柴胡在绝经后骨质疏松大鼠模型中的骨保护作用

摘要

本研究采用卵巢切除的大鼠作为绝经后骨质疏松模型，证明柴胡口服液可通过抑制促炎因子并增强抗炎因子来改善骨微结构。这表明其抗炎机制在一定程度上可缓解由雌激素缺乏引起的骨质疏松。

摘要

本方案旨在研究柴胡给药对去卵巢（OVX）大鼠绝经后骨质疏松症的影响。选用8周龄雌性Sprague-Dawley大鼠，采用背部入路法行双侧去卵巢手术，建立绝经后骨质疏松模型。随后通过口服灌胃连续12周给予不同剂量的柴胡口服液，并评估骨微结构变化及检测炎症细胞因子水平。中、高剂量柴胡治疗部分抑制了OVX大鼠的骨量丢失，降低了促炎细胞因子的表达，同时上调了抗炎细胞因子水平。从低剂量到高剂量，骨破坏严重程度显著减轻，且观察到骨微结构重建呈剂量依赖性改善。柴胡缓解了雌激素缺乏引起的骨量丢失和微结构退化，从而抑制了该OVX模型中骨质疏松症（OP）的进展，这可能归因于相关通路的抗炎作用。

引言

骨质疏松症（OP）是一种常见的代谢性骨病，其特征是骨量减少、骨强度降低以及骨微结构破坏¹。OP 可表现为原发性或继发性，其中原发性 OP 分为绝经后骨质疏松症（PMOP）、老年性骨质疏松症和特发性骨质疏松症（常发生于青少年）。其中，I 型 PMOP 主要发生于绝经后女性，由于雌激素循环水平下降，绝经后骨密度显著降低²。该病是一种全身性代谢性骨病，导致破骨细胞活性增强及分化加剧³。此外，骨吸收的强度远超过骨形成，从而引起骨量减少、骨脆性增加以及骨折风险升高⁴。

目前的研究发现，许多慢性炎症性疾病（如骨关节炎和牙周炎）均伴随显著的骨量流失，提示炎症可能与骨质疏松症（OP）密切相关⁵。女性在绝经后随着年龄增长，除了内分泌变化外，生理功能和免疫功能均出现衰退，机体长期处于慢性炎症状态。许多促炎因子及T细胞来源的细胞因子在骨量流失过程中发挥重要作用。因此，绝经后骨质疏松症（PMOP）也被认为是一种慢性炎症性疾病^6,7。

中医（TCM）在绝经后骨质疏松症（PMOP）的预防与治疗方面具有悠久的历史和丰富的临床经验，强调整体调节与辨证论治，可同时调节内分泌系统和免疫系统，为绝经后女性带来显著益处⁸。中医使大量女性能够获得有效的医疗干预。现代药理学研究和临床试验表明，中医具有多靶点作用、毒副作用低且价格低廉的优势。在PMOP的中医治疗中，可显著降低并发症风险⁹。

柴胡本身具有抗炎¹⁰和抗抑郁¹¹作用，能够调节体内激素分泌¹²，并有助于促进健康¹³。柴胡是中药复方制剂逍遥丸的主要成分，在该方剂中发挥着关键作用，逍遥丸具有疏肝解郁、促进胃肠消化与吸收的功效，还以补益气血、调节月经周期及相关不适症状而著称¹⁴。柴胡的主要活性成分为柴胡皂苷，具有显著的抗炎活性，主要表现为抑制促炎性细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和IL-6¹⁵。此外，它还能增强抗炎性细胞因子IL-10的表达，从而缓解结肠炎、子宫内膜炎和肝炎等炎症性疾病¹⁶。

与标准的骨质疏松症（OP）治疗方案（包括使用双膦酸盐¹⁷、选择性雌激素受体调节剂^18，以及地诺单抗¹⁹）相比，柴胡作为一种常用的中药，具有多成分、多靶点作用机制的潜在优势。标准疗法通常针对特定的骨代谢通路²⁰（抑制破骨细胞活性），但可能伴随某些不良反应，如胃肠道不适、颌骨坏死风险增加、类流感症状，以及较高的长期用药成本²¹。

