制，包括CAR靶向抗原分子表达低下或丢失、T细胞功能障碍（耗竭）的发生、肿瘤微环境的主动免疫抑制，以及T细胞向肿瘤微环境迁移受限和在其中的持续性不足^3,4,5,6。尽管已针对每种CAR T细胞耐药机制设计了单独的工程化解决方案³，但由于逆转录病毒和慢病毒载体系统的遗传包装容量有限，将多种工程化功能同时引入细胞治疗产品以克服多种耐药机制仍具有挑战性⁷。

为了克服载体包装容量的限制，越来越多地采用多种载体共转导T细胞的方法。在临床前研究中，载体共转导已被用于研究逻辑门控和药物调控的T细胞工程策略^8,9,10，并在最近一项评估CD19/CD22双靶点CAR T细胞的临床试验中用于克服载体包装限制¹¹。然而，共转导会产生混合的细胞产物，其中包含单转导和双转导T细胞的不同组合；如果产物的功能依赖于两个载体所编码的组分，则可能影响其功能，同时也可能导致单转导T细胞之间的竞争¹²。

为了克服这些挑战，我们开发了一种名为 Zip-sort 的方法，该方法利用异源二聚化的亮氨酸拉链——每种亮氨酸拉链由共转导的两种载体之一表达——实现对双重转导细胞的单步免疫磁性纯化¹³。在本实验方案中，我们描述了构建包含 Zip-sort 方法的逆转录病毒载体、逆转录病毒上清液的制备与浓缩、T 细胞活化与共转导，以及双重转导细胞的免疫磁性纯化（Zip-sort）的方法。

方案

动物实验在希望之城（COH）Parvin动物研究实验室进行，实验方案#23145已获希望之城机构动物护理与使用委员会批准；同时在纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSKCC）动物饲养室进行，实验方案#99-07-025已获纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构动物护理与使用委员会批准。人源T细胞从去标识化的外周血单个核细胞（PBMCs）中分离获得，这些PBMCs来源于希望之城血液捐献中心的白细胞减少滤器，并经Ficoll-Paque法纯化，使用过程遵循实验方案#24427，已获希望之城机构审查委员会批准。所有操作均按照机构生物安全标准执行。

1. Zip-sort 载体设计

1. 选择合适的表达载体，用于对目标细胞进行基因改造。
   注意：zip-sort 方法包括分泌型拉链（secreted zippers）和捕获型拉链（capture zippers），二者分别由不同的载体表达，在细胞内配对后转运至细胞表面，从而实现对同时整合了两种载体的细胞进行选择性纯化（图 1A-D）¹³。分泌型拉链由载体 1 表达，包含一个亲和标签；捕获型拉链由载体 2 表达，可将分泌型拉链保留在细胞表面。阻断型拉链修饰包含一个共价连接的第二拉链，用于阻止分泌型拉链在细胞外发生非特异性配对。当将捕获型拉链添加到具有较长胞外结构域的蛋白质上时（通常指胞外结构域大于短铰链结构域的情况），必须使用阻断型拉链修饰，以防止细胞外的非特异性配对。
2. 从 补充表 1 和 补充文件 1 中选择一组分泌型和捕获型拉链，用于测试并构建载体。
3. 使用标准分子生物学技术将拉链序列克隆至成对的表达载体中¹³——两个载体分别编码带有亲和标签的分泌型拉链或捕获型拉链（图 1D）。
   1. 拉链构建体序列详见 补充表 1 和 补充文件 1。拉链序列已被置于多顺反子 mRNA 的 5' 端（N 末端），以增强其表达水平，从而提高分选得率。后续的转基因应位于其下游，并通过自剪切的 2A 肽段进行分隔（图 1D）。然而，先前实验表明，若能维持高水平表达，将拉链置于 3' 端同样可行。

