缩小规模，影响巨大：简化高效的高通量重组腺相关病毒生产

摘要

尽管重组腺相关病毒（rAAV）载体在基因递送中被广泛应用，但其生产仍面临显著挑战。本方案概述了使用贴壁细胞和悬浮细胞的微规模和小规模生产方法。这些方法简化了载体的制备、纯化和优化过程，从而加速了临床前研究，并推动基因治疗研发进程。

摘要

近年来，重组腺相关病毒（rAAV）载体已成为基因治疗应用中的领先平台。然而，其繁琐的生产与纯化过程仍是药物开发中的主要瓶颈。无需耗时费力的纯化步骤、可实现高通量小规模rAAV生产的策略，为加速临床前研究和早期治疗方案筛选提供了有价值的替代方案。该方法能够快速生成多种rAAV变体或治疗性构建体，其质量足以满足初步 体外 和 体内 评估。本方案介绍了两种根据细胞类型和生产规模区分的方法：微规模和小规模重组腺相关病毒（rAAV）生产。微规模生产采用6孔板格式，使用贴壁培养的人胚胎肾（HEK）293T细胞（微-6孔），而小规模生产则在24孔板中利用悬浮细胞进行（小-HT24）。通过这些方法生成的载体将接受后续分析，以优化细胞培养条件和/或评估目的基因的生物学活性。关键的分析指标包括载体基因组滴度测定（vg/mL）、衣壳滴度测定（vp/mL）、蛋白质印迹分析以及细胞转导实验。此外，通过小规模生产并使用亲和树脂半纯化的载体将与中等规模纯化的制备物进行比较 通过 氯化铯密度梯度。本文所述的简化方法在优化细胞培养参数、筛选过程中识别先导候选物（例如优化的转基因表达盒或更优的腺相关病毒衣壳）以及增强转基因表达方面展现出显著潜力。总体而言，所呈现的工作流程有助于构建一个稳健且高效的基因治疗研发迭代平台，可便捷地在任何研究实验室中实施。

引言

药物研发是一个复杂且资源密集型的过程，需要整合来自靶点识别、临床前验证和临床试验等各个阶段的高质量数据¹。为应对研发周期更短、成本更低的日益增长的需求²，制药行业越来越多地采用高通量（HT）小规模检测方法，并结合先进的人工智能（AI）技术，作为现代研发策略的核心组成部分^3,4,5。与传统方法相比，HT检测能够在更短的时间和更低的成本下，快速筛选和评估大量候选药物或检测变量^5,6。

在基因治疗应用中，尤其是使用腺相关病毒（AAV）载体时，高昂的生产成本和漫长的制造周期构成了重大挑战⁷。该开发流程首先需要制备用于转染的质粒材料，随后进行细胞培养，使其达到足以生产病毒载体的高密度。转染后，需经过两到五天的孵育期方可收获，最后通过纯化和批次表征完成整个流程^8,9。总体而言，这一工作流程可能耗时长达一个月，且在使用亲和层析柱或梯度超速离心时，通常只能并行处理有限数量的样品^9,10,11,12。

鉴于对小规模、迷你规模或微规模腺相关病毒（AAV）生产方案的需求，该领域已开发出多种在小型实验室规模下制备重组腺相关病毒（rAAV）的方法。这些方法通常采用多个15 cm培养皿培养贴壁细胞^13,14，或使用50–2000 mL¹⁵的摇瓶进行悬浮培养。过去常采用梯度超速离心法（如碘克沙醇¹⁶、氯化铯（CsCl）¹⁷或蔗糖梯度¹⁸）进行AAV纯化。这种成本低廉且不受血清型限制的方法非常适合实验室规模的rAAV制备，但由于其操作繁琐且超速离心机通量有限，难以适用于高通量应用^19,20。

不断提高的通量需求推动了对缩小规模rAAV生产的替代方法的探索。使用贴壁细胞时，已研究过6孔^13,21,22、96孔²³甚至384孔板²⁴等格式。最近，悬浮细胞因其更好的可扩展性以及所制备载体具有相当甚至更高的效价而被采用⁸。

然而，在培养体积小于 15 mL 的悬浮细胞中进行高通量 rAAV 生产仍然是一个专业领域，已发表的方案十分有限^7,25,26。大多数研究集中于较大体积的培养，以获得足以满足下游应用需求的产量^8,9,27，但与贴壁细胞类似，微型化体系可显著减少资源消耗和处理时间，从而满足该领域的关键需求。重要的是，微型和微尺度方案通常使用"粗裂解物"，即含有病毒载体颗粒但未经纯化的细胞培养收获物，用于后续的表征与分析。

本研究概述了两种分别利用贴壁细胞和悬浮培养细胞的实验方案（图1）。由贴壁培养的HEK293T细胞产生的粗制重组腺相关病毒（rAAV）裂解液可直接用于后续应用，例如靶细胞的转导。相比之下，由悬浮培养细胞产生的rAAV需通过高通量亲和树脂纯化进行进一步处理。via 这些方法的开发旨在提高产量、评估载体质量并监测目的基因表达，同时最大限度地减少昂贵试剂和材料的消耗。本文结果显示，根据具体应用范围的不同，粗制裂解液（来自贴壁细胞）和亲和纯化产物（来自悬浮细胞）均适用。此外，本研究还从产量、纯度以及在人源神经元共培养体系中的转导效率等方面，将使用亲和树脂获得的rAAV与采用传统氯化铯超速离心法纯化的rAAV进行了直接比较。

在基因治疗药物研发中采用高通量、小规模检测方法是一项不可或缺的进步，可加速创新进程，弥合科学发现与治疗现实之间的差距。这些方法不仅能够降低研发成本和时间，还可实现多种条件的平行测试，最终促进变革性疗法的高效开发。