相关文献综述表明，柴胡干预伴骨质疏松症（OP）的牙周炎（PM）大鼠可能具有治疗性缓解作用²²。因此，基于生物信息学与药理学分析，以及分子对接模拟预测结合位点²³，我们提出假设：柴胡可干预炎症过程，调节机体免疫状态，恢复骨免疫稳态，从而有利于骨重建状态的稳定，实现缓解骨质疏松症的预期治疗效果。

本研究采用柴胡口服液（浓度：1 g/mL）连续给药12周。给药方案基于中医临床常用剂量及药代动力学研究²⁴。

该给药方法的总体目标是建立一种稳定且具有临床相关性的给药方案，从而系统评价柴胡在目标模型（绝经后骨质疏松大鼠模型）中的持续干预作用。该给药方式可确保药物在整个实验期间维持有效的血浆浓度，为后续评估（如骨代谢指标和炎症因子水平）提供可靠的干预基础。此外，该方法有助于阐明柴胡在相关疾病中的作用及其剂量-效应关系，同时为实验研究中中药的规范化给药提供参考范式。

方案

所有涉及动物的实验操作均依照《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》（第8版）进行，并已获得右江民族医学院动物伦理委员会的特别批准（批准编号：2024071001）。

1. 网络药理学分析

注意：网络药理学是一种结合了系统生物学、计算生物学和药理学的方法，旨在通过分析生物分子网络来理解药物的作用机制及药物间的相互作用²⁵。

1. 使用传统中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP：http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）等工具，筛选口服生物利用度（OB）≥30%、药物相似性（DL）≥0.18的活性化合物²⁶。搜索柴胡，点击药材详情，下载所有化合物数据，并将下载的文件命名为柴胡。
2. 将核心成分的MOL ID粘贴至TCMSP数据库中，获取该核心成分对应的作用靶点名称。在TCMSP中选择批量搜索，点击靶点预测，然后点击提交。
3. 打开UniProt数据库，将“Target Name”列复制到搜索框中，查找加粗显示的蛋白质名称，该名称应与所粘贴的靶蛋白名称完全一致。找到对应的蛋白质名称后，收集其后一列中的相应基因名称。
4. 在GeneCards数据库（https://www.genecards.org）中，根据相关性评分（Relevance score）≥1筛选与骨质疏松相关的基因，获得全部5741个基因²⁷。
   注：从GeneCards数据库中选择相关性评分≥1的基因的原因如下：评分≥1表明该基因已被文献报道与目标疾病存在关联，可明确区别于无任何报道关联的基因（评分为0）。此阈值可确保保留具有可信疾病相关性的基因，同时避免无关基因的过度干扰。若采用更低的阈值（<1），可能引入未经验证关联的基因，从而增加假阳性结果。
5. 将疾病相关基因集合与药物靶点进行交集分析，获得交集基因。基于疾病靶点与药物活性成分之间的相互作用关系，利用Cytoscape软件构建中药-活性成分-靶点-疾病交集网络。
6. 通过String数据库（https://cn.string-db.org/）获取蛋白-蛋白相互作用（PPI）信息，并构建PPI网络。打开Cytoscape软件（https://www.cytoscape.org），在“上传网络”处加载已下载的TSV文件，然后选择 计算 > TOP10或TOP20，点击提交。
7. 创建两个用于导入Cytoscape的表格。新建一个电子表格文件，命名为Network。在A列中输入已替换为中药缩写的相同MOL ID（如CH1、CH2…）。将B列标记为MOL ID，并按MOL ID升序排列。将C列标记为Symbol。从柴胡相关文件中复制成分ID（MOL ID）和基因名称，分别填入B列和C列。随后删除B列，并将A列重命名为MOL ID。
8. 将表格扩展至文本末尾。在Symbol列中输入已替换为中药缩写的MOL ID（如CH1、CH2…）；在MOL ID列中输入中药缩写：CH。通过上述步骤，完成中药-成分-靶点网络的信息补充与构建。
9. 接下来创建第二种表格，即TYPE文件。新建一个电子表格并命名为TYPE。将A列标记为Term，B列标记为TYPE。将基因名称复制到Term列中，并在TYPE列中赋予其基因属性（目的是便于后续搜索基因，所有基因名称将被统一标记，便于操作）。将成分名称输入到Term列中，并为其赋予drug1属性。
10. 将文件导入Cytoscape软件。导入Network以上传网络文件，导入表格以上传TYPE文件。在搜索框中输入gene，按回车键，选中所有基因，将其拖动至左侧，然后点击布局 > 属性() > 已选中（括号内可选择圆形或方形）。
11. 结合网络药理学分析结果与实验数据，识别药物作用的关键化合物及其分子机制。