2. 逆转录病毒的制备

1. 转染前一天，准备 Phoenix-Eco 细胞（ATCC CRL-3214，嗜鼠病毒）或 Phoenix-Eco ɑ-V β-3 细胞¹³（添加 ɑ-V β-3 旨在增强 Phoenix-Eco 的黏附能力），或 293Vec-RD114¹⁴（嗜人病毒）或 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 细胞（添加 ɑ-V β-3 旨在增强 293Vec-RD114 的黏附能力）。
   注意：本方案无需对包装细胞系进行 ɑ-V β-3 整合素的修饰，但该修饰可改善该细胞系在组织培养瓶中的黏附性，有利于逆转录病毒上清液的收集。
   1. 使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 对处于约 80% 汇合度的 T175 培养瓶中的 Phoenix 或 293Vec-RD114 细胞进行胰酶消化。
      1. 吸除培养基，用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤贴壁细胞，以去除抑制胰蛋白酶活性的血清成分，保持细胞不被扰动；加入 5 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 孵育 5 分钟。
      2. 将细胞解离后，用 5 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素/链霉素和 1% GlutaMAX 的 DMEM 培养基（称为完全 DMEM）收集细胞。
      3. 将细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在 4 °C 条件下以 340 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   2. 将离心后的细胞沉淀重悬于 10 mL 完全 DMEM 中，使用血细胞计数板计数后，将约 1.5 × 10⁶ 个 Phoenix-Eco 细胞、Phoenix-Eco ɑ-V β-3 细胞、293Vec-RD114 细胞或 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 细胞接种至 10 cm 组织培养皿中。
   3. 轻轻晃动或旋转培养皿使细胞分布均匀，并于 37 °C 培养过夜，使细胞充分贴壁。
2. 约 18–24 小时后，确认细胞汇合度达到 60%–70%，细胞状态良好，贴壁牢固，并呈现树突状突起。
3. 使用转染试剂盒（见下文，材料表）对 Phoenix-Eco、Phoenix-Eco ɑ-V β-3 细胞、293Vec-RD114 或 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 细胞进行稳定转染，转入逆转录病毒 LZRS 载体构建体（Addgene 质粒 #31601，基于 EBNA 的附加体型稳定转染）或 PB 载体构建体¹³（基于 piggyBac 转座子的基因组稳定整合，补充文件 1）。
   1. 每个转染反应中，在微量离心管中将 2 µg LZRS 载体 DNA 或 PB 载体 DNA 与 16 µL 增强试剂加入 300 µL EC 缓冲液中混合。
   2. 若需实现 PB 载体构建体的稳定整合，还需加入 1 µg 高活性 piggyBac 转座酶载体 pCMV-hyPBase¹⁵（Sanger 研究所）。
   3. 轻柔涡旋 5 秒，室温孵育 5 分钟；加入 20 µL 转染试剂，涡旋 10 秒，室温再孵育 10 分钟，以形成 DNA 胶束复合物。
   4. 向管中加入 300 µL 完全 DMEM，用移液器反复吹打充分混匀，然后使用 1 mL 移液器将胶束悬液逐滴加入已接种的包装细胞中。
   5. 轻轻摇晃培养皿，确保胶束均匀沉积。24 小时后，用胰酶消化转染细胞，并通过流式细胞术评估逆转录病毒编码构建体的初始表达水平。
   6. 将消化后的细胞转移至含 20 mL 完全 DMEM 的 T75 培养瓶中，根据载体所含抗生素抗性基因，加入 2 µg/mL 嘌呤霉素或 10 µg/mL 杀稻瘟菌素，以筛选转染成功的细胞。当细胞汇合度达到 70%–75% 时，进行胰酶消化并转移至含 40 mL 完全 DMEM 的 T175 培养瓶中。在扩增包装细胞系过程中，持续在培养基中维持抗生素筛选。
   7. 当细胞汇合度达到 80%–85% 时，再次进行胰酶消化，并通过流式细胞术确认构建体的表达情况。使用冻存液（50% 完全 DMEM、40% FBS、10% DMSO）冻存部分细胞，同时将细胞以 1:10 至 1:12 的比例传代至两个 T175 培养瓶中，每瓶加入 40 mL 完全 DMEM。
4. 当在 T175 培养瓶中培养的已完全筛选的稳定包装细胞系达到 80%–85% 汇合度时，收集并浓缩逆转录病毒上清液。
   1. 首次收获前 24 小时，将 T175 培养瓶中的培养基更换为 40 mL 新鲜的完全 DMEM（不含抗生素），以去除培养基中的抗生素。
   2. 在更换培养基 24 小时后，收集上清液并通过装有 0.45 µm 聚偏二氟乙烯（PVDF）滤膜的 50 mL 注射器过滤，收集至 50 mL 圆锥形离心管中。
   3. 向滤过的上清液中加入 5× 聚乙二醇（PEG）浓缩液（含 40%（w/v）PEG 8,000 分子量和 2.4%（w/v）NaCl），反复倒置混匀数次，确保充分混合（PEG 沉淀步骤）。
   4. 向原始收获的 T175 培养瓶中重新加入 40 mL 完全 DMEM，继续培养 24 小时，并连续两天每天收集一次病毒上清液，共再收集两天。
   5. 在 4 °C 条件下沉淀病毒 1–2 天。沉淀的病毒将呈现絮状、漂浮或沉降的物质。
   6. 将 PEG 沉淀后的病毒悬液在 4 °C 条件下以 2,100 × g 离心 15 分钟，弃去未沉淀的上清液。
   7. 将每次 PEG 沉淀所得的病毒沉淀重悬于 500 µL RPMI 培养基中，该培养基补充有 10% FBS、1% 青霉素/链霉素、1% GlutaMAX、1% 丙酮酸钠、1% 非必需氨基酸和 0.1% β-巯基乙醇（称为完全 RPMI）。
   8. 重悬后的病毒可立即用于转导，或转移至微量离心管中于 −80 °C 保存。

