FRET稀释法分析蛋白质组装间的动态交换

摘要

本方案描述了反射蛋白A1的纯化与共价标记，以及一种FRET稀释检测法，用于表征反射蛋白在蛋白组装体之间动态交换随时间变化的情况。

摘要

作为头足类动物可调虹彩现象的分子驱动因素，反射蛋白A1（reflectin A1）的可调相变行为一直是生物材料工程研究的焦点。通过调节盐浓度和反射蛋白A1的净电荷密度，可促使该蛋白形成动态聚集体，作为液-液相分离过程中的中间态。这些反射蛋白聚集体的尺寸受限于蛋白阳离子间库仑排斥作用的中和程度，在初始阶段仍与周围溶液中的单体或寡聚体进行动态交换。本研究结合荧光共振能量转移（FRET）稀释实验、动态光散射（DLS）和蛋白质浓度测定，表征了反射蛋白A1聚集体与稀相之间蛋白质双向交换通量随聚集体形成时间的变化关系。该FRET稀释实验能够区分蛋白质单向或双向进出蛋白聚集体的过程，因此可用于聚集体形成过程中的动态监测。区分动态聚集体与动力学受阻聚集体对于理解其生物物理起源至关重要，而这一新型FRET稀释实验方法亦可推广应用于其他蛋白质聚集体的生物物理研究中。

引言

可调结构色 枪乌贼科 鱿鱼的虹彩细胞中由反射蛋白介导^1,2,3虹彩细胞含有广泛且规则的膜内陷结构，形成富含蛋白质的布拉格层状结构堆叠，能够以依赖角度和波长的方式反射光线。^1,4,5,6乙酰胆碱触发的信号级联反应最终导致阳离子型反射蛋白的磷酸化^1,2,7，减少蛋白质内和蛋白质间的静电排斥，从而驱动反射蛋白在布拉格层状结构中从流体动力学半径为10-50 nm的颗粒凝聚为致密的液相凝聚物^3,8,9反射蛋白 A1 体外 形成尺寸稳定的组装体，其半径大于10 nm，且组装体尺寸通过蛋白质净电荷密度精确调控^10,11,12，这种可调控的胶体行为在设计基于反射蛋白的可调谐生物光子材料方面已引起广泛关注^{13,14,15,16,17,18}最近有研究证明，NaCl 通过熵效应增强疏水作用的能量贡献，并通过屏蔽交替阳离子连接区的排斥电荷，从而驱动反射蛋白 A1 的组装和液-液相分离（Liquid-Liquid phase separation, LLPS）。¹⁹.

对于富含蛋白质的类液体致密相凝聚体，可通过全液滴荧光漂白后恢复（FRAP）技术便捷地分析致密相与稀溶液相之间的动态交换过程²⁰；然而，目前尚缺乏适用于纳米尺度蛋白质组装体的类似检测方法。近期多项研究报道了在液-液相分离（LLPS）过程中具有生理相关性的蛋白质组装中间体^19,21,22，提示亟需建立相应的方法以探究这些组装体的动力学特性及其与共存稀溶液相之间的动态交换。蛋白质簇集可包括由受阻旋节分解产生的动力学阻滞类玻璃胶体、与稀溶液相交换单体或寡聚体的动态平衡组装体，以及亚稳态簇集^{23,24,25,26,27}。因此，依赖于时间的蛋白质组装动力学是理解更复杂相变行为背景下蛋白质组装形成机制的关键物理过程。

基于FRET的方法可用于分析供体荧光标记蛋白组装体与受体荧光标记蛋白组装体之间相互作用，从而表征亚稳态蛋白簇的动力学特征²¹。当这些蛋白簇混合后，FRET信号的出现表明蛋白在簇之间发生了交换和转运²¹。然而，对于某些蛋白（如reflectin A1），在实验过程中蛋白簇会持续形成并不断增大¹⁹。针对此类蛋白，需要一种能够区分蛋白单向进入簇（可能发生在持续形成的动力学阻滞簇过程中）与蛋白在组装体之间双向转运的方法。