2. 分子对接

注意：分子对接是一种计算技术，用于预测小分子（配体）与靶蛋白或生物大分子之间的最佳结合模式及结合亲和力²⁸。

1. 受体与配体准备
   1. 受体（蛋白质）来源：从 RCSB 蛋白质数据库（https://www.rcsb.org）获取目标蛋白的 PDB 文件。搜索 3Q4B（IL-6 受体示例），点击 Download files > PDB format。
   2. 通过点击 Edit > Delete > Water 删除晶体水分子，通过点击 Edit > Delete > Heteroatoms 删除多余的离子和非必需配体（保留如金属离子等关键辅因子）。通过点击 Edit > Hydrogens > Add 添加缺失的氢原子。通过点击 Edit > Charges > Compute Gasteiger then Grid > Macromolecule > Choose > Save as PDBQT，将文件保存为 protein.pdbqt。
   3. 配体（小分子）来源：从 PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下载配体结构。搜索 Saikosaponin A（CID:6443568），点击 3D Conformer > Download SDF。
   4. 使用 Open Babel 软件将 Saikosaponin A 的 SDF 格式文件转换为具有低能量三维构象的 PDB 格式文件，并命名为 saikosaponinA。
2. 对接参数设置（AutoDock 工具）
   1. 加载受体与配体文件。导入小分子文件 saikosaponin A 并将其保存为 PDBQT 格式文件。随后加载受体和配体：点击 Docking > Macromolecule > Open，选择 IL6_receptor.pdbqt；然后点击 Docking > Ligand > Open，选择 saikosaponinA.pdbqt。
   2. 配置网格框：点击 Grid > Grid Box，调整框的大小以完全包含活性位点（使用左侧面板上的控制旋钮进行微调），然后通过点击 File > Close Saving Current 保存当前设置，并将文件命名为 grid.gpf。
   3. 设置 AutoGrid 运行程序：点击 Run AutoGrid，选择 grid.gpf 文件，然后点击 Launch。接着配置对接参数：依次在 Docking 菜单下点击 Macromolecule 并选择蛋白文件 IL6_receptor.pdbqt；点击 Ligand 并选择小分子文件 saikosaponinA.pdbqt；设置遗传算法并确认；调整对接参数并确认。最后，在 Output 中选择 Lamarckian (4,2) 算法，将文件命名为 dock.dpf 并保存。
   4. 执行 AutoGrid 并保存结果：点击 Run AutoDock，选择 dock.dpf 文件并启动模拟。完成后，点击 Write Complex，命名复合物结构，并以 PDBQT 格式保存。
3. 使用 PyMOL 进行结果分析
   1. 使用 Open Babel 软件将上一步分子对接获得的 PDBQT 格式文件转换为 PDB 格式。然后将 PDB 格式文件导入 PyMOL 软件，进行后续可视化操作。
   2. 定位配体并单独分离：选中配体后，点击 Sele ，然后在 Color 中选择一种 Color 更改其颜色。在 Sele 列中，点击 Action 下的 Extract Object，将配体提取为一个新的独立对象。
   3. 氢键距离测量：在 sele 列中，点击 Action，找到 Polar Contacts，点击 To Other Atoms in Object；氢键将以黄色线条显示。点击 Wizard 列中的 Measurement 选项，依次点击 Atoms at Both Ends of the Hydrogen Bond，然后点击 Done 完成测量。
4. 导出图像：在 File 中点击 Export Image as PNG。如需高分辨率渲染，输入 ray 300（像素可调）后按 Enter。