第3天：小鼠T细胞富集与激活

1. 用含有 2 µg/mL 抗-CD3（克隆 145-2C11）和 2 µg/mL 抗-CD28（克隆 37.51）的 PBS 溶液以每孔 1.5 mL 的量包被经组织培养处理的 6 孔板。在 37 °C 下孵育 2 小时。
2. 从供体小鼠中取出脾脏，通过 40 µm 滤膜将细胞分散，并在完全 RPMI 培养基中收集脾细胞。在 4 °C 下以 340 ×g 离心 5 分钟，沉淀脾细胞。
   注意：本研究中使用的供体小鼠为 6 至 8 周龄的雌性 BALB/cJ 小鼠。
3. 弃去上清液，轻轻涡旋沉淀，加入 1 mL 红细胞裂解缓冲液，用移液器吹打混匀 3 至 5 次，在室温下孵育 1 分钟，然后加入 10 mL 完全 RPMI 培养基终止反应，并在 4 °C 下以 340 ×g 离心 5 分钟，沉淀细胞。
4. 弃去上清液，加入 800 µL 含 0.5% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS（称为 MACS 缓冲液），再加入 200 µL 小鼠 CD19 微珠。吹打混匀后在 4 °C 下孵育 15 分钟。
5. 每只小鼠脾脏准备一个 LD 柱。将 LD 柱固定在 MACS 分离器上，在其下方放置一个 15 mL 圆底离心管以收集 CD19 耗竭的脾细胞。用 2 mL MACS 缓冲液润洗柱子。
6. 与 CD19 微珠孵育后，用 5 mL 冷 MACS 缓冲液洗涤细胞，在 4 °C 下以 340 ×g 离心 5 分钟，弃去上清液。将细胞重悬于 1 mL MACS 缓冲液中，然后加至 LD 柱中。待悬液完全流过柱子后，依次用 1 mL 和 2 mL MACS 缓冲液洗涤柱子。
7. 收集流穿液中的 CD19 耗竭脾细胞用于后续实验。弃去 LD 柱，将 CD19 耗竭脾细胞在 4 °C 下以 340 ×g 离心 5 分钟沉淀。弃去上清液，将细胞重悬于 18 mL 完全 RPMI 培养基中，并加入重组人 IL-2（rhIL-2），使其终浓度为 50 IU/mL。
8. 弃去抗体包被 6 孔板中的抗体溶液。将重悬的 B 细胞耗竭脾细胞以每孔 3 mL 的量加入抗体包被的 6 孔板各孔中。

