用于研究神经修复与功能恢复的小鼠坐骨神经横断/再缝合手术操作

摘要

本方案描述了一种在小鼠中进行坐骨神经横断与再缝合的模型，用于利用成年背根神经节神经元研究周围神经再生。该模型可实现 体内 轴突再生、肌肉再支配及神经损伤后功能恢复的分析

摘要

神经修复对于轴突损伤后功能的恢复至关重要。然而，由于内在生长能力减弱以及所处环境不利，中枢神经系统（CNS）中的成熟神经元在损伤后其轴突再生能力十分有限。相比之下，外周神经系统（PNS）中的神经元表现出较强的再生潜力。其中，成年背根神经节（DRG）神经元因其在外周神经损伤后能够有效再生而尤为知名，是研究神经修复背后细胞与分子机制的理想模型。本文介绍了一种改良的显微缝合技术，称为“切断前打结法”（loop-before-transection），用于在小鼠中建立坐骨神经切断后再缝合的模型，并随后分析轴突再生情况。同时展示了行为学评估和肌肉再支配实验，以评价功能恢复状况。在坐骨神经切断并重新缝合后，动物最初表现出行为功能缺陷，但通常在损伤后30天即可观察到完全恢复。在损伤部位应用促进轴突融合的药物可显著加快功能恢复进程。该模型系统为在活体（in vivo）条件下研究哺乳动物神经修复的调控机制提供了有力工具。

引言

轴突损伤是脑和脊髓损伤中常见且严重的后果，通常由创伤性损伤、神经毒素或神经系统疾病引起，这些因素会破坏神经连接并阻碍轴突再生^1,4。 并非所有神经元都具备再生的内在能力，而这种能力对于断裂轴突的修复至关重要。轴突再生速率受多种因素影响，包括神经元的内在生长潜力、蛋白质合成效率、细胞骨架动态、髓鞘碎片的清除以及生长因子的可获得性^3,4。

在成年哺乳动物中枢神经系统（CNS）中，轴突损伤导致再生能力下降，主要原因是缺乏内在的促生长因子以及存在抑制性的外在信号^1,5。相比之下，外周神经系统（PNS）中的轴突在损伤后具有较强的再生能力，这归因于外周神经元内在的自我修复机制以及促再生生长程序的快速重新激活。损伤发生后，轴突的远端部分与神经元胞体分离，并经历瓦勒变性（Wallerian degeneration），其特征是轴突的解体和断裂^6,7。胶质细胞高效清除轴突和髓鞘碎片对于成功再生至关重要，因为这可以防止形成阻碍轴突生长的瘢痕组织^3,8。该过程与损伤轴突的细胞骨架重塑共同作用，支持近端残端的再生，并促进靶组织的重新支配。这些事件发生在部分重叠的阶段中，期间损伤诱导的转录因子（如ATF3和c-Jun）被激活，进而促进促再生相关基因表达程序的启动^4,9,10。

再生性轴突融合是轴突损伤后恢复神经元连接的一种高效机制¹¹。该过程最早于1967年在克氏原螯虾Procambarus clarkii中被描述¹²，此后已在多个物种中得到证实^13,14,15,16，包括秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans¹⁷。尽管在哺乳动物中关于轴突融合的直接证据仍有限，但诱导融合的策略已成功用于促进神经修复¹¹。值得注意的是，化学促融剂聚乙二醇（PEG）可促进膜的重新封闭，并已在哺乳动物模型中被证明可促进周围神经和脊髓损伤后的功能恢复^{18,19,20,21,22,23,24}。最新研究发现，谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的耗竭足以促进C. elegans中的轴突融合²⁵。类似地，Gpx4条件性敲除小鼠或经GPX抑制剂ML162处理的小鼠在坐骨神经横断后表现出加速的功能恢复，这可能归因于增强的轴突融合²⁵。

坐骨神经是一种混合神经，由感觉、躯体运动和自主运动轴突组成²⁶。在大鼠中，它起源于L4和L5脊髓节段²⁷，而在小鼠中则起源于L3和L4节段²⁸。由于其易于接近且解剖结构一致，坐骨神经损伤已成为研究周围神经再生最广泛使用的模型之一^29,30。 这些模型可用于研究影响轴突生长和功能恢复的内在神经元机制及外在环境因素^3,4,9。在神经科学中，采用坐骨神经挤压作为实验范式的历史可追溯至19世纪末²⁹。除了神经挤压模型外，神经横断也广泛用于研究轴突再生和功能恢复。然而，由于小鼠坐骨神经体积小且质地脆弱，经典的坐骨神经横断后缝合操作往往比在大鼠中更难重复且可靠性较低³¹。

采用一种改良的坐骨神经横断与再缝合模型，称为"横断前打结"模型，成功建立了可重复的坐骨神经横断与再缝合模型²⁵。该方法通过在切断神经前预先置入缝线，避免了横断后对神经的额外操作，从而减少了机械性损伤，并降低了因手术技术差异带来的实验变异性。研究发现，适度水平的GPX调控有助于小鼠坐骨神经完全横断后的功能恢复²⁵。在坐骨神经横断（SNT）/再缝合损伤模型中，联合使用低浓度ML162（0.25 µM）³²（一种GPX抑制剂）和聚乙二醇（PEG，500 mM）^{18,19,20,21,22,23,24}，可显著改善针刺反应、足部错误不对称性和脚趾伸展试验所评估的行为学评分^25,33,34。哺乳动物背根神经节（DRG）神经元远端轴突片段在3天内发生退变，导致神经肌肉接头（NMJ）中断^6,35；而再生的DRG神经元将重新支配肌肉以恢复其功能。SNT/再缝合-ML162/PEG联合治疗组在术后早期（术后3天）即显示出神经再支配的NMJ及改善的行为学评分，表明神经肌肉功能实现了早期恢复²⁵。