方案

1. 在贴壁细胞中进行微孔-6孔板规模的重组腺相关病毒载体生产

注意：微尺度6孔板rAAV生产方法改编自Fakhiri等人先前发表的方案²¹。

1. HEK293T 细胞的接种与转染
   1. 解冻一管 HEK293T 细胞²⁸ 在37℃水浴中 °C.
   2. 将细胞转移至T175培养瓶中含30 mL贴壁细胞培养基的培养液中，并在37℃下维持于含10%胎牛血清（FCS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中 °C 和 5% CO₂₂.
   3. 每2-3天传代一次HEK293T细胞：吸除细胞培养基，小心加入10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
      注意：本方案中仅使用传代次数低于15代的细胞，以确保细胞的完整性和健康状态，这对重组腺相关病毒（rAAV）的生产具有直接影响。
   4. 加入 2 mL 0.025% 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA），于 37℃ 培育 2 分钟 °C（或直至细胞脱落）。
   5. 通过加入20 mL新鲜培养基，并用25 mL移液管将细胞重悬于培养基中以终止反应。根据细胞融合度，可将细胞在24 mL高糖DMEM培养基中按1:10或1:20比例稀释。为获得足够的转染细胞密度，接种7 × 10⁶ T175 培养瓶中的 HEK293T 细胞
   6. 72 小时后，37 °C，用胰蛋白酶消化法收集细胞（如步骤1.1.3-1.1.5所述），重悬于20 mL培养基中，并进行细胞计数。
      注意：细胞计数可采用多种方法，具体取决于所需的准确性、通量及可用设备。主要使用两种方法：人工计数（血细胞计数板）和自动细胞计数仪。本方案采用全自动图像法细胞分析仪，用于测定细胞活力、细胞密度和聚集体比例等关键细胞参数。
   7. 以 0.5 的密度接种细胞 × 10⁶ 6孔板中每孔的细胞数。为使细胞分布均匀，轻轻摇动培养板并将其放入CO₂培养箱中。₂ 培养箱
   8. 24小时后，细胞融合度达到60-70%，可进行三重转染。
   9. 每孔加入90 µ升无血清培养基，共2.6 µg 质粒 DNA，包括 pTransgene、pRep/Cap 和 pHelper，摩尔比为 1:1:1。
   10. 在第二个管中，加入 5 µL 的聚乙烯亚胺（PEI）加入至 90 µ转染前立即加入 L 无血清培养基。
   11. 将两种溶液混合后，涡旋混匀，并在室温（RT）下孵育10分钟。
   12. 将转染混合物逐滴加入每孔中。轻轻摇动培养板，然后放回培养箱中。
       注意：转染后可进行换液操作，但本实验未将其作为常规步骤，因为细胞在整个实验过程中保持了良好的存活率。
2. 细胞的收获与裂解
   1. 转染后72小时，小心吸去培养板中的细胞培养基。
   2. 通过加入 500 μL 胰蛋白酶，使细胞脱离培养皿 µ将 PBS 各 1 L 加入每个孔中，并小心地用移液器吹打混匀。
   3. 将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中。
   4. 根据制造商说明书，手动或自动测定细胞活力和密度。
   5. 转移 50 µ将悬浮液中的 L 转移至 96 孔 U 型底板，通过定量报告基因阳性细胞群来测定转染效率 通过 流式细胞术
      ​注意：建议始终平行进行转染对照实验。 即，转染1-2个孔，使目的基因携带荧光蛋白（如绿色荧光蛋白（GFP）、mCherry等），以监测平板上的转染效率。未转染细胞的孔作为阴性对照。
   6. 将剩余的细胞悬液在800 × g下离心 × g 在室温下离心10分钟，使细胞沉淀，这些细胞含有大部分产生的载体。
   7. 弃去上清液，将细胞重悬于 100 µL 的 PBS 中。细胞悬液可在 -80 °C.
      注意：为从收获的细胞中获得粗裂解液，请采用以下所述的两种方法之一。
   8. 在第一种方法中，细胞可经历五个冻融循环，每个循环5分钟，使用37 °C 预热的水浴和液氮。每轮循环之间将样品短暂涡旋振荡 2–3 秒。
   9. 该方案中第二个且主要使用的方法是超声处理。将细胞悬液转移至薄壁聚合酶链式反应（PCR）板或管中，并置于4℃ °在水浴超声仪中。
      1. 以25%的振幅（强度）对样品进行超声处理，总时长3分钟，每次开启30秒后关闭30秒，循环进行。
   10. 超声处理后，使用台式离心机（16,100 ×g）离心收集细胞 × g 4℃下离心10分钟 °C）去除细胞碎片，获得无细胞的载体悬液。
   11. 将上清液转移至 1.5 mL 离心管中，并用移液器吸取 10 µ将每份样品各 L 加入低吸附96孔板中，用于数字滴定（dd）PCR或数字（d）PCR分析。
   12. 将试管和96孔板于-80℃保存 °C，直至进一步使用。
3. 使用粗裂解物转导HEK293A细胞
   注意：HEK293A 细胞可能不适用于所有 AAV 血清型。为确定合适的细胞系，请查阅 SPIRIT 等数据库。²⁹ （参见 材料表 访问 SPIRIT 数据库的链接）或相关原始研究论文^30,31.
   1. 在转导前一天，将HEK293A细胞以1.5×10⁴个细胞/孔的密度接种于三块96孔板中 × 10⁶ 每板细胞数
   2. 第二天，混合 10 µ将产生的载体用不同体积的PBS稀释，制备1:2、1:10和1:100的稀释液。
   3. 使用多通道移液器，在96孔板中对细胞进行技术重复三次的转导。
   4. 将细胞与rAAVs共同孵育72小时，期间不更换培养基。之后根据所表达的转基因进行相应的下游实验，如蛋白水平检测、荧光蛋白表达的流式细胞术分析、基因敲低/敲除分析等。
   5. 对于本方案中进行的标准流式细胞术，吸除培养基，并通过加入25 µ0.025% 胰蛋白酶/EDTA 溶液
   6. 在37℃孵育 °3 分钟
   7. 通过加入175 μL终止反应 µ每孔加入1%牛血清白蛋白（BSA）PBS溶液1 L。
   8. 使用 100 µ用于流式细胞术分析的细胞悬液。

2. 悬浮细胞中rAAV载体的mini-HT24生产

注意：在 mini-HT24 体系中，与之前所述的 micro-6-well 生产方式不同，重组腺相关病毒（rAAV）载体的制备采用悬浮细胞。由于在相同培养体积内可达到更高的细胞密度，悬浮培养能产生更多的 rAAV。本方案采用 24 深孔板格式。为获得某些应用所必需的更纯净产物（粗裂解液不适用时），使用 AAVX 亲和树脂对粗细胞裂解液进行高通量纯化（参见讨论部分）。