第1天：小鼠T细胞的逆转录病毒感染

1. 在未经组织培养处理的6孔板中，每孔加入含2 µg/mL抗CD3（克隆号145-2C11）、2 µg/mL抗CD28（克隆号37.51）和20 µg/mL RetroNectin的PBS溶液1.5 mL进行包被。
   注意：根据制造商建议，在RetroNectin包被过程中应使用未经组织培养处理的培养板。
2. 37 °C孵育2小时，弃去包被液或保存以备重复使用（最多可重复使用一次）。每孔加入含2% BSA的PBS溶液1 mL进行封闭，37 °C孵育10分钟，随后弃去封闭液。
3. 同时，将PEG沉淀的病毒上清液在37 °C水浴中解冻。
   注意：由T175培养瓶制备的每种共转导的PEG浓缩逆转录病毒上清液500 µL，足以在每孔中对最多2 × 10⁶个活化T细胞进行双转导，双转导效率可达>20%。
4. 根据实验设计，将共转导病毒上清液加入6孔板各孔中，用完全RPMI培养基和50 IU/mL重组人IL-2（rhIL-2）补足终体积至至少2 mL，于2,100 × g、32 °C离心1小时。
5. 每孔加入0.5–2 × 10⁶个活化T细胞，于340 × g、32 °C离心10分钟。若细胞未充分贴壁，可在32 °C再次以340 × g离心10–20分钟。随后于37 °C过夜孵育。

5. 第2天：载体表达评估及可选的再次转导

1. 从转导板中每种条件下裂解100–200 µL贴壁细胞用于流式细胞术。用户应为每个单独的载体和亲和标签确定一个可被流式细胞术检测的标记物，并利用这些标记物通过流式细胞术评估单载体转导效率、双载体转导效率以及亲和标签的表达情况。
2. 按以下方法对共转导细胞进行流式细胞术分析。
   1. 设置采集参数轴，以显示载体1和载体2的报告基因信号（图1C）。
   2. 针对载体1和载体2表达的四个象限，分别绘制亲和标签拉链染色（例如FLAG或CD34）的直方图，以确认亲和标签染色仅限于共表达载体1和载体2转导报告基因的细胞。
3. 若细胞的双转导效率足够高，能够满足下游实验所需的细胞数量（通常双转导率 ≥ 20%），则执行以下步骤。
   1. 使用含2 µg/mL抗CD3和抗CD28抗体的PBS包被初始转导T细胞系所用孔数的两倍孔板，以维持T细胞刺激。37 °C孵育2小时。
   2. 将细胞转移至新孔中，加入含50 IU/mL重组人IL-2（rhIL-2）的完全RPMI培养基（以维持T细胞刺激）。
4. 若细胞双转导效率不足，无法满足下游实验所需的细胞数量（通常< 20%双转导），则执行以下步骤。
   1. 采用与第1天相同的方案重新转导，但将初始使用的孔数加倍，以适应T细胞扩增的需求。
   2. 37 °C过夜孵育。24小时后重复流式细胞术检测。
      注意：载体编码的构建体（包括亲和标签拉链）在初次转导后第2天表达达到峰值。

第6天：T细胞免疫磁珠分选（Zip-sort）

1. 将使用相同共转导条件产生的细胞孔中的细胞收集至15 mL锥形管中。
2. 以 340 x g 离心细胞 g 4 °C下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于500 µL MACS缓冲液中，每1 × 10⁷个细胞加入30 µL微珠（DYKDDDDK（FLAG）或人CD34），混匀后进行孵育⁷ 4 °C 下孵育细胞 30 分钟。
3. 孵育后，用 5 mL 冷 MACS 缓冲液洗涤细胞。在 340 x g 4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL MACS 缓冲液中。
4. 使用LS柱如下所述对转导的T细胞进行阳性筛选。
   1. 用 2 mL MACS 缓冲液润洗色谱柱。将细胞悬液加入置于磁力架上的 LS 柱中。
   2. 用MACS缓冲液依次洗涤（1 mL、2 mL、3 mL）。将色谱柱从磁力架上取下，向柱中加入5 mL完全RPMI培养基，并插入细胞推杆，以洗脱柱上滞留的细胞。
   3. 在15 mL锥形管或T25培养瓶中收集细胞。将细胞浓度调整至0.5 × 10⁶ cells/mL⁶ 细胞/mL，加入完全RPMI培养基及50 IU/mL rhIL-2。
   4. 如果从 < 20% 双转导，可选将细胞洗脱至第二根LS柱进行连续阳性筛选，以提高分选后纯度。
5. 在 T25 或 T75 培养瓶中培养 CAR T 细胞，密度约为 0.5 x 10⁶ 每毫升完全RPMI培养基含50 IU重组人IL-2。
6. 可选：如果T细胞将用于 体内 实验时，可考虑在1 µM达沙替尼中进行培养，以减轻CAR T细胞在初始培养期间因持续性信号激活所致的功能障碍^13,16.
7. 按照上述步骤 2.1 和 2.2 对分选前和分选后的 T 细胞进行流式细胞术分析，以评估 Zip-sort 分选后的得率和纯度（双转导细胞百分比）。
   产率 = 100 × 分选前群体中双转导细胞总数 / 分选后回收的双转导细胞总数