3. 微型计算机断层扫描分析

1. 对雌性SD大鼠（32周龄，320-350 g）腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）以实现深度麻醉，通过角膜反射消失（棉签触碰无眨眼反应）和疼痛反射消失（镊子夹捏后肢无收缩反应）来确认麻醉效果。
   1. 进行后肢离体手术。以手术麻醉剂量3-5倍的戊巴比妥钠（40 mg/kg）经腹腔注射处死大鼠，将其仰卧位固定，沿腹股沟韧带在耻骨联合上方1 cm处做一长约3 cm的横向切口。钝性分离股薄肌与缝匠肌之间的间隙，暴露股动脉（搏动性管状结构）。使用4-0缝线结扎股动脉两端，中间保留一段未结扎区域，随后用眼科剪刀截断血管并完成离断。
   2. 将下肢内旋，使股骨头从髋臼中脱位，切开关节囊及圆韧带，同时保持股骨头完整性。将完整的后肢浸入预冷的生理盐水中，随后置于4%甲醛溶液中固定24-48小时。
2. 成像设置：将固定的股骨送至微计算机断层扫描（micro-CT）检测平台。开启Micro-CT设备，并选择Small Animal Bone Scanning预设程序。采用以下扫描参数：X射线电压 = 90 kV，X射线电流 = 80 µA，视野（FOV）= 36 mm，像素尺寸 = 72.0 µm，旋转角度 = 360°，扫描时间 = 14 min。
3. 将固定后的大鼠左后肢股骨置于样品架中，固定待成像的股骨骨骺端，启动设备并等待机器自检完成。执行预览扫描（低分辨率快速扫描），确认样品居中后，调整感兴趣区域以覆盖整个股骨。
4. 当扫描和成像完成后，X射线光源将自动关闭。此时设备内部辐射值超过安全标准，在未佩戴防护装备的情况下严禁取出样品。
5. 图像分析：使用扫描仪内置软件分析骨参数（骨矿物密度[BMD]、骨小梁数量等）。保存并导出重建图像以供进一步评估。

4. 大鼠骨组织RNA提取的定量实时PCR

1. 去除右侧股骨上的附着肌肉和筋膜。取100-200 mg骨组织切成小块，加入2-3个研磨珠和500 µL RNA提取缓冲液。使用组织研磨仪在4 °C条件下以70 Hz频率均质化5分钟。
2. 相分离：离心后，溶液分为上层水相（含RNA）和下层深色沉淀（含蛋白质、DNA和多糖）。小心将500 µL上清液转移至新的无RNase的1.5 mL离心管中。
3. 根据试剂盒说明书，对分离所得的上层溶液进行总RNA提取处理。
4. 向裂解液中加入异丙醇后，轻轻颠倒离心管以混匀溶液，并在室温下静置10分钟。此时进行肉眼观察，若可见白色絮状RNA沉淀（附着于管壁），表明RNA已有效沉淀。
5. 使用200 µL移液器吸头吸除残留液体，保留管底或管壁的白色RNA沉淀。将RNA重悬于50-100 µL无RNase水中，于-80 °C保存。
6. 在无核酸酶的离心管中加入2 µL RNA模板、10 µL主混合液、2 µL DNase和5 µL无核酸酶水，通过移液轻轻混匀。
7. 在37 °C孵育2分钟以去除基因组DNA污染，随后在55 °C孵育15分钟。反应结束后，在85 °C孵育5分钟以终止反应。
8. 将反转录得到的cDNA置于冰上，配置实时荧光定量PCR体系。预先混合以下组分：10 µL qPCR SYBR Green Master Mix（不含Rox）、正向引物和反向引物各0.4 µL、无RNase水8.2 µL，分装后每管加入1 µL cDNA，在冰上操作并避光。
9. 运行qPCR程序如下：95 °C预变性5分钟，1个循环；随后95 °C变性10秒，共40个循环；在SYBR Green通道中，60 °C退火、延伸及荧光采集30秒，共40个循环。获取熔解曲线，温度范围为65-95 °C，每步增加0.5 °C，每步保持5秒。所用引物见表1。