1. 悬浮细胞在24深孔板中的培养与三重转染
   1. 将一管悬浮病毒生产细胞（VPC）在37℃水浴中解冻 °C. 传代细胞不超过30次，以确保所生产载体的一致质量。
   2. 将细胞转移至装有30 mL悬浮培养基的摇瓶中，在维持培养条件下培养2–3天：37 °C，8% CO₂₂，95% 湿度，140 rpm（摇床平台半径 25 mm）。
   3. 在培养2-3天后测定活细胞密度（参见步骤1.1.6的注释）。继续传代和扩增细胞，直至达到腺相关病毒（AAV）生产所需的活细胞数量。
      ​注意：以可存活的密度传代培养细胞 > 4 × 10⁶ 细胞/mL 和 < 6 × 10⁶ 个/mL，或根据所用特定细胞系参照试剂盒说明书建议的密度接种。以6×10⁵个活细胞/mL的密度接种 × 10⁵ 细胞/mL，培养3天，分传或3 × 10⁵ 细胞/mL，培养4天。按照制造商说明书进行传代。
   4. 接种 3 × 10⁶ 2.5 mL 每孔加入至 24 孔深孔板中，使细胞密度为 cells/mL，并用无菌膜盖密封。
   5. 为每种rAAV构建体制备三重转染混合物，步骤如下：
      1. 将生产质粒（pHelper、pRep/Capsid、pTransgene）按1:1:1的摩尔比配制DNA混合物，每1 × 10⁶ 活细胞
      2. 在悬浮培养基中配制混合物，终体积为待转染培养物体积的2.5%。
      3. 在悬浮培养基中配制PEI混合物，终体积为待转染培养液体积的2.5%。PEI的终质量为每1 ng DNA使用1 ng PEI。
      4. 将PEI混合液的全部体积转移至对应的DNA混合液中，使转染混合液的总体积达到培养液体积的5%。
      5. 用移液器上下吹打10次以混匀。
         注意：孵育结束后，切勿涡旋振荡转染混合物，以免破坏孵育过程中形成的PEI-DNA复合物³².
      6. 室温孵育10分钟。
   6. 将转染混合物逐滴加入对应孔中，同时轻轻振荡深孔板。
   7. 使用无菌透气的人造纤维膜密封培养板，并额外加盖相应的膜盖，以尽量减少蒸发。
   8. 确保将培养板置于合适的深孔板摇床托盘上，并牢固固定。
   9. 将细胞在 37 °C，8% CO₂₂，95% 湿度和 225 rpm 振荡培养 72 小时。
      注意：不同的深孔板规格需要分别评估摇床转速，以实现高效的气体交换，并使细胞在悬浮培养过程中保持均匀，避免细胞随时间沉降至孔底。这需要根据各实验室的设备配置、实验条件以及所用的细胞系进行初步测试。尤其需考虑摇床振幅、板型规格和孔底形状，以维持细胞悬浮液的均匀性，防止细胞沉降。
2. 收获与裂解
   1. 通过将每个孔的全部培养液体积转移至分别标记的5 mL离心管中收集细胞，并在800 × g下离心 × g 4°C 下 20 分钟 °C.
   2. 吸弃上清液，并将沉淀重悬于 550 µL 的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（D-PBS），并将悬液转移至 1.8–2.0 mL 螺口管中，以避免打开管子时产生气溶胶和液滴。
      注意：此时也可将沉淀储存，以便后续进行纯化操作。将用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）重悬的沉淀于 -80 ℃ 保存 °C，并在冻融循环步骤中务必考虑这一点。
   3. 将试管置于液氮中约 2 分钟以制备裂解液，随后在 37 ℃下解冻 °C 水浴。重复此循环 3-5 次。
   4. 离心裂解物5分钟，1000 × g × g 4 ℃时 °C. 使用防气溶胶密封盖覆盖离心机吊桶。
   5. 小心地从离心机中取出离心管。
      注意：裂解液必须澄清，无可见碎片或浑浊，以避免堵塞纯化过程中使用的树脂。避免振荡或扰动沉淀。若上清液不澄清，需重复离心步骤。对于高浓度样品或含有大量碎片的样品，可考虑提高离心速度或延长离心时间。
3. 基于亲和树脂的高通量重组腺相关病毒载体纯化
   1. 在烧杯中，将720 mg柠檬酸加入50 mL超纯水中，配制洗脱缓冲液，终浓度为75 mM柠檬酸。
   2. 搅拌缓冲液直至粉末完全溶解。
      注意：确保孔体积足以容纳缓冲液体积和移液器吸头，避免溢出或导致相邻孔之间的交叉污染。
   3. 在持续搅拌缓冲液并用pH电极测量的同时，逐滴加入1 M盐酸（HCl），将pH调整至3.0。
   4. 使用孔径为0.22的滤器对缓冲液进行无菌过滤 µm.
   5. 根据所述方案，准备一个孔体积为 2–2.2 mL 的 96 深孔板的各列用于纯化 表1.
      注意：此处的样品使用电子多通道移液器装置进行纯化。该过程可与自动化液体处理系统兼容，并可放大以提高样品通量。
   6. 在室温下于生物安全柜中按照纯化方案所示参数进行纯化（参见 表1）或根据树脂类型、样品体积、预期滴度等个体化需求优化参数。
   7. 洗脱后，加入 ¼ 每个样品中加入中和缓冲液的洗脱体积。
   8. 用移液器将80%的体积上下吹打10次以混匀。
   9. 通过移除透析膜夹具并向其中加入 1600 µ每孔加入 L 透析缓冲液。
      注意：进行透析前，切勿让透析膜接触液体，因为再次干燥可能损害膜的完整性和功能。
   10. 转移全部样品体积（300 µ将最大体积的L加入具有合适体积规格和膜孔径（≥20,000道尔顿截留分子量（MWCO））的透析盒中。确保膜上样品均匀加载，且无气泡存在。
   11. 将胶带放入透析板的已加样孔中，并用密封膜密封透析板。
   12. 将透析板转移至摇床上，在 300 rpm、4 ℃条件下孵育 °30 分钟，4 °C
   13. 更换透析缓冲液，于 300 rpm、4 °C 条件下重复孵育 °30 分钟，4°C
   14. 重复缓冲液置换并孵育，共计 3 次。
   15. 将透析后的样品全部转移至标记好的储存管中，并于4℃保存 °C，如果它们随后被用于表征或其他实验。
   16. -80℃保存 °C 用于长期保存。避免反复冻融，以免影响 AAV 的活性；如有需要，可分装成小体积冻存。
4. 使用数字PCR（dPCR）对粗裂解液及基于树脂纯化的rAAV基因组滴度进行测定
   1. 为测定粗裂解液的基因组滴度（即每毫升病毒基因组数，vg/mL），将收集的病毒样品在室温下解冻，然后用移液器吸取10 µL 加入管中。
      注意：测定病毒基因组（vg/mL）滴度的方法有多种，绝对定量通常依赖于两种主要方法：基于液滴或乳液的方法（ddPCR）和基于微孔板的方法，即数字PCR（dPCR）。^33,34除了这些数字方法外，还可通过定量PCR（qPCR）实现绝对定量。尽管qPCR传统上是一种相对定量方法，但通过使用质粒标准曲线，可将其改进用于绝对定量。该方法需要一种含有已知浓度目标序列的质粒作为参照，用以推算病毒基因组滴度。^21,33虽然qPCR比ddPCR或dPCR更快且成本更低，但其精确度较低，且高度依赖质粒标准品的准确性¹⁶无论采用何种定量方法，样品均需经过预处理以释放病毒颗粒中的基因组。本方案遵循Dobnik, D.等先前描述的方法。³⁵.
   2. 用核酸酶在 37 ℃ 处理 rAAV 样品 °30分钟内降解转染过程中残留的游离质粒DNA。
      注意：可选步骤，取决于所用酶的类型：将样品加热至 95 ℃ °C孵育15分钟以灭活酶并裂解载体的衣壳。