第7天：T细胞培养的继续

1. 向整个培养体系中加入新鲜的完全RPMI培养基和50 IU/mL rhIL-2，以维持T细胞浓度在0.5-1 × 10⁶ cells/mL。
2. 可选：若T细胞将用于in vivo实验，则加入新鲜的1 µM达沙替尼（dasatinib）。

第8天：Zip分选T细胞的表征

1. 可选：每种条件准备 100–200 µL T 细胞悬液，使用流式细胞术检测经抗体标记的 CAR 或由 Zip-sort 载体编码的其他蛋白产物。
2. 执行 体外 或 体内 CAR T细胞实验
3. 可选：如果T细胞将用于 体内 实验中，用缓冲液洗涤细胞以去除达沙替尼。根据机构指南，将细胞重悬至适用于眶后或尾静脉注射的浓度。

第9天：人T细胞的纯化与刺激

1. 将一管冻存的人外周血单个核细胞（PBMCs）迅速在水浴中解冻（或使用 freshly isolated PBMCs）。将解冻后的 PBMCs 加入含有 5 mL MACS 缓冲液的 15 mL 圆底离心管中，取部分细胞用于计数，并在 4 °C 下以 340 ×g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
2. 弃去上清液，用 MACS 缓冲液重悬细胞（每 1 × 10⁷ 总细胞使用 40 µL 缓冲液）。按照生产商说明书，使用人 Pan T 细胞分离试剂盒进行 T 细胞分离。
   1. 简要步骤：每 1 × 10⁷ 总细胞加入 10 µL Pan T 细胞生物素标记抗体混合物，在 4 °C 下孵育 5 分钟。
   2. 每 1 × 10⁷ 总细胞加入 30 µL MACS 缓冲液，再加入 20 µL Pan T 细胞 MicroBead 混合物（每 1 × 10⁷ 总细胞）。
   3. 在 4 °C 下孵育 10 分钟，用 MACS 缓冲液将细胞悬液体积补至至少 500 µL。
   4. 使用 LS 柱进行磁性细胞分选，收集流出液，其中含有富集的（未接触的）T 细胞。
3. 计数 T 细胞得率，并在 4 °C 下以 340 ×g 离心 5 分钟使细胞沉淀。弃去上清液。将人 T 细胞重悬于完全 RPMI 培养基中，浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/mL，并加入 50 IU/mL 的重组人 IL-2（rhIL-2）。
4. 向含有 2 mL PBS 的 15 mL 圆底离心管中加入所需体积的人 Dynabeads T 激活剂 CD3/CD28（每 1 × 10⁶ 个细胞使用 25 µL 磁珠，磁珠与 T 细胞比例为 1:1），在 4 °C 下以 340 ×g 离心 5 分钟以洗涤磁珠。弃去上清液。
5. 将重悬的 T 细胞与洗涤后的磁珠混合，转移至 T25 培养瓶中进行培养。

10. 第3天：人T细胞的逆转录病毒感染

1. 在非组织培养用6孔板中，每孔加入含20 µg/mL RetroNectin的1.5 mL PBS进行包被。
2. 37 °C孵育2小时。弃去包被液或保存以备重复使用（可重复使用一次）。
3. 同时，在37 °C水浴中解冻用于共转导的PEG沉淀病毒上清液。
4. 根据所需的转导条件，将共转导病毒上清液加入RetroNectin包被的6孔板各孔中，计数并加入所需数量的T细胞（通常为0.5–2 × 10⁶ 个T细胞/孔），用含rhIL-2的完全RPMI培养基补至3 mL，于32 °C、340 × g离心45分钟。
5. 24小时后，将T细胞以1 × 10⁶ 个细胞/mL的密度维持在含50 IU/mL rhIL-2的完全RPMI培养基中。
6. 若维持所需T细胞浓度所需的体积超过6孔板的容量，需将细胞从6孔板转移至T25培养瓶中。