一种FRET稀释方法可实现此目的 通过 荧光染料稀释（图1），其中FRET的降低表明蛋白质在组装体之间发生双向转运。制备了含有等量受体荧光团或供体荧光团标记的反射蛋白（reflectin protein）组装体。将这些共标记的反射蛋白组装体与含有未标记反射蛋白组装体的溶液混合稀释，并分析蛋白质在不同组装体年龄条件下动态交换的情况。该方法可区分持续形成的动力学阻滞蛋白聚集体与动态聚集体，后者包括但不限于亚稳态聚集体、因奥斯特瓦尔德熟化（Ostwald ripening）或类似粗化过程而增大的聚集体、通过融合生长的聚集体，以及非液-液相分离（LLPS）中间体的聚集体。然而，该方法无法单独区分这些不同的动态交换机制，需结合正交方法如动态光散射（dynamic light scattering）、纳米颗粒追踪分析（NTA）和Bradford法等进一步验证。^19,21本方案描述了野生型反射蛋白A1及其单半胱氨酸突变体A1-C232S的纯化方法、A1-C232S的共价标记以及荧光共振能量转移（FRET）稀释分析。

方案

所用试剂和设备列于材料表中。

1. 蛋白质纯化与共价标记

1. 转化
   1. 将反射蛋白 A1 和反射蛋白 A1 C232S 基因（GenBank KF661517.1）克隆至 pj411 质粒中。
   2. 使用热激法将质粒转染至 Rosetta 2 (DE3) 细胞²⁸。
   3. 将转染后的细胞涂布于含 50 µg/mL 卡那霉素的琼脂平板上。
   4. 挑取单个孤立菌落，加入含 50 µg/mL 卡那霉素的 5 mL TB（优质肉汤）中，于 37°C、250 rpm 摇床中过夜培养。
   5. 按照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取，用于测序。
2. 蛋白表达、裂解及包涵体纯化
   1. 将 5 mL 培养物接种至含 50 µg/mL 卡那霉素的 1 L LB（溶菌肉汤）中，于 37°C 摇床中培养。当 A₆₀₀ 达到 0.6–0.7 时，加入 IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）至终浓度 5 mM 以诱导表达。
   2. 16 小时后，于 12,000 xg 离心 10 分钟收集菌体。弃去上清液，将菌体沉淀置于 -80°C 冰箱中冷冻保存。
   3. 按照试剂说明书使用包涵体纯化试剂裂解细胞并纯化包涵体，细胞沉淀重悬后，每毫升包涵体纯化试剂中加入 1 µL（25–29 单位）苯并核酸酶和 3–5 KU 溶菌酶，处理 20 分钟。纯化后的包涵体呈深棕色沉淀。
3. FPLC（快速蛋白液相色谱）
   1. 配制 2 L 8 M 尿素：5% v/v 乙酸溶液（缓冲液 A）和 1 L 8 M 盐酸胍：5% v/v 乙酸溶液（缓冲液 B）。使用 0.22 µm 真空滤瓶过滤两种溶液。
      注意：避免吸入、接触眼睛和皮肤盐酸胍，操作时应穿戴适当的个人防护装备（PPE）。废弃物应置于专用废液容器中处理。
   2. 用磁力搅拌器剧烈搅拌，将包涵体沉淀重悬于 8 M 尿素：5% 乙酸溶液中，溶液呈浑浊状。预冷离心机至 4 °C，于 4 °C、18,000 x g 离心 70 分钟，收集上清液用于 FPLC。上清液呈棕色且透明。
   3. 以下所有步骤流速设为 2 mL/min，用 5 柱体积（CVs）的 95% 缓冲液 A 和 5% 缓冲液 B 平衡 10 mL 阳离子交换柱，上样后用 5 CVs 洗脱未结合物质，随后进行梯度洗脱：先用 5 CVs 的 94% 缓冲液 A / 6% 缓冲液 B，再用 5 CVs 的 10% 缓冲液 B。反射蛋白 A1 在 10% 缓冲液 B 中洗脱。
   4. 通过 SDS-PAGE 检测对应于初始梯度变化至 10% 缓冲液 B 的各组分纯度，若相似则合并。预冷离心机至 4 °C，使用 15 mL 10 kDa 分子量截留（MWCO）离心浓缩管将合并组分浓缩至终体积 4–5 mL。
4. HPLC（高效液相色谱）
   1. 配制 2 L 含 0.1% 三氟乙酸（TFA）的 18 mΩ 水和 2 L 含 0.1% TFA 的乙腈。使用 0.22 µm 真空滤瓶过滤两种溶液。
