多模态空间代谢组学结合中红外显微镜引导的质谱成像

摘要

我们提出了一种多模态空间代谢组学工作流程，该流程在同一组织切片上整合了质谱成像（MSI）和中红外（MIR）成像，用于空间分辨的代谢和生化分析。

摘要

空间代谢组学是一个快速发展的领域，旨在绘制代谢物在组织、器官甚至单个细胞内的分布图谱。该方法提供了具有空间背景的代谢信息，对于理解生物系统的生化异质性至关重要。中红外（MIR）成像与质谱成像（MSI）已成为空间代谢组学中强有力的手段，各自具备独特且互补的优势。本研究中，我们提出了一种在同一组织切片上进行MIR成像和基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）的工作流程，涵盖实验操作、图像共定位、数据整合以及生物信息学分析。MIR成像作为上游检测手段，可对组织进行无损的生化分析；随后，根据MIR成像获取的空间信息，指导在特定组织区域沉积基质以进行MALDI-MSI。在完成图像共定位后，对多模态图像进行整合，从而利用Seurat等先进的生物信息学工具实现多模态空间代谢组学分析。MIR成像与MSI的结合代表了空间代谢组学领域的突破性进展，为深入探索健康与疾病状态下代谢过程的空间与化学复杂性提供了前所未有的机遇。这一多模态方法在推动生物标志物发现、疾病诊断及治疗开发方面的创新具有重要意义。

引言

空间代谢组学通过将质谱成像（MSI）或其他具有空间分辨能力的技术与代谢分析相结合，能够在组织原位中对代谢物进行定位，从而在亚组织、细胞或亚细胞水平上揭示代谢特征^{1,2,3,4,5,6,7,8}。在这些成像技术中，中红外（MIR）显微技术因其能够基于分子振动差异实现生物分子的化学图谱绘制而日益受到关注^{4,7,9,10,11,12}。MIR成像具有非破坏性、无需标记、高速且成本低等优势^{4,7,9,10,11,12}，使其特别适合与MSI联用，形成一种具有前景的多模态方法，用于全面的空间分析。

基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）是空间代谢组学中最广泛应用的技术之一（图1A）¹³。该技术能够高灵敏度地检测多种代谢物，包括脂质、氨基酸、糖类、核苷酸以及次级代谢物¹。基质选择（如2,5-二羟基苯甲酸[DHB]、9-氨基吖啶[9AA]或N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐[NEDC]）和电离技术（如后电离方法）的进步进一步扩展了检测覆盖范围，尤其提升了对低丰度和难电离物种的检测能力¹⁴。现代MALDI-MSI系统的成像速度通常为每秒5至50个像素，具体取决于空间分辨率和所使用的质谱分析器类型（如飞行时间[TOF]、Orbitrap或傅里叶变换离子回旋共振[FT-IRC]）。值得注意的是，高速MALDI-TOF仪器已实现每秒超过100个像素的成像速率，可在数小时内完成大范围区域的成像¹⁵。MALDI-MSI的空间分辨率通常在5至50 µm之间，足以分辨细胞乃至亚细胞结构^16,17。然而，更高的空间分辨率通常伴随着更长的数据采集时间、信噪比降低，以及在数据处理过程中更高的计算资源需求。

与质谱成像（MSI）不同，MIR成像是一种宽场光学方法⁴，使其具有内在的非破坏性和高通量特性。近年来，高功率量子级联激光器（QCLs）的进步推动了一种称为离散频率红外（DFIR）成像的新框架的发展，显著提升了成像速度，可达视频速率（图1B)^12,18此外，量子级联激光器（QCL）光源使得非制冷微测辐射热计探测器可用于中红外成像，从而能够使用更大的焦平面阵列（FPA）探测器¹²因此，可获得单频中红外图像，覆盖范围为1 cm² 可在数秒内以细胞级分辨率（约5 µm）获取成像区域。中红外成像可同时在无标记和标记模式下运行。在以往的研究中^4,19,20，已引入小型红外活性振动探针以监测多种代谢活动的动力学过程 原位这些探针通过独特的中红外光谱带报告全局化学转化，从而实现对代谢途径的实时追踪。⁴因此，MIR成像能够以高空间分辨率和快速采集速度，实现静态生化分析和动态代谢监测。