11. 第6天：使用Zip-sorting技术分选人源CAR T细胞

1. 在进行基于亲和标签的免疫磁珠纯化（Zip-sort）之前，需从T细胞中去除Dynabeads，以避免Dynabeads在磁性柱中可能的滞留；同时在进行流式细胞术分析前也应去除，以防对流式检测造成潜在干扰。
2. 短暂涡旋以解离Dynabeads，将T细胞转移至15 mL锥形管中，并插入Dynabead磁力架。将管子倒置数次，静置5分钟，直至Dynabeads完全结合至磁铁一侧。
3. 使用移液器小心吸取不含Dynabeads的细胞悬液，转移至新的15 mL锥形管中。计数回收的细胞浓度，并根据体积计算总细胞得率。
4. 按照上述小鼠转导方案，通过流式细胞术检测CAR表达水平。
5. 在4 °C条件下，以340 ×g离心5分钟沉淀细胞，随后在500 µL MACS缓冲液中重悬，每1 × 10⁷个细胞加入30 µL微珠（DYKDDDDK（FLAG）或人CD34）进行孵育。
6. 按照步骤6.3–6.5操作，获得经Zip-sort分选的人源CAR T细胞。
7. 使用台盼蓝排斥法通过血细胞计数板检测分选后细胞的活力。分选前细胞活力预期应> 80%。分选后活力可能暂时低于80%，但在4–5天内可恢复。
8. 在含50 IU/mL重组人IL-2的完全RPMI培养基中扩增人T细胞，并维持细胞浓度约为1 × 10⁶ cells/mL。分选后的T细胞扩增与维持可根据使用者的标准扩增及应用方案进行调整。
9. 通常在第8天之后，使用T细胞进行后续实验检测，如杀伤实验、细胞因子分泌检测以及体内功能分析等。

结果

在本实验方案中，我们展示了使用两种不同的逆转录病毒载体双重转导T细胞后的共转导及单步免疫磁珠筛选方法（称为Zip-sort，图1）¹³。每个载体编码一个异源二聚化亮氨酸拉链对中的一个组分，该拉链对选择性地展示在双重转导T细胞的表面（图1A）。载体1表达可分泌的亲和标签拉链，其在细胞内与由载体2表达的膜结合捕获拉链配对。本文评估了具有短铰链间隔区的Zip-sort捕获拉链设计（图1A-B）以及具有较长延伸间隔区的设计，如Thy1.1、EGFR、PD-1和CD200R（图1B）。具有短铰链间隔区的捕获拉链不会与可分泌拉链在胞外显著配对。然而，对于具有延伸间隔区的捕获拉链，我们发现有必要进一步设计阻断型拉链修饰，以防止非特异性的胞外拉链配对（图1B-D...