      注意：TFA 为强腐蚀性发烟酸，应在通风橱中操作，穿戴适当个人防护装备，仅使用玻璃器皿转移。避免吸入、接触眼睛和皮肤乙腈，操作时穿戴适当个人防护装备。废弃物应置于专用废液容器中处理。
   2. 以下所有步骤流速设为 1 mL/min，用 5 CVs 的 85% 18 mΩ 水、0.1% TFA 和 15% 乙腈、0.1% TFA 平衡 C4 柱。
   3. 开始流动相流速，进样后流过 2 CVs，随后在 5 CVs 内线性梯度洗脱至 80% 乙腈、0.1% TFA。反射蛋白 A1 通常在 73% 乙腈时洗脱。
   4. 将含有反射蛋白的组分分装至 5 mL 管中，使用乙醇-干冰浴进行壳冻。冷冻干燥后，于 -80 °C 保存。蛋白呈薄白色片状。
5. 未标记蛋白储备液制备
   1. 使用冰乙酸和三水合乙酸钠配制 4 L pH 4、25 mM 乙酸缓冲液（21.05 mM 乙酸，3.95 mM 三水合乙酸钠）。如需调节 pH，使用 4 M HCl 或 4 M NaOH。使用 0.22 µm 真空滤器过滤。
      注意：操作强酸/强碱时应穿戴适当个人防护装备。切勿将水加入浓强酸或强碱中。
   2. 解冻含有冻干反射蛋白的管子，将管子置于冰浴中，用 pH 4、25 mM 乙酸缓冲液重新溶解。完全溶解的蛋白溶液应无色，无可见浑浊或沉淀。
      1. 使用 10 kDa 分子量截留透析盒，在 4 °C 下，用 1000 倍样品体积的预冷至 4 °C 的 pH 4、25 mM 乙酸缓冲液进行透析，更换缓冲液两次，每次 12 小时。
   3. 用 pH 4、25 mM 乙酸缓冲液稀释样品，使终蛋白浓度为 100 µM，终体积至少 150 µL。使用紫外-可见分光光度计测定 280 nm 处吸光度，并利用反射蛋白 A1 的摩尔吸光系数²⁹（123,685 M^-1 cm^-1）计算蛋白浓度。
   4. 将反射蛋白储备液转移至 0.5 mL 扣盖微量离心管中，于 4 °C 保存不超过 7 天。实验前立即在预冷的微量离心机中于 4 °C、18,000 x g 离心 15 分钟。使用摩尔吸光系数 123,540 M^-1 cm^-1 以相同方法制备反射蛋白 A1 C232S 储备液。
6. 蛋白标记
   1. 分别配制 10 mg/mL 的 FMTS（荧光素-甲硫基磺酸盐）和 SRMT（磺基罗丹明甲硫基磺酸盐）储备液：向含有 10 mg 荧光探针的小瓶中加入 1 mL 无水二甲基亚砜（DMSO），用移液器混匀。
      注意：避免吸入、接触眼睛和皮肤甲硫基磺酸盐试剂。
   2. 向 pH 4、25 mM 乙酸缓冲液中加入 7.7 µL 10 mg/mL FMTS 储备液或 10.4 µL 10 mg/mL SRMT 储备液，终体积为 150 µL，终浓度为 500 µM FMTS 或 SRMT。溶液呈浑浊状。将剩余荧光探针储备液分装并冻存于 -80 °C。
   3. 与 150 µL 100 µM 反射蛋白储备液混合，充分移液混匀。终蛋白浓度为 50 µM，终荧光探针浓度为 500 µM。溶液浑浊度将降低。
   4. 用铝箔包裹，室温下轻柔振荡孵育 4 小时，随后于 4 °C 过夜孵育。溶液浑浊度不应发生变化。
   5. 如有沉淀，通过剧烈移液混悬。溶液将呈浑浊状。使用 10,000 kDa 分子量截留离心滤膜将反射蛋白浓缩至目标体积 100 µL，浓度为 150 µM。
   6. 采用与蛋白纯化相同的 HPLC 和冻干方法去除未结合的荧光探针，用铝箔包裹后于 -80 °C 保存。使用与未标记蛋白相同的方法重新溶解标记蛋白。测定标记程度。
      注：重新溶解的荧光标记反射蛋白呈黄色-绿色（C199-F）或深红色（C199-R），无浑浊或沉淀。
7. 共标记蛋白储备液制备
   1. 向 0.5 mL 扣盖微量离心管中加入 27 µL 100 µM A1 蛋白储备液。
   2. 向同一管中加入 1.5 µL 荧光素标记的反射蛋白 A1-C232S（称为 C199-F，表示荧光素标记的氨基酸位置）。
   3. 向同一管中加入 1.5 µL 磺基罗丹明标记的反射蛋白 A1-C232S（称为 C199-R，表示荧光素标记的氨基酸位置）。终浓度为 90 µM A1、5 µM C199-F 和 5 µM C199-R。
   4. 用铝箔包裹，于 4 °C 保存不超过 7 天。