5. 动物准备

1. 取48只雌性未产SD大鼠（SPF级，8周龄，体重200-220 g）。
2. 实验前，将所有大鼠置于SPF级隔离设施中进行7天的适应性检疫，并饲养于SPF级控制的实验环境中（温度：22-24 °C，湿度：45%-55%）。

6. 试验药物的制备

1. 获取柴胡口服液（中国国家药品批准文号：Z41021539）。该制剂以柴胡（北柴胡来源）为活性成分，辅料包括矫味剂、蔗糖和丙二醇。每10 mL安瓿含有相当于10 g生药的提取物。

7. 卵巢切除大鼠模型的制备

1. 术前准备：禁食大鼠12小时，期间 随意摄取 可获得水源。通过高压灭菌法对所有手术器械进行仪器灭菌。
2. 麻醉与术前准备：通过腹腔注射给予戊巴比妥钠（40 mg/kg）。通过角膜反射（用棉签轻触角膜无眨眼反应）和趾夹反射（夹住脚趾无后肢回缩）评估麻醉深度。注射后15–20分钟，剃除手术区域毛发，用碘伏消毒，并覆盖带孔洞的手术巾。术中涂抹维生素A眼膏（含15,000 IU/g），以防止动物眼睛干涩 （表2）.
3. 卵巢切除大鼠模型：在专用的无菌手术室内进行手术操作，所有人员均需穿戴全套隔离服。使用75%乙醇擦拭操作台面及周围设备。 （表 2） 手术前开启紫外灯至少30分钟，以消除空气和物体表面的微生物。
   1. 在背部皮肤做1 cm切口，钝性分离皮下组织，提起肌层并做1 cm切口。找到脂肪垫并将其外翻以辨认卵巢（呈鲜红色）。用4-0缝线结扎输卵管，切除卵巢组织，置于含有4%多聚甲醛的50 mL离心管中。 （表2）.
4. 伤口缝合与消毒：缝合前将青霉素粉末撒入伤口内。使用6号不可吸收缝线缝合肌层，2号缝线缝合皮肤。缝合完毕后，以碘伏消毒切口，并局部外用青霉素粉末。
5. 术后护理：将大鼠置于铺有温水瓶和毛巾的新笼子中，以维持体温。术后禁食（可饮水）24小时，以防止肠梗阻。连续3天每日在切口处涂抹青霉素粉末。
   1. 在手术切口周围注射利多卡因（1%-2%浓度，最大剂量5 mg/kg），以减轻术后即刻疼痛。术后提供持续3-5天的镇痛治疗，根据疼痛程度逐渐减少剂量，避免突然停药。
   2. 将动物保持在侧卧位或头低位直至苏醒，以防止舌后坠和气道阻塞；苏醒后允许其自主采取舒适体位。术后动物在完全恢复前应与其他动物隔离，以避免争斗或交叉感染（图1).