   3. 冷却至室温后，加入蛋白酶K消化15分钟以降解衣壳片段。
   4. 为灭活蛋白酶K，再次将样品加热至95℃ °15 分钟，4 °C
   5. 按照制造商说明书配制 ddPCR 或 dPCR 的预混液。
   6. 使用标记的DNA探针，因为其提供的信号比嵌入染料更特异。设计探针以结合 "中心地" 在病毒基因组中，即在目的基因（见注释）而非启动子或polyA尾部设计引物，并选择与相应PCR系统兼容的荧光染料，如六氯荧光素（HEX）或6-羧基荧光素（FAM）。
      注意：近期，多重数字滴定聚合酶链式反应（ddPCR 或 dPCR）通过使用靶向病毒基因组不同区域的引物/探针组合，已被用于提高滴度测定的准确性^36,37该方法通过应用参考文献中所述的公式或使用集成软件解决方案，可实现对完整基因组的定量。
   7. 将处理后的样品用ddH₂O进行10倍倍比稀释₂O，使用低DNA结合性96孔板。最后，转移5.5 µL（用于ddPCR）或2 µL（用于dPCR）的模板（稀释度10⁴- 和 10⁵)加入已含有包含引物/探针的ddPCR/dPCR预混液的ddPCR 96孔板中。根据各构建体的生产效率调整稀释范围，以确保测量值落在线性检测范围内。
      注意：由于 dPCR/ddPCR 定量是一种高度敏感的方法，10⁴- 和 10⁵-需要对样品进行稀释。
   8. 按照以下步骤进行数字滴落式聚合酶链式反应（ddPCR）。
      1. 对于PCR扩增，请遵循制造商的说明优化检测条件，包括根据所用引物/探针组合调整退火和扩增时间。本研究采用的标准扩增循环程序如下：95°C初始变性 °10 分钟（升降温）  °C/s)；35 个循环的变性，9 °C，30 秒，扩增 6 °C，持续60秒；随后在9 °10 分钟（升降温速率  °C/s)
      2. 在对 rAAV 病毒基因组靶标进行 PCR 扩增后，将反应板转移至液滴读数仪，并按照制造商说明书操作，测定每孔的荧光强度。液滴读数仪可实现对每微升样品中病毒基因组拷贝数的绝对定量。 µL反应。
   9. 按照以下步骤进行数字PCR（dPCR）。
      1. 如ddPCR定量方法所述，按照试剂盒制造商的说明优化检测条件。
      2. 作为起始步骤，采用dPCR仪器预设的热循环程序，包括在9 °C 2分钟，随后进行40个循环：9 °C，退火/延伸 5 °C，30 秒。
         注意：本实验方案采用制造商推荐的升降温速率和反应体积进行。
   10. 使用各种软件解决方案（通常由仪器制造商提供，例如 QX manager 和 QIAcuity Software Suite 1.2）分析 ddPCR 和 dPCR 数据。对于两种方法，均应仅选择阳性与阴性分区/液滴比例适当的样品稀释度进行定量。
       注意：对于粗裂解物和AAVX树脂纯化样品中重组腺相关病毒颗粒滴度（vp/mL；vp = 病毒颗粒）的测定，可采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）。目前有多种 commercially available standard sandwich ELISA kits 可用于AAV定量（本研究中使用的试剂盒列于文末） 材料表）。按照制造商的操作手册进行检测。确保所使用的ELISA试剂盒与正在生产的AAV血清型相兼容。
5. 纯化重组腺相关病毒中VP比率的分析
   注意：为了确定24孔深孔板中每个孔样品的病毒衣壳蛋白（VP）比例，可采用常规蛋白质印迹法或基于毛细管的自动化分析方法。
   1. 使用抗 AAV VP1/VP2/VP3 单克隆抗体作为一抗以检测 AAV2 衣壳蛋白 VP1、VP2 和 VP3。确保该一抗适用于相应的血清型或衣壳变体。
   2. 使用适当的阳性对照，例如重组 VP1、VP2 和 VP3 蛋白或 AAV 参考标准品。
   3. 以1:1:10（VP1:VP2:VP3）的分子比例配制阳性对照，以模拟预期的VP比例。该对照还可作为通过信号峰面积积分进行VP比例定量的参考。
   4. 选择适合检测衣壳蛋白的毛细管电泳试剂盒，检测范围应涵盖最小（VP3，约60 kDa）和最大（VP1，约82 kDa）的蛋白。该范围可能因所用血清型和衣壳变体的不同而有所差异。
   5. 根据制造商说明书配制试剂盒中提供的试剂和生物素标记的分子量标准。
   6. 将样品进行梯度稀释（可基于基因组滴度，起始浓度为1） × 10¹² vg/mL 至 1 × 10¹⁰ vg/mL 或从原液到 1:64 的 1:2 梯度稀释）加入试剂盒提供的稀释缓冲液中，以确保每个样本具有良好的检测范围。
   7. 根据制造商说明或先前的测试结果，用提供的抗体稀释缓冲液稀释一抗。起始稀释比例为1:100。
   8. 根据一抗的来源选择相应的检测试剂盒。
   9. 根据试剂盒提供的方案加载平板。
   10. 务必用水或样品稀释缓冲液填充空的孔，以避免仪器毛细管在无液体运行时受损。
   11. 用密封膜封住培养板，于1200 × g离心 × g，4℃下5分钟 °C.
   12. 将培养板和毛细管转移至仪器中，并使用预设的标准条件进行运行。
   13. 使用数据分析软件（如 Compass（版本 6.3.0））分析运行结果³⁸.
       注意：为分析颗粒完整性、单分散性和纯度，建议采用负染色透射电子显微镜（ns-TEM）。TEM 分析可参照 Steininger 等人的描述进行。²⁵然而，其他方法，例如质谱光度法³⁹, 体积排阻色谱-多角度激光散射⁴⁰ 和银染⁴¹ 还可以提供互补的检测结果，以评估rAAV制备物的质量。
6. 使用纯化病毒颗粒进行转导
   注意：使用纯化的病毒载体转导细胞时，必须确定感染复数（MOI）。MOI 定义为每个细胞所添加的含颗粒基因组的数量。需要注意的是，这是一个理论值；每个细胞实际递送的 rAAV 基因组数量取决于衣壳成功转导靶细胞的能力。因此，最佳 MOI 必须通过实验确定。本节旨在比较两种使用不同纯化方法（氯化铯超速离心法与 AAVX 亲和树脂）制备的病毒载体储备液。为此，采用这两种制备物对人源性神经元共培养细胞进行转导，并通过荧光显微镜评估转导效率。
   1. 用 0.1% 多聚-L-鸟氨酸（Poly-L-Ornithine, PLO）在 4 °C 过夜包被 96 孔黑色光学底板 °C 或在 37℃ 培育 °C，持续至少1小时。
   2. 铺板当天，吸除多聚-L-鸟氨酸（PLO）包被试剂，加入低生长因子基底膜基质，37℃孵育 °C，持续至少1小时。
   3. 以1:6的比例或按照供应商建议将运动神经元与星形胶质细胞共同培养。
   4. 2天后 体外 （DIV），以50,000的感染复数（MOI）对共培养细胞进行转导。
   5. 在4℃下解冻病毒等分试样 °C.
   6. 准备转导培养基（根据每个细胞的病毒基因组数量，将病毒载体按所需感染复数与适量的细胞培养基混合，用于替换每孔50%的培养基）。
   7. 用转导培养基进行50%换液。
   8. 在第5天更换全部培养基，使用常规培养基。
   9. 每隔2-3天或按照供应商建议，定期更换培养基以维持细胞生长。
   10. 使用配备合适激发光源的活细胞成像显微镜监测报告基因的表达水平。对于人源性神经元，转导后10至14天可观察到表达趋于平稳（参见 图4A).