在本文中，我们介绍了一种用于执行中红外（MIR）引导的基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）空间代谢组学的综合工作流程，证明了从同一样本中同时获取两种模态数据的可行性（图2，图3）。通过将MIR成像与MSI相结合，我们建立了一种多模态方法，充分利用了两种技术的互补优势。MIR成像能够在细胞分辨率下对整张切片进行快速、无需标记的生化图谱绘制，为后续MSI采集中的感兴趣区域（ROI）选择提供有价值的指导。该策略使得MSI工作流程更具针对性和高效性，缩短了采集时间并降低了成本，同时增强了空间代谢组学数据的可解释性和生物学相关性。反过来，MSI为MIR高光谱图像提供了高度详细的分子注释，有助于更深入地理解组织生化特征。总体而言，这种整合方法在推动生物标志物发现、疾病诊断和治疗开发方面具有巨大潜力。

方案

本实验方案严格遵循复旦大学实验动物资源中心机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的动物实验方案（DSF-2024-004）进行。

注意：本研究提供了一种在同一组织切片上进行中红外成像（MIR imaging）和基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）的工作流程。该整合方法涵盖实验操作、图像共定位、数据融合以及下游生物信息学分析（图1C）。中红外成像作为前置检测手段，可实现对组织进行无损、无需标记的生化图谱绘制。基于中红外成像提供的空间信息，随后针对性地施加基质以进行MALDI-MSI检测。在完成精确共定位后，将多组数据整合并进行多变量联合分析（图4），从而借助先进的计算工具实现全面的空间代谢组学研究。

1. 样品制备

1. 组织样本制备
   1. 小鼠组织采集
      1. 将 C57BL/6J 小鼠（20 周龄，40 g）饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中，维持 12 小时光照/12 小时黑暗的循环，并自由摄取食物和水，以确保实验前动物处于最佳健康状态。
      2. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（剂量为 50 mg/kg 体重）对小鼠进行麻醉，以确保深度麻醉。在进行灌注前，监测动物并确认其足底反射和角膜反射消失。
      3. 在 150 mmHg 的可控压力下，经左心室灌注约 20–30 mL 含肝素（5 IU/mL）的冷 PBS，持续 6 分钟 ，以冲洗血液并使器官去血，随后取出组织。
      4. 立即用液氮快速冷冻所有采集的组织，并在 -80 °C 下保存以供后续分析。
         注意：快速冷冻至关重要，可防止冰晶形成，避免组织形态发生扭曲。
   2. 组织包埋与冷冻切片
      1. 将切片机设定为 -20 °C，并用乙醇（EtOH）对腔室和刀片进行去污染，以清除残留的包埋介质。将 CaF₂ 载玻片、载片盒、样品夹持器和组织样本置于冷冻切片机中平衡温度。
      2. 将组织修剪至约 5 mm × 5 mm × 3 mm，置于标准冷冻模具中，用 10% 明胶在 -20 °C 下包埋，并确保切片方向正确。将包埋好的样本在干冰上速冻，并在 -80 °C 下保存至进行冷冻切片。
      3. 将组织从模具中取出，修剪多余部分以优化切片效果，并使用超纯水将其固定在样品夹持器上，以确保牢固粘附。
      4. 切取厚度为 10 µm 的切片，并将切片固定于预处理的 CaF₂ 基底上，在 -80 °C 下保存。
      5. 在进行中红外成像前，将装载组织切片的基底放入真空冷冻干燥机中。设定腔室压力为 0.1 mPa，温度为 -100 °C，干燥样品 30 分钟。
2. 细胞样本制备
   1. 将 1.25 × 10⁵ 个 HeLa 细胞接种于标准培养板中的直径为 13 mm 的圆形 CaF₂ 基底上。使用含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）。在标准培养条件下（37 °C，5% CO₂）孵育 24 小时。
   2. 24 小时后，小心移除培养基，并在室温（RT）下用 PBS 缓冲液溶解的 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞 20 分钟。
   3. 用 HBSS 缓冲液将固定后的细胞清洗三次，再用 ddH₂O 额外清洗三次。
   4. 在进行中红外成像前，于室温（RT）下将 CaF₂ 基底完全空气干燥。