8. 实验分组与药物给药

1. 分组：将40只SD大鼠随机分为5组（每组8只），分别为正常对照组、模型对照组、低浓度柴胡组、中浓度柴胡组和高浓度柴胡组。
2. 中剂量组（5 mL/kg）的给药剂量依据文献^29,30中的指导原则确定；低、中、高浓度组按1:2:4的浓度梯度设置，分别为2.5 mL/kg、5 mL/kg和10 mL/kg。
3. 给药方式：采用灌胃法，每日给药一次。正常对照组和模型对照组（接受双侧卵巢切除术的动物）灌胃等量生理盐水。自术后第1周开始给药，持续12周。

9. 实验后分析与数据收集

1. 对五个动物组进行以下分析：骨结构的显微CT检测以及大鼠股骨组织中炎症细胞因子mRNA表达的测定。
2. 收集的数据包括股骨小梁微结构的可视化图像；定量骨参数（包括骨矿物密度、骨体积分数、小梁厚度标准差、小梁间距、小梁数量和连接密度）；以及股骨组织中促炎细胞因子（IL-6、IL-17）和抗炎细胞因子（IL-4、IL-10）的相对mRNA表达水平。
3. 使用GraphPad Prism 10.1.2软件进行数据分析，采用单因素方差分析（ANOVA）。组间均值差异的统计学显著性定义为 p < 0.05。事后多重比较采用Tukey检验进行。

结果

GO功能与KEGG通路富集分析

我们依赖生物信息学中的GO和KEGG富集分析来预测柴胡对PMOP的潜在作用机制。柴胡活性成分与疾病相关靶基因的GO富集分析共得到2138个显著性条目，各组前十个显著性结果已列出(图2D)。在生物过程方面(图2A)，交集基因主要参与对脂多糖和活性氧的应答。在细胞组分部分(图2B)，交集基因主要涉及细胞分泌颗粒腔以及含胶原的细胞外基质。在分子功能方面(图2C)，交集基因主要涉及核受体活性和配体激活的转录因子活性。

讨论

绝经后骨质疏松症（PMOP）是一种常发生于绝经后女性的全身性骨代谢紊乱疾病，由雌激素缺乏引起，导致成骨细胞与破骨细胞之间的平衡失调，进而引起破骨细胞骨吸收增强以及成骨细胞骨形成减少³¹。越来越多的研究表明，体内炎症因子水平也会影响破骨细胞与成骨细胞的分化，促炎因子的过表达有助于破骨细胞的分化³²。同样，抗炎因子的过表达则抑制破骨细胞的表达³³。这表明，采用以抗炎为导向的治疗方案可能成为治疗PMOP的一种可行策略。

中药柴胡在临床上被广泛用于治疗炎症、预防感冒和流感、调节体内激素分泌以及保护肝脏³⁴。在复方制剂中，柴胡是易于获得的药物成分，常与其他药物联合用于治疗绝经后骨质疏松症（PMOP）³⁵。因此，我们希望从柴胡自身药理特性——抗炎作用的角度，阐明其治疗PMOP的机制。

在实验过程中，我们...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 氯化钠注射液	Huarenpharmaceutical	h1712059
1×PBS	Thermofisher	10010023
75% 酒精	南京试剂	C069156931
95% 乙醇	南京试剂	C0691520075
无水乙醇	Macklin	E809056
柴胡	河南百泉制药有限公司	Z41021539
脱钙液	solarbio	E1171
红霉素软膏	广州白云山医药集团股份有限公司白云山和记黄埔中药厂	H44023088
异丙醇	济南金日和化工有限公司	23727-29-9
青霉素V钾胶囊	四川制药	H20103156
多聚甲醛 (CH2O)n	Beyotime	P0099
聚维酮碘消毒液	广东恒健制药有限公司	H44023924
实时荧光PCR试剂盒	翊圣生物	11201ES03
RNA提取试剂盒	Monadbiotech	MI20201S
RNA反转录试剂盒	翌圣生物科技	EG15123S
戊巴比妥钠	上海吉翔生物科技有限公司	JX082085
Trizol	Thermofisher	15596026CN