2. FRET 时间序列

1. 缓冲液制备与过滤
   1. 配制 500 mL 的 25 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）缓冲液。缓慢加入 4 M 氢氧化钠，调节溶液 pH 至 7。使用 10 mL 注射器和 0.22 µm 注射式滤器过滤 10 mL 缓冲液。
2. 蛋白质离心
   1. 将台式微量离心机预冷至 4 °C。在 4 °C 条件下，以 18,000 × g 离心未标记和共标记的 reflectin A1 储液 15 分钟。
3. 制备标记的 A1 组装体
   1. 为制备三个重复样本，将 9.6 µL MOPS 缓冲液（pH 7，25 mM）移液至三个 0.5 mL 带扣盖微量离心管中。
   2. 向每个已含有 9.6 µL MOPS 缓冲液的管中加入 0.4 µL 标记蛋白储液，使终浓度为 4 µM。通过缓慢吸液和排液，将整个样品体积吹打混匀两次。
   3. 立即用锡箔纸包裹，并置于 25 °C 培养箱中。本步骤及后续所有组装体溶液在孵育前后均无明显浑浊或沉淀。
4. 制备未标记的 A1 组装体
   1. 为制备三个重复样本，将 38.4 µL MOPS 缓冲液移液至三个 0.5 mL 带扣盖微量离心管中。
   2. 向每个已含有 38.4 µL MOPS 缓冲液的管中加入 1.6 µL reflectin A1 蛋白储液，使终浓度为 4 µM。通过缓慢吸液和排液，将整个样品体积吹打混匀两次。
   3. 立即用锡箔纸包裹，并置于 25 °C 培养箱中。
5. 共标记与未标记 A1 组装体的时序控制与混合
   1. 按以下顺序进行组装体制备：同时且分别制备实验用共标记 reflectin 和未标记 reflectin 的组装体。重复步骤 2.3 和 2.4。
   2. 将 40 µL 未标记 A1 组装体实验样品加入 10 µL 对应的共标记实验样品中，通过轻柔吸排操作吹打混匀两次。此步骤后 24 小时进行测量。
   3. 将 reflectin A1 通过稀释至 MOPS 缓冲液（pH 7，25 mM）诱导组装，至标记与未标记组装体混合之间的时间定义为组装龄。本实验所用组装体的龄期分别为 0 分钟、1 分钟、10 分钟、30 分钟、60 分钟、120 分钟、180 分钟、540 分钟、1080 分钟和 1620 分钟。
6. 对照组
   1. 阳性对照
      1. 从 A1 和标记蛋白储液中，配制 20 µL 含 80 µM A1 和 20 µM 共标记蛋白的蛋白储液。
      2. 向一个 0.5 mL 带扣盖微量离心管中加入 38.4 µL MOPS 缓冲液，再加入 1.6 µL 80 µM A1 / 20 µM 标记蛋白混合液，缓慢吸排吹打混匀两次。立即用锡箔纸包裹，并置于 25 °C 培养箱中。共重复制备 9 个样本。
   2. 阴性对照
      1. 向一个已含有 9.6 µL MOPS 缓冲液的 0.5 mL 带扣盖微量离心管中加入 0.4 µL 标记储液。通过缓慢吸排操作将整个样品体积吹打混匀两次。
      2. 加入 40 µL MOPS 缓冲液，再次缓慢吸排吹打混匀两次。立即用锡箔纸包裹，并置于 25 °C 培养箱中。共重复制备 9 个样本。
7. 比色皿与缓冲液空白
   1. 将荧光仪设置为激发波长 488 nm，记录 520–700 nm 范围内的连续发射光谱。
   2. 用 50 µL MOPS 缓冲液（pH 7，25 mM）填充洁净的石英微量荧光比色皿，并进行测量。
   3. 移除缓冲液。
8. 实验步骤
   注意：所有实验组应在共标记与未标记 reflectin A1 组装体混合后 24 小时进行记录。轻柔地将 50 µL 实验溶液移入比色皿中并进行测量。
   1. 取出样品，依次用 500 µL 乙酸缓冲液和 500 µL 经 0.22 µm 滤膜过滤的 18 mΩ 水冲洗。执行缓冲液空白测量。
9. 对照组测量
   1. 在制备对照组后 1440 分钟、1960 分钟和 3060 分钟进行测量（对应组装龄为 0 分钟、520 分钟和 1620 分钟）。这些测量标志着本实验方案实验部分的结束。