2. 多模态图像采集

1. 量子级联激光器（QCL）中红外图像采集
   1. 使用配备非N的QCL-MIR显微镜进行QCL中红外成像显微术₂- 液体冷却的微测辐射热计 520 × 480 焦平面阵列（FPA）探测器及空间相干性降低技术。
   2. 选择950 cm的光谱范围^-1 至 1800 cm⁻¹^-1.
   3. 使用4×物镜，数值孔径（NA）为0.6，得到名义像素大小为4.25 µm。
   4. 在洁净的CaF上采集背景光谱₂ 底物在4 cm处^-1 光谱分辨率
   5. 根据组织形态选择采集区域，并以 4 cm 的光谱分辨率采集光谱数据^-1. 在此光谱分辨率下，图像采集速度约为 0.3 mm²/ s.
      注意：所有测量均采用透射模式，使用CaF₂窗片进行。₂ 载玻片，需手动调节焦距。
2. 质谱成像数据采集
   1. 基质应用
      1. 使用MIR成像后的组织切片进行MALDI-MSI分析，用Tippex笔在组织周围标记定位点，并使用平板扫描仪采集MSI前的光学图像，用于图像配准。
      2. 将NEDC基质配制成7 mg/mL的甲醇/乙腈/去离子水溶液（体积比为75:25:5），然后经0.2 µm滤膜过滤以去除颗粒物。
      3. 将标记好的组织切片装入自动基质喷涂仪中。使用预设参数将NEDC基质点样至样本上。
   2. MALDI-MSI 测量
      1. 将0.2 µL红色磷悬浮液滴加到CaF上₂ 用作外部质量校准标准的样品片。
      2. 将包被基质的载玻片固定在载玻片适配器中，确保与支架形成良好的电接触。将样品板装入基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）系统。
      3. 使用定位标记将载玻片的光学图像与MALDI载台的XY电机坐标对齐。定义用于组织分析的感兴趣区域（ROI），并包含一个 "仅含基质" 作为阴性对照的区域。
      4. 将仪器设置为负离子模式，像素大小为 20 × 20 µm²，涵盖一个 m/z 50–1000 范围内进行质谱校准，使用红磷点在开始数据采集前完成质量校准。使用商业数据处理平台进行数据采集。