讨论

本文描述了一种用于生成Zip-sort载体组合、制备逆转录病毒、共转导小鼠和人T细胞以及通过免疫磁珠法纯化双转导细胞（Zip-sort）的实验方案。上述方案已针对逆转录病毒载体以及小鼠和人T细胞进行了优化。尽管Zip-sort方法尚未在其他载体系统中进行评估，但原则上，其他载体系统也可能兼容，包括慢病毒¹⁷、转座子¹⁸或位点特异性同源定向修复模板整合¹⁹，前提是能够实现足够高的表面表达水平。对于需要更大包装容量的用户，可根据各载体系统报道的最大载荷能力⁷，考虑采用这些替代性包装策略。我们发现，当亲和标签拉链在细胞表面以低密度或高密度表达时，Zip-sort方法均能获得高度纯化的细胞，但高产量分选需要亲和标签在细胞表面高密度表达。Zip-sort载体应优化设计，将拉链序列置于多顺反子转录本中高表达的位置，因为由2A肽分隔的多个转基因序列中，外源基因的位置可能影响其表达效率²⁰。应特别注意确保多顺反子mR...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
肿瘤细胞系相关
C1498	ATCC	TIB-49
BM185-CD19	参考文献13
BM185-CD20	参考文献13
4D-Nucleofector核心单元	Lonza	AAF-1003B
4D-Nucleofector X单元	Lonza	AAF-1003X
Lonza SF缓冲液试剂盒
病毒生产
10 cm组织培养（TC）处理细胞培养皿	Corning	353003
50 mL锥形管	Thermo Scientific	339652
Effectene	Qiagen	301425
pENTR1a质粒	Addgene	17398
LZRS-Rfa	Addgene	31601
PB MMLV puro（小鼠T细胞病毒载体）	参考文献13
PB SFG blastR（人T细胞病毒载体）	参考文献13
pCMV-hyPBase	Sanger研究所
Phoenix-Eco	ATCC	CRL-3214
Phoenix-Eco alpha V beta 3	参考文献13		经修饰的Phoenix-Eco，可更高效地黏附于培养瓶
PB-EF1a内含子WPRE mCD4 P2A MCS整合素beta 3	参考文献13		可选，用于增强包装细胞系对培养瓶的黏附能力
PB-EF1a内含子WPRE hCD8a 2A整合素alpha V	参考文献13		可选，用于增强包装细胞系对培养瓶的黏附能力
Biovec-RD113	Biovec Pharma
Biovec-RD113 alpha V beta 3	Biovec Pharma	本研究，转染了alpha V beta 3载体
Millex-HV注射器滤器（0.45 μm）	Millipore	SLHVR33RRS
聚乙二醇8000（PEG）	Fisher Scientific	BP233-1
氯化钠	Fisher Scientific	S271-500
嘌呤霉素	Santa Cruz Biotech	sc-108071B
杀稻瘟菌素	Santa Cruz Biotech	sc-204655
T175 TC处理培养瓶	Corning	353112
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Gibco	25200056
细胞培养基
2-巯基乙醇	Gibco	21985023
RPMI1640	Gibco	11-875-119
DMEM	Gibco	11-965-118
FBS	Sigma	F2442
Glutamax	Gibco	35050061
MEM非必需氨基酸	Gibco	11140050
青霉素-链霉素	Gibco	15140-163
丙酮酸钠	Gibco	11360070
T细胞刺激/转导
15 mL锥形管	Thermo Scientific	339650
6孔非TC板	Gibco	351146
6孔TC板	Gibco	353046
抗CD19微珠	Miltenyi Biotec	130-121-301
InVivoMab抗小鼠CD28（克隆37.51）	BioXCell	BE0015-1
InVivoPlus抗小鼠CD3ε（克隆145-2C11）	BioXCell	BE0001-1
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A4737-1G
达沙替尼	Cayman Chemical	11498
Dynabeads人T细胞激活剂CD3/CD28	Gibco	11131D
EDTA（0.5 M），pH 8.0，无RNase	Invitrogen	AM9260G
HybriMax红细胞裂解缓冲液	Sigma	R7757-100ML
LD柱	Miltenyi Biotec	130-042-901
人Pan T细胞分离试剂盒	Miltenyi Biotec	130-096-535
Dynamag-15磁力架	Invitrogen	12301D
磷酸盐缓冲液（1X）	Corning	21040CV
Retronectin	Takara	T100B
rhIL-2	Proleukin（阿地白介素）
T25细胞培养瓶	Corning	353109
Zip-sort
µMACS DYKDDDDK分离试剂盒	Miltenyi Biotec	130-101-591
人CD34微珠试剂盒	Miltenyi Biotec	130-046-702
QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
LS柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
流式细胞术与细胞监测
抗CD90.1 Thy1.1 APC（克隆OX-7）	BD Biosciences	货号# 561409；RRID:AB_10683163
抗V5标签抗体（克隆4C12E11）iFluor 488	GenScript	货号# A01803，RRID:AB_2925231
Myc PE	Cell Signaling Technology	货号# 2233；RRID:AB_823474
Myc Alexa 647	Cell Signaling Technology	货号# 2233；RRID:AB_823474
APC抗DYKDDDK标签（克隆L5）	BioLegend	货号# 637307；RRID:AB_2561496
小鼠抗CD34抗体，Alexa Fluor 647（克隆QBEnd/10）	Novus Biologicals	货号# NBP2-34713AF647；RRID:AB_2925234
Streptag FITC	GenScript	货号# A01736；RRID:AB_2622221
Incucyte SX5	Sartorius
Penteon流式细胞仪	Agilent