3. 数据分析

1. 从实验光谱中减去缓冲液空白的光谱。
2. 确定 Em₅₈₈/Em₅₂₀ 的比值。
3. 对每个重复样本，计算三个重复组的平均值和标准偏差。以组装时间为自变量，绘制 Em₅₈₈/Em₅₂₀ 的变化曲线。

结果

将含有供体荧光团标记蛋白和受体荧光团标记蛋白的反射蛋白A1组装体与未标记的反射蛋白A1组装体稀释后，观察到相对于未稀释组装体在588 nm处的FRET发射出现初始下降（图2A）。0分钟龄组装体的FRET值与阳性对照相似，而1620分钟龄组装体（即组装形成后与未标记及标记反射蛋白组装体混合之间的时间）的FRET值低于阴性对照（图2A）。以Em₅₈₈/Em₅₂₀比值对组装体年龄作图显示，整个组装体群体最初完全处于动态交换状态，且随着组装体年龄增加，动态交换程度逐渐降低（图2B）。对于24小时龄的组装体，仅有19%的群体参与了动态交换（图2B）。

讨论

在纯化过程中，蛋白质损失的一个常见原因是包涵体沉淀在包涵体纯化方案的所有步骤中未能完全重悬，以及最终将纯化的包涵体重悬于8 M尿素、5% v/v乙酸溶液中时操作不当。包涵体的复溶可能需要在40 mL锥形管中使用小型磁力搅拌子进行长达24小时的剧烈搅拌。为避免蛋白质在滤膜上发生显著损失，我们用离心步骤取代了FPLC和HPLC前的过滤操作，即在15,000 × g 条件下离心70分钟，以澄清溶液并去除可能堵塞液相色谱系统的较大颗粒。包涵体的相对纯度允许在纯化过程中省略FPLC步骤，单独使用HPLC可能已足以纯化reflectin A1³⁰；然而，反相HPLC柱将需要更频繁的深度清洗。为保持方案的完整性，本方案中仍包含了FPLC步骤。