3. 图像数据预处理与分析

注意：MATLAB 自定义代码已作为补充文件1上传。

1. QCL-MIR 数据预处理与分析
   1. 数据预处理
      1. 以适合进一步分析的格式导出高光谱数据。
      2. 使用 CytoSpec 和 MATLAB 进行数据预处理，遵循以下步骤 3.1.1.3–3.1.1.8。
      3. 将中红外（MIR）光谱数据导入 CytoSpec v2.00.07 中进行预处理。
      4. 使用 CytoSpec 内置的质量检测模块评估光谱质量。选择标准 2（样品厚度）以评估样品的一致性。将光谱积分范围设置为 950–1800 cm^-1。定义吸光度阈值在 50 至 1000 单位之间，以排除过薄或过厚区域的光谱。
      5. 在 CytoSpec 中使用基于主成分分析（PCA）的滤波方法降低噪声。保留前 10 个主成分（PCs），以消除高频噪声，同时保留关键的生化变异信息。
      6. 将以 .mat 格式从 CytoSpec 导出预处理后的光谱数据，用于在 MATLAB 中进一步分析。
      7. 在 MATLAB 中使用橡胶带校正算法对 950–1800 cm^-1 光谱范围进行基线校正，以消除基线漂移并提高光谱准确性。
      8. 在同一光谱范围内应用最小-最大缩放（min-max scaling）进行光谱归一化，以标准化所有光谱的强度，确保整个数据集内的可比性。
   2. 数据分析
      1. 识别与蛋白质相关的特征峰：1550 cm^-1 和 1650 cm^-1，分别对应于酰胺 II 和酰胺 I 谱带；识别与脂质相关的特征峰：1740 cm^-1，代表酯键 C=O 伸缩振动。
      2. 计算酰胺 I 谱带（1650 cm^-1）与酯键 C=O 伸缩振动（1740 cm^-1）的强度比值，并生成比值图，以可视化空间上脂质与蛋白质的分布情况。
      3. 无监督聚类分析：对高光谱数据执行层次聚类分析（HCA），采用欧几里得距离和 Ward 连接法，根据光谱相似性对区域进行分类。生成聚类图以识别生化特征不同的区域，并揭示结构或病理差异。
2. 质谱成像（MSI）数据预处理与分析
   1. 将原始 MSI 数据导入商业数据分析平台。
   2. 进行峰提取，相对强度> 0.01%。
   3. 通过将实验峰列表与仅含基质的对照区域获得的谱图进行比较，排除源自基质的峰。去除在对照谱图中出现且信噪比（SNR）小于 3 的所有峰。
   4. 将数据集归一化至均方根（RMS），以校正不同像素和样品间离子信号强度的变异性。
   5. 通过基于组织分布特征进行筛选、与人类代谢组数据库（HMDB）条目匹配以及与理论 m/z 值的一致性，进一步优化代谢物鉴定。
   6. 根据实验目标和组织背景选择相关代谢物。
   7. 将所选特征在所有像素中的强度导出为 CSV 文件。
   8. 应用降维技术（如 PCA、t-SNE 或 UMAP），利用 Seurat 和 Banksy 等生物信息学工具降低数据复杂性，识别具有相似代谢特征的像素簇，从而实现空间代谢异质性的可视化。

4. 多模态图像配准与联合分析

1. 选择在 1650 cm^-1 处获取的 MIR 图像作为共配准的空间参考。该特定波数可突出显示酰胺 I 蛋白吸收带，提供较强的组织对比度。
2. 对 MIR 和 MSI 图像的强度值进行归一化处理，以增强视觉可比性。应用对比度增强技术，例如使用 MATLAB 中的 histeq 函数进行直方图均衡化，以重新分布图像强度，提高对控制点选择至关重要的结构特征的可见性。
3. 使用 Image Processing Toolbox 中的 cpselect 函数将 MIR 和 MSI 图像加载到 MATLAB 中。该函数将打开一个用于控制点选择的交互式界面。
4. 使用 cpselect 函数在 MIR 和 MSI 图像上手动标注 5 至 10 个解剖结构相关且分布良好的控制点。这些控制点应对应于清晰的形态学特征，例如组织边界。
   注：将控制点均匀分布在图像视野中，以最小化局部形变。
5. 导出并记录两幅图像中标注的控制点坐标。将其存储为两个对应的数组，用于变换计算（例如 movingPoints 和 fixedPoints）。
6. 使用 MATLAB 的 fitgeotrans 函数在 Affine 模式下计算仿射变换矩阵。该变换可校正缩放、旋转、平移和剪切。
7. 使用 MATLAB 中的 imwarp 函数将计算得到的变换应用于 MSI 图像。此 步骤生成一幅空间配准后的 MSI 图像，其几何结构与 MIR 参考框架对齐。
8. 使用 imshowpair 函数在 blend 模式下目视检查配准效果，叠加 MSI 与 MIR 图像，确认结构特征的正确配准。
9. 使用 MATLAB 中的 imbinarize 函数将配准后的 MSI 图像和参考 MIR 图像转换为二值掩膜。
10. 计算 Dice 相似性系数（DSC），以量化两个二值掩膜之间的空间重叠程度。DSC 定义为：DSC = 2 ×（重叠区域面积）/（两个掩膜总面积）。DSC 值接近 1.0 表示空间重叠度高，配准精度高。
    注：如有必要，可通过调整控制点数量或位置并重复变换过程来优化配准。若仍存在局部错配，可考虑使用非刚性配准方法。
11. 保存配准后的图像、变换参数及控制点坐标，用于后续多模态图像分析，例如生物化学特征与结构特征的空间相关性分析。