步骤	缓冲液/材料	孔体积 [µL]	工作体积 [µL]	循环次数	流速 [µL/min]
1. 平衡	平衡/ 洗涤 I 缓冲液	1100	950	2	500
2. 上样/ 捕获	样品上清液	550	500	4
3. 洗涤 I	平衡/ 洗涤 I 缓冲液	1100	950	2
4. 洗涤 II	洗涤 II 缓冲液	1100	950	2
5. 洗脱	洗脱缓冲液	70 µL (20 µL 树脂尖端) 250 µL (80 µL 树脂尖端)	60 µL (20 µL 树脂尖端) 240 µL (80 µL 树脂尖端)	4
6. 中和	中和缓冲液	直接向每个样品中加入洗脱液体积的¼ 70 µL 洗脱样品 → 加入 17.5 µL 250 µL 洗脱样品 → 加入 62.5 µL		-	-

表1：rAAV亲和树脂纯化的板布局及纯化参数。

结果

近年来，对实验室规模腺相关病毒（AAV）载体生产的需求显著增加，促使众多合同研究组织将此作为服务项目提供⁴²。鉴于外包通常伴随高昂的成本和较长的周期，自主开展重组AAV（rAAV）生产仍具有显著优势。特别是那些能够减少材料消耗和操作时间、同时整合纯化步骤的高通量实验方案，在药物研发流程中尤为有利。

本方案概述了两种高通量rAAV生产体系：一种是使用贴壁细胞的微型6孔板方法，另一种是用于悬浮细胞的微型HT24方案（参见图1中的概览）。微型6孔板体系利用贴壁的HEK293T细胞，在6孔板格式中生产rAAV。该材料用于评估两种市售的PEI转染试剂以及氯化钠（NaCl）对rAAV2产量的影响（图2A）。在此实验中，同时监测了多个参数：（i）生产细胞的活力及使用GFP报告基因评估的转染效率（图2B和补充图1）；（iii）使用粗裂解物转导后GFP阳性（GFP+）细胞的比例（图2C）。转导实验作为对载体滴度和功能性的低成本且快速的间接检测手段。有趣的是，较低的转染试剂与DNA比例已足以促进高效的载体生产（图2B），同时保持良好的细胞活力。此外，添加150 mM NaCl似乎具有促进作用，尤其是在使用PEIpro试剂时。在微尺度上进行该实验具有多项优势：（i）操作流程快速，细胞接种、转染和载体收获可在一周内完成；（ii）与标准的下游分析检测兼容；（iii）适用于所有AAV血清型。

对于需要较大量rAAV载体的应用，例如 体内 实验或 体外 动力学研究（需要应用更高或更广范围的感染复数）时，扩大培养规模是必要的。为建立一种可提供足量材料用于高通量纯化的微型高通量24孔（mini-HT24）操作流程，采用了悬浮细胞。与贴壁细胞相比，悬浮培养具有更好的可扩展性，且空间利用更高效，因其不受培养表面积的限制。由于悬浮细胞在培养基中自由生长，可充分利用整个培养体积，使三维规模的放大更为简便，从而实现比单层培养更高的细胞密度。此外，悬浮培养体系在传代和收获过程中无需解离步骤，因而更易于维持和操作。通过分析24孔板中三个关键参数，评估了rAAV在该体系中的生产均一性图3）：（A）病毒颗粒滴度（vp/mL）；（B）衣壳中的VP比值；（C）基因组滴度（vg/mL）；（D）空颗粒与完整颗粒比值。

尽管这些参数在不同条件下表现出一定变异性，但其差异基本保持在两倍范围内，处于测量误差允许的范围之内。同时采用自动化Western印迹分析检测了VP蛋白的表达水平（图3E）。最后，通过比较微孔6孔板、微型HT24以及中等规模（摇瓶）生产所获得的总产量，为根据实验需求和下游分析要求选择合适的生产规模提供参考（图3F）。

任何AAV纯化方案的一个关键方面是对载体纯度和效价的评估。在此，树脂纯化的载体与采用两步氯化铯（CsCl）密度梯度超速离心（UC）方法纯化的载体进行了平行比较（图4）。通过荧光显微镜观察，两种制备样品在运动神经元和星形胶质细胞中的转导效果相似，表明其效价相当（图4A）。电镜分析显示，两种方法获得的病毒颗粒在形态和聚集状态上无明显差异。然而，略有趋势表明，CsCl纯化法所获得的制备样品一致性更高，纯度更优（图4B）。

图 1：重组腺相关病毒（rAAV）生产与制备方法概述。 本图展示了 rAAV 的生产方法，涵盖从中等规模摇瓶培养、微型 HT-24 悬浮培养到微孔 6 孔板贴壁培养等多种体系。这些方法可通过不同的细胞裂解和病毒载体纯化策略，实现不同规模的 rAAV 制备。rAAV 的最终表征通常包括：采用 qPCR/dPCR 进行病毒基因组定量（vg/mL），ELISA 检测衣壳滴度（vp/mL），以及细胞转导实验评估其生物学活性。本图使用 BioRender 绘制。Ohland, P. (2025) https://BioRender.com/x3sfbdd。 请点击此处查看该图的高清版本。