野生型 reflectin A1 是一种难以进行共价标记的蛋白质，因为它仅在 pH 值为 4.5 或更低时才以单体形式存在^10,11,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 μL 量程微量移液器
2 μL 量程微量移液器
2-[(5-荧光素基)氨基甲酰基]乙基甲烷硫代磺酸盐	Santa Cruz Biotechnologies	sc-216155	CAS 351330-42-2
20 μL 量程微量移液器
200 μL 量程微量移液器
3-(N-吗啉代)丙磺酸，4-吗啉丙磺酸	Sigma-Aldrich	M1254	CAS 1132-61-2
乙酸	Sigma-Aldrich	A6283	CAS 64-19-7
乙腈	Sigma-Aldrich	34851-1L	CAS 75-05-8
琼脂粉	Carolina Biological	842133	CAS 9002-18-0
铝箔
Amicon Ultra 离心滤膜管，10 kDa 截留分子量	Millipore Sigma	UFC501008	0.5 ml 容量
Amicon Ultra 离心滤膜管，10 kDa 截留分子量	Millipore Sigma	UFC901008	15 ml 容量
分析天平
苯并核酸酶（Benzonase）	Millipore-Sigma	70664-3	CAS 9025-65-4
BugBuster 蛋白提取试剂	Millipore Sigma	70584-3
Cary Eclipse 荧光分光光度计	Cary-Eclipse
Cary Eclipse 软件
Corning 50 ml 离心管	Millipore-Sigma	CLS430829
一次性注射器，Luer-Lok 接头，10 mL	Cole-Parmer	UX-12915-02
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	CAS 67-68-5
干冰
双泵 FPLC 系统
双泵 HPLC 系统
乙醇	Millipore Sigma	EX0280-3	CAS 64-17-5
落地式离心机转子，500 ml 瓶容量
落地式离心机
冷冻冰箱，-80°C
通风橱
盐酸胍	Thermo Scientific	AAA135430B	50-01-1
HiTrap SP HP 阳离子交换层析柱	Cytiva	17115101
盐酸	Sigma-Aldrich	258148-25ML	CAS 7647-01-0
培养箱
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside）	Sigma-Aldrich	I6758-1G
硫酸卡那霉素	Sigma-Aldrich	K1637	CAS 25389-94-0
冷冻干燥机
溶菌酶	Thermo Scientific	90082
磁力搅拌子
磁力搅拌板
微型 pH 电极 S7	Metler Toledo	51343160
带温控功能的微量离心机
Millex PVDF 注射式滤器	Millipore	SLGVR33RS	0.22 μm，33 mm 直径
Milli-Q Millipak 滤器	Millipore Sigma	MPGP002A1
Milli-Q 超纯水纯化系统	Millipore Sigma
NaCl	Thermo Scientific	AA12314A9	CAS 7647-14-5
Nalgene 离心瓶，型号 3120	Millipore-Sigma	B1283-4EA	用于细菌沉淀
带培养箱的轨道摇床
PC
培养皿	Sigma-Aldrich	P5731-500EA
pj411 质粒	DNA 2.0
Protein LoBind  锥形管	Eppendorf	EP30108302	5 ml 容量
Protein LoBind  微量离心管	Eppendorf	EP022431102	0.5 ml 容量
Pyrex 带挡板锥形瓶，1,000 ml	Millipore-Sigma	CLS44501	用于细菌培养孵育
Pyrex Griffin 烧杯，2,000 mL	Millipore-Sigma	CLS10002L	用于所有缓冲液和溶液配制
Pyrex 圆形培养基储存瓶，1,000 ml	Millipore-Sigma	CLS13951L	用于所有缓冲液和溶液的储存，可与抽滤瓶配套使用
Qiaprep Spin Miniprep 试剂盒	Qiagen	27104
冰箱
Rosetta 2(DE3) 感受态细胞	Novagen	71397-3
Slide-a-lyzer 透析夹，10K 截留分子量	Thermo Scientific	PI66383	0.5 ml 容量
三水合乙酸钠	Sigma-Aldrich	S8625	CAS 6131-90-4
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	567530-250GM	CAS 1310-73-2
Steritop 真空瓶顶滤器	Millipore Sigma	S2GPT05RE	0.22 μm 无菌滤膜
微量比色皿，50 μL 容量	Starna Cells	16.40F-Q-10/Z15
磺基罗丹明甲烷硫代磺酸盐（sulforhodamine methanethiosulfonate）	Santa Cruz Biotechnologies	sc-220172	CAS 386229-71-6
三氟乙酸	Sigma-Aldrich	106232-25G	CAS 407-25-0
胰蛋白胨	Spectrum Chemical	T1333
尿素	Thermo Scientific	AAA123600E	CAS 57-13-6
紫外-可见分光光度计
酵母提取物	Gibco	211929