结果

为了验证上述多模态空间代谢组学策略，我们在一种小鼠癌症模型中实施了该方法。肿瘤细胞经过基因改造以表达绿色荧光蛋白（GFP），从而可通过荧光成像精确定位肿瘤区域。图2A展示了无标记的QCL-MIR成像结果，光谱范围为950–1800 cm^-1，该范围被称为“指纹区”。图2A中标注了典型的中红外吸收峰，例如P=O伸缩振动（1240 cm^-1，核酸和磷酸脂类）、酰胺II带（1550 cm^-1，蛋白质）、酰胺I带（1650 cm^-1，蛋白质）以及酯基C=O伸缩振动（1740 cm^-1，甘油酯类）。

GFP荧光信号作为内部参照，用于评估肿瘤区域的空间对应性（图2B）。酰胺I和酰胺II谱带的光谱积分图（图2C）显示，在GFP标记的肿瘤区域中吸收度降低...

讨论

本文介绍了一种多模态空间代谢组学策略，该策略整合了质谱成像（MSI）与中红外（MIR）成像技术，能够在相同样本上实现高通量、分子特异性的代谢谱分析。MIR成像基于分子振动实现无需标记、非破坏性的化学图谱绘制，可提供详细的分子结构与官能团信息；相比之下，MSI在代谢物鉴定与定量方面具有高灵敏度与高特异性，已成为代谢组学研究的核心技术。通过整合这两种成像模式，可充分利用MIR成像的化学特异性与MSI的分子精确性之间的互补优势，从而更全面地揭示代谢异质性。

所提出的多模态平台的一个关键优势在于其能够实现空间分辨的兴趣区域（ROIs）识别，从而指导靶向质谱成像（MSI）的数据采集。高通量中红外（MIR）成像作为一种快速、无需标记且非侵入性的成像方式，可用于指导兴趣区域的选取²¹。与传统在相邻组织切片上进行的组织学染色相比，MIR成像避免了因切片间错位导致的空间不匹配问题，并减少了样品制备步骤²²；同时，它能够在同一组织切片上实现兴趣区域的定位，从而简化工作流程并降低变异度

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 多聚甲醛，组织固定液	Sangon Biotech	E672002
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	126615
C57BL/6JNifdc 小鼠	查尔斯河实验室（Charles River）	219
CaF2 载玻片	Crystran	CAFP25-1
冷冻切片机	达科威生物技术	CT520
Cytospec	Peter Lasch	版本 2.10.01	用于MIR数据分析的软件，包括基线校正、归一化、图像生成和高光谱分析。
DPBS 缓冲液	Fisher Scientific	14-190-250
胎牛血清	Gibco	10270106
冻干机	LABCONCO	FreeZone
明胶	Sigma-Aldrich	G1890	I型胶原蛋白，源自猪皮
HBSS 缓冲液	Sangon Biotech	A003210
高糖DMEM	赛默飞世尔科技	10564011
Matlab	MathWorks	Matlab R2024a	用于MIR数据分析的软件，包括基线校正、归一化、图像生成和高光谱分析。
基质辅助激光解吸电离质谱成像系统	布鲁克道尔顿公司	timsTOF fleX MALDI-2
甲醇	国药集团化学试剂	10014108
mMass	捷克共和国捷克科学院生物中心昆虫学研究所	版本 5.5.0	用于质谱成像数据分析的软件。将原始质谱成像数据导入SCILS Lab进行预处理。  在 mMass 中进行相对强度峰提取 > 0.01%.
N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐（NEDC）基质	Sigma Aldrich	222488
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技	15140122
量子级联激光器  中红外（QCL-MIR）显微技术	布鲁克光谱有限公司	LUMOS II ILIM
红磷	Sigma-Aldrich	8.0727
SCiLS Lab	布鲁克·道尔顿	SCiLS Lab 2024b	用于质谱成像数据分析的软件。将原始质谱成像数据导入SCILS Lab进行预处理。  在 mMass 中使用相对强度进行峰提取 > 0.01%.
喷雾器	HTX Technologies	TM
0.25% EDTA 胰蛋白酶	赛默飞世尔科技	C25200072