图 2：微规模 6 孔板 rAAV 生产转染方案的优化。（A）实验的示意图，包含测试参数和分析检测指标。（B）转染前 24 小时，将 HEK293T 细胞以 0.5 × 10⁶ 个细胞/孔的密度接种于 6 孔板中。测试了不同的 DNA 用量、PEI 类型（Pro 或 Max）、比例以及 NaCl 浓度。（C）转导后 72 小时，使用图 A 中各裂解液等体积（各 10 µL）处理 HEK293A 细胞，检测 GFP 阳性（GFP+）细胞的百分比。为简化展示，仅显示产生最高载体产量的 DNA 条件（2650 ng）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：在微型高通量HT24系统中生产的重组腺相关病毒（rAAV）的分析表征及其在不同规模下的滴度比较。（A）各孔中纯化后rAAV衣壳滴度的ELISA分析结果。数值表示为纯化后每块板平均颗粒滴度的相对偏差。预期滴度取决于所使用的AAV衣壳类型和包装的转基因。不同AAV载体的颗粒滴度范围为低10¹¹至高10¹² VP/mL。（B）通过WES对指定孔中纯化的rAAV进行VP比例分析。以摩尔比1:1:10的重组AAV2 VP1、VP2和VP3作为阳性对照。（C）对各孔中纯化的rAAV进行数字PCR（dPCR）分析。数值表示为纯化后每块板平均基因组滴度的相对偏差。预期滴度取决于所使用的AAV衣壳类型和包装的转基因。不同AAV载体的基因组滴度范围为低10¹⁰（rAAV2）至高10¹¹ vg/mL（rAAV9，此处未显示）。（D）基于A和C图中基因组滴度与颗粒滴度结果计算的指定孔的空/满颗粒比（E/F）。数值已归一化至整板平均水平。在微型高通量HT24体系中，经AAVX亲和树脂纯化后的rAAV2平均空/满比为10.6% ± 3.0%。（E）对各孔中纯化的rAAV2样品进行毛细管Western印迹分析，检测VP蛋白。（F）综合考虑最终样品体积和浓度后，不同方法获得的总病毒基因组产量比较。数据以最小规模体系（微6孔板）为基准，表示为平均倍数差异，误差线表示生物学重复的标准差（SD）。对于采用AAVX亲和树脂纯化的高通量24深孔板生产体系，SD = ±0.176（n = 24）；对于微6孔板超声处理法，SD = ±0.349（n = 6）；对于采用CsCl梯度纯化的标准中试规模生产体系，SD = ±134.70（n = 2）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：高通量（HT）树脂纯化 rAAV 与标准 CsCl 纯化样品在效价和纯度上的比较。（A）将相同表达荧光报告蛋白 mRuby3 的 rAAV 构建体（在人源突触素启动子驱动下）以 50,000 的感染复数（MOI）转导至人源运动神经元和星形胶质细胞。转导后第 7 天（DPT）在活细胞成像显微镜下采集荧光显微图像。rAAV 分别采用标准 CsCl 梯度法（上图）或 HT AAVX 亲和树脂柱法（下图）进行纯化。CsCl 纯化样品在转导前额外经历一次冻融循环，并与树脂纯化的 rAAV 进行比较。（B）通过 CsCl 梯度法（上图）和 HT 树脂柱法（下图）纯化的 rAAV2 血清型变体的透射电子显微镜（TEM）分析。可比较两批 HT 树脂纯化的 rAAV2 样品：无透析处理（左下）和经透析处理（右下）。通过 TEM 测定空壳与完整颗粒比例（E/F），结果显示 CsCl 梯度超速离心纯化样品的完整颗粒比例 > 90%，而 AAVX 亲和树脂纯化样品的完整颗粒比例 < 40%。比例尺 = 100 nm。B 图展示了采用所示方法纯化的代表性批次图像。请注意，这些图像所用样品与 A 图中转导实验所用样品并非同一批次。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：使用微型6孔板系统转染HEK293T细胞以生产rAAV2-GFP。 采用不同DNA用量、NaCl浓度（单位为mM）、PEI产品及PEI与DNA比例进行转染（详见图2）。转染后72小时，采用相同的曝光时间（320 ms）拍摄图像。本图展示了具有代表性的明场和荧光显微镜图像。放大倍数：10X。未显示比例尺；该图像仅用于示意图解和定性评估。请点击此处下载该文件。

讨论

本方案论文概述了利用贴壁细胞和悬浮细胞在高通量、小规模条件下高效生产重组腺相关病毒（rAAV）的方法。这些方法满足了对可扩展且灵活的rAAV生产工艺日益增长的需求，支持临床前研究，同时最大限度地减少时间、成本和资源消耗。

贴壁细胞和悬浮细胞系统在小规模rAAV生产中各有其独特的优势与挑战。贴壁细胞系统（例如在多孔板中培养的HEK293T细胞²⁸）特别适用于早期载体设计和比较研究。由于其与已建立的培养和转染方案兼容，大多数实验室均可便捷地实施。例如，Grosse 等. 利用6孔板中的小规模生产研究了AAP功能，该蛋白对病毒衣壳的组装至关重要²²。Drittanti 等. 在96孔板中生产rAAV载体，以评估rAAV复制的动力学特征，并测试不同腺病毒辅助因子对rAAV产量的影响²³。值得注意的是，在后一项研究中，描述了一种使用稳定表达AAV Rep和Cap蛋白的特殊HeLa细胞进行信号扩增的复制检测方法。最近，Quan 等采用384孔高通量生产方案，结合siRNA筛选，报告了相对滴度数据²⁴。然而，由于材料产量有限，目前仍不确定除荧光蛋白检测外，在细胞转导实验中能否实现足够的感染复数（MOI），以及可开展的检测项目和读数数量，这可能影响实验的可重复性。

本研究采用基于微孔6孔板的贴壁HEK293T细胞培养方法，优化了rAAV2的培养条件（图1 和 图2）。与既往研究和技术报告一致^43,44，较低的PEI与DNA比例以及转染过程中添加NaCl对rAAV的产量具有积极影响。这一结果通过所制备载体在HEK293A细胞中的转导效率间接体现出来。使用较低PEI:DNA比例时观察到的显著差异主要归因于细胞应激，表现为细胞活力低下，尤其是在使用PEIpro时更为明显。尽管在PEImax条件下该效应较不显著，但显微镜图像显示细胞层中存在无细胞区域，提示细胞发生应激或脱落（补充图1）。

重要的是，这些发现并不能直接适用于悬浮培养中的载体生产，这强调了在贴壁培养的HEK293T细胞中促进rAAV生产的实验条件，即使细胞类型相同，也不一定适用于悬浮培养的细胞。这种差异可能归因于这两种培养系统在转录组和蛋白质组水平上的不同⁴⁵。因此，为了更贴近临床生产流程，可能需要在早期研发阶段就采用悬浮培养系统。基于上述观察结果以及悬浮培养可实现更高细胞密度的优势，研究采用了24深孔板系统，在微型规模的悬浮培养（mini-HT24）中生产rAAV。该系统经过了广泛验证，结果显示整块板中每毫升的基因组滴度（vg/mL）和物理颗粒滴度（vp/mL）均保持一致，VP蛋白表达水平及各亚基比例也高度均一（图3A-E）。事实上，与微孔6孔板格式（每孔5 × 10⁵个细胞）相比，mini-HT24系统中达到的更高细胞密度（3 × 10⁶个细胞/mL）带来了更高的rAAV滴度，如图3F所示。这凸显了基于悬浮培养系统的显著优势——其生产能力不受培养容器表面积的限制。然而，此类系统的实施需要特定的设备，而并非所有实验室都具备这些条件。最后，建议进一步利用AMBR15或AMBR250等微型生物反应器系统，对在mini-HT24系统中筛选出的候选分子或更优培养条件进行验证，因为这些系统已被证明能更真实地模拟大型生物反应器中的生产条件^46,47。

纯化程度的选择在决定rAAV制剂是否适用于特定下游应用方面起着关键作用。粗制裂解液来源于贴壁细胞（微孔6孔板）和悬浮培养物（mini-HT24），可为初步筛选实验提供快速且资源高效的选项。这些裂解液含有病毒颗粒、细胞碎片和培养基成分的混合物，适用于载体基因组/颗粒滴度测定、转导效率筛选以及Western印迹分析等实验。尤其适用于研究基本生物学问题（如上述关于AAP功能的研究示例）、细胞培养条件优化以及临床前候选物的筛选与选择。然而，杂质的存在可能需要更高的稀释倍数，从而导致检测灵敏度降低。此外，杂质可能对原代细胞等敏感细胞类型的活力产生负面影响。

与粗制裂解液相比，AAVX 亲和树脂纯化制备物（仅用于基于悬浮液的方案）通过选择性分离完整衣壳，实现了更高纯度。这克服了粗制细胞裂解液的局限性，使此类制备物更适用于以下应用： 体内 研究，以及详细的 体外 转基因表达动力学分析以及精确的功能检测，这些通常需要较大量的材料（参见产量比较） 图3F）。对于 体外 在小型HT24体系中生产的rAAV载体产量通常足以满足大多数检测需求，具体取决于细胞数量和所需的MOI。相比之下， 体内 应用通常需要在中试摇瓶规模或更大规模下进行生产，具体规模取决于剂量、给药途径和动物模型。尽管纯化过程所需的成本和时间有所增加，但所获得材料的一致性和可靠性往往使其在关键应用场景下的投入具有合理性。值得注意的是，图中所示结果 图4 证明使用亲和树脂方法纯化的rAAV载体与通过传统氯化铯（CsCl）超速离心法纯化的载体具有相当的性能。这与先前的观察结果一致，即空壳衣壳对转导无影响，或可能增强转导，具体取决于存在的AAV种类⁴⁸需要注意的是，本实验仅使用了一个感染复数（MOI）和一个时间点，而每种细胞类型均需单独确定最佳实验条件。尽管CsCl纯化通常可获得更干净的背景，但HT树脂柱纯化的AAV在纯度上表现出更大的批次间差异（参见透射电镜图像） 图4这些发现共同支持采用高通量、小规模的工作流程。

在高通量纯化中使用小规模填充亲和树脂的吸头为快速筛选重组腺相关病毒（rAAV）提供了实用的解决方案，但需注意若干技术细节以确保结果可靠。由于树脂床体积有限，这些吸头在处理粗裂解液时特别容易发生堵塞。因此，在上样前必须通过高速离心对裂解液进行澄清，以去除细胞碎片；若澄清不充分，可能导致流速降低并影响产率。对于mini-HT24装置，建议优化转染方案，并将每孔最大工作体积控制在2.5–3 mL以内。在处理不同血清型或衣壳文库时，建议测试多种类型的亲和树脂，因为结合效率和回收率可能因衣壳结构而异⁴⁹。手持式电子多通道移液系统便于在小型实验室中整合该工作流程，无需自动化设备即可实现操作灵活性。然而，手动操作可能引入变异性和批次间差异。为获得更高一致性，采用自动化液体处理平台可能更为有利。在添加样品和缓冲液时应特别注意避免交叉污染，同时必须选用具有足够孔体积的合适板型，以防止溢出。通过妥善解决样品澄清、方案优化、树脂选择以及精确移液等关键因素，研究人员可最大限度减少技术问题，提升高通量、小规模亲和纯化工作流程的稳健性和可重复性。

综上所述，高通量、小规模重组腺相关病毒（rAAV）生产方法与特定应用纯化策略的结合，为推进基因治疗研究提供了一个多功能的平台。这些实验方案满足了对经济高效、操作便捷的工作流程日益增长的需求，同时保持了灵活性，以适应多样化的实验要求。通过在纯度、可扩展性和资源消耗之间取得平衡，研究人员能够加速临床前开发进程，并促进向临床应用的转化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 非缓冲生理盐水	B. Braun，美尔松根，德国	7647-14-5	洗涤液 II
1 M 盐酸	默克密理博，美国马萨诸塞州伯灵顿	1099700050	缓冲液的pH调节
10x DNase I 缓冲液	赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	AM8170G	数字滴定PCR/数字PCR
1 M Tris-HCl，pH 9.0	Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国	J60707.AP	中和缓冲液
24孔深孔微孔板	Enzyscreen，荷兰海姆斯泰德	CR1424cl	悬浮培养设备
250 mL 聚碳酸酯锥形瓶（带通气盖）	美国纽约州康宁	431144	悬浮培养设备
66 - 440 kDa 分离 8x25 毛细管卡盒	BioTechne，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国	SM-W008	全自动 Western 印迹试剂盒
96孔2.2 mL聚丙烯深孔板	赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	AB0661	样品处理与储存板
96孔黑色/透明底板，TC表面	赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，美国	165305	转导实验
AAV2 VP1，重组蛋白	PROGEN，德国海德堡	640823	Wes试剂
AAV2 VP2，重组蛋白	PROGEN，德国海德堡	640824	Wes试剂
AAV2 VP3，重组蛋白	PROGEN，德国海德堡	640825	Wes试剂
AAV2 Xpress ELISA	PROGEN，德国海德堡	PRAAV2XP	用于经高通量树脂纯化的样品。
Wes 小鼠抗体检测模块	BioTechne，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国	DM-002	全自动 Western 印迹试剂盒
特异性正向引物（针对检测/模板）	自定义	自定义	ddPCR/dPCR
特异性探针（针对特定检测/模板）	自定义	自定义	ddPCR/dPCR
特异性反向引物（针对检测/模板）	自定义	自定义	数字滴定PCR/数字PCR
BalanCD HEK293 - 液体	FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC INC，美国加利福尼亚州圣安娜	NC1192689	悬浮细胞培养基
牛血清白蛋白	SERVA Electrophoresis，德国海德堡	牛血清白蛋白	贴壁细胞培养基添加剂
透气性人造丝膜，无菌	VWR International LLC，美国宾夕法尼亚州拉德诺	391-1262	悬浮培养设备
C1000 梯度PCR仪	Bio-Rad Laboratories，Hercules，美国	1851096	ddPCR
CaptureSelec AAVX 配体泄漏 ELISA 试剂盒	赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，美国	8113522000	酶联免疫吸附测定
Cedex HiRes 分析仪	瑞士巴塞尔罗氏控股有限公司	5650216001	细胞计数仪
96孔细胞培养微孔板	Greiner Bio-One，克雷姆斯明斯特ü奥地利恩斯特	655162	贴壁细胞培养设备
柠檬酸	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	5949-29-1	纯化试剂；注意
基于CMOS的透射电子显微镜相机TVIPS XF416	Tietz Video and Image Processing Systems GmbH，吉尔兴，德国	XF416	视频与图像处理系统
Compass 软件（版本 6.3.0）	BioTechne，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国		WES 软件
Corning 6 孔透明组织培养处理多孔板	美国纽约州科宁	3516	贴壁细胞培养设备
ddPCR 微滴生成器油	Bio-Rad Laboratories，Hercules，美国	#1864110	ddPCR 试剂
ddPCR 微滴读取油	Bio-Rad Laboratories，Hercules，美国	#1863004	ddPCR 试剂
探针法ddPCR超级混合液（不含dUTP）	Bio-Rad Laboratories，Hercules，美国	#1863023	ddPCR 试剂
DMEM，高糖	Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国	11960044	贴壁细胞培养培养基
DMEM，低糖	赛默飞世尔科技公司，美国沃尔瑟姆	11885084	贴壁细胞培养培养基
DNA低吸附96孔板	Eppendorf，德国汉堡	30129504	ddPCR/dPCR
DNA低吸附管	Eppendorf，德国汉堡	30108051	ddPCR/dPCR
DPBS	赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，美国	14190094	洗涤缓冲液
EM载网（T600H-Cu 698 目/英寸六边形网，细杆型；EMS）	美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司	FFTH600-Cu-UL	电子显微镜分析
EVO M5000 成像系统	赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	AMF5000	用于转导实验的活细胞成像显微镜
EZ 标准套装 3	BioTechne，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国	PS-ST03EZ-8	全自动 Western blot 试剂盒
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific，施韦尔特，德国	11507411	样品处理
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific，施韦尔特，德国	10203001	样品处理
Geltrex LDEV-Free 低生长因子基底膜基质	Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国	A1413201	培养板包被
GlutaMAX 补充剂（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）	赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，美国	35050061	贴壁细胞培养基添加剂
HEK293A	Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国	R70507	转导实验（仅供科研使用）
HEK293T	美国弗吉尼亚州马纳萨斯 ATCC	CRL-3216	贴壁细胞培养，用于生产重组腺相关病毒（仅限研究使用）
HEPES 溶液，1 M	默克公司，德国达姆施塔特	#H0887	贴壁细胞培养基添加剂
HL-盐活性核酸酶，SAN（25 U/µL)	ArcticZymes Technologies，特罗姆瑟ø挪威	70910-202	ddPCR/dPCR
HydroSpeed 微孔板洗涤仪	Tecan, Mä瑞士嫩多尔夫	30190101	酶联免疫吸附测定
iCell 星形胶质细胞试剂盒，01434	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc.，美国威斯康星州麦迪逊市	R1092	转导实验
iCell 运动神经元试剂盒，01279	美国威斯康星州麦迪逊市 FUJIFILM Cellular Dynamics 公司	R1051	转导实验
Infinite 200 PRO	Tecan, Mä瑞士讷嫩多尔夫	30213617	ELISA
JEM-1400Plus 是一款透射电子显微镜	日本东京都秋留野市，日本电子株式会社	JEM-1400Plus	透射电子显微镜
带针低蒸发三明治盖	Enzyscreen，荷兰海姆斯泰德	CR1224c	悬浮培养设备
微孔板读板仪 SpectraMax i3	Molecular Devices，美国加利福尼亚州圣何塞	i3x	酶联免疫吸附测定
小鼠抗AAV2 VP1/VP2/VP3单克隆抗体	PROGEN，德国海德堡	690058	Wes试剂
无核酸酶水	德国曼海姆罗氏诊断有限公司	3036430103	ddPCR/dPCR
Opti-MEM 低血清培养基	赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	#31985070	PEI-DNA 复合物形成用培养基
PBS	赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，美国	#10010023	洗涤缓冲液
PEI-MAX，聚乙烯亚胺，1 mg/ml 储存液	Polysciences Europe  黑尔施贝格-安德-贝尔格施特拉ßeß德国	24765 或 24765	转染试剂
PEIpro	Polyplus，法国伊尔基什-格拉芬什塔登	101000033/10 mL	转染试剂
Pierce 微透析板，96 孔，0.3 mL，20K 分子量截留值	赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，美国	A50472	纯化设备
泊洛沙姆 188	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	P5556-100mL	细胞培养试剂；注意
聚-L-鸟氨酸溶液（0.01%）	Sigma-Aldrich	A-004-M	转导实验
蛋白酶K溶液（20 mg/mL）	赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，美国	25530049	ddPCR/dPCR
ProteinSimple “Wes”	BioTechne，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国	004-600	自动 Western Blot 装置
QIAcuity Eight 平台系统	Qiagen，德国希尔登	911052	数字PCR
QIAcuity Nanoplate 8.5k 96孔板	Qiagen，德国希尔登	250021	ddPCR/dPCR
QIAcuity Probe PCR试剂盒	Qiagen，德国希尔登	250101、250102 或 250103	ddPCR/dPCR
QIAcuity 软件套件 1.2	Qiagen，德国希尔登		dPCR 软件
QX 管理器	Bio-Rad Laboratories，Hercules，美国		ddPCR 软件
QX200 微滴读取仪	Bio-Rad Laboratories，Hercules，美国	1864003	ddPCR
螺旋盖微量离心管，1.5 ml，经PCR性能测试	Sarstedt, Nü德国马尔堡	72.703.416	悬浮培养设备
螺口盖，DNA LoBind，5.0 mL	Eppendorf，德国汉堡	30122348	悬浮培养设备
摇床培养箱	Infors AG，瑞士博特明根	Multitron	悬浮培养设备
丙酮酸钠（100 mM）	Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国	11360070	贴壁细胞培养培养基
超声波破碎仪微孔板探头系统	QSonica，康涅狄格州纽敦，美国	Q700MPXC	用于粗裂解液制备的超声破碎仪
SPIRIT			SPIRIT 数据库链接：https://spirit.cladiac.com/aav.html
Steriflip-GP 无菌离心管顶部滤器单元	默克密理博，美国马萨诸塞州伯灵顿	SCGP00525	缓冲液配制设备
T-175，细胞培养瓶，550 mL，175 cm²²	Greiner Bio-One，克雷姆斯明斯特ü奥地利恩斯特	660175	贴壁细胞培养设备
0.025% 胰蛋白酶/EDTA	赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	R001100	细胞培养试剂
病毒生产细胞2.0（VPC2.0）	赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，美国	A49784 或 A51218	rAAV 的生产
		J63596.K2	将 PBST 稀释 1:10 作为工作溶液