此处， "结扎前打结" 描述了实现上述小鼠观察结果的显微缝合方法和药物给药方式。对先前建立的聚乙二醇融合（PEG-fusion）方案进行了修改，该方案原本可用于快速修复切断的大鼠神经¹⁸聚乙二醇（PEG）最初被报道可促进切开的螯虾内侧巨大轴突（MGA）的外源性重新连接 体外³⁶PEG 融合方案在涉及大鼠坐骨神经 crush-severance 损伤的实验中，有 25%–30% 的试验显示出行为学功能的改善，但在早期时间点未观察到功能恢复。³⁴随后的改进引入了内源性膜封闭的概念³⁷神经损伤后，快速的质膜修复具有神经保护作用，并能防止神经退行性变。Ca²⁺-诱导的膜结合囊泡积聚有助于此封闭过程³⁸完全性神经横断损伤会破坏损伤部位的轴膜以及神经内膜、神经束膜和神经外膜鞘。通过显微缝合神经外膜鞘，可使近端与远端神经残端对齐。在缝合步骤中，使用 Ca²⁺无钙低渗盐水可减少膜结合囊泡的形成，使神经内膜和神经束膜保持开放状态，便于外膜缝合时紧密对合。随后应用 Ca²⁺含盐水溶液诱导囊泡聚集，以封闭残留的细胞膜损伤¹⁸.

本方案中使用了成年FVB小鼠（8-10周龄）和C57BL/6小鼠，未观察到品系间的特异性差异。小鼠坐骨神经位于大腿中部水平臀肌下方约1-2 mm处，与大鼠相比，其直径更细且更为脆弱，因此在解剖和缝合过程中需要更高的手术精度。操作时必须注意避免过度牵拉神经或过度操作，以免影响功能恢复。该方法涉及完全切断神经，导致近端与远端神经残端之间形成物理性缺损。由于此缺损会阻碍轴突的直接再生，成功的功能恢复通常需要显微外科干预或神经移植。

由于小鼠坐骨神经比大鼠的更细且更脆弱，因此需要更高的手术精度。尽管显微缝合技术已被广泛使用，但过度操作或反复穿针可能无意中造成额外创伤³⁹。这些局限性可能引入实验变异，并可能干扰对新型治疗策略的评估。因此，在坐骨神经横断模型中，实现稳定的手术效果并尽量减少缝合所致的神经损伤，对于可靠评估功能恢复至关重要。通过采用这种"横断前打结"的方法，建立了可重复的坐骨神经横断与再缝合模型，并评估了聚乙二醇（PEG）与ML162联合治疗对功能恢复的影响。总体而言，尽管小鼠坐骨神经横断模型应用广泛，但由于神经体积小且脆弱，仍存在较大的技术挑战。本文所述的改良再缝合方法，满足了建立一种可重复、标准化且能最大限度减少机械性损伤的显微外科操作方案的关键需求。

方案

所有动物实验均按照圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的指南进行（方案编号：20200082AR）。本 JoVE 实验方案中使用了成年雄性和雌性 FVB 小鼠（8–10 周龄，20–25 g）。C57BL/6 小鼠（8–10 周龄，20–25 g）仅用于正式实验前的初步练习手术，以优化操作技巧和缝合精度。这些练习实验确认，"切断前打结"操作在两种品系中均产生可比的结果；因此，本文报告的所有正式数据均来自 FVB 小鼠。最初共有十只 FVB 小鼠（五只雄性、五只雌性）被纳入坐骨神经切断后接受 ML162 + PEG 治疗的实验。其中一只动物存在先天解剖变异，其坐骨神经在切断部位之前已分为两个主要分支，导致手术不完全，因而被排除在分析之外。因此，行为学和组织学分析基于九只动物（n = 9）进行。两性在再生能力和行为恢复方面表现相当，未观察到性别特异性差异。另有一只小鼠接受了双针缝合穿透但未进行神经切断（假手术对照），以评估缝合操作本身对行为学结果的潜在影响。在再生反应方面，两性之间未观察到明显差异。动物饲养于标准条件下，光照/黑暗周期为 12 小时，温度 75 °F，相对湿度 40%–60%，食物和饮水自由获取。实验中同时使用了雄性和雌性小鼠，且未观察到两性动物之间的明显差异。手术操作在 SomnoSuite 低流量麻醉系统的异氟烷麻醉下进行。行为学测试从术后第 2 天开始，并在第 4、7、10、14、18、22 和 27 天重复进行，具体时间点见相应图示。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 坐骨神经横断/缝合及药物处理

1. 将动物置于加热垫上，以便在体视解剖显微镜下观察坐骨神经图1A).
2. 使用SomnoSuite低流量麻醉系统对小鼠进行麻醉。
   注意：手术开始前，需通过确认动物对脚趾夹捏等刺激无反射性反应，以评估麻醉深度。向眼睛涂抹兽用眼膏，以防止角膜干燥。
3. 剃除大腿及周围区域的毛发。
   注意：尽可能彻底地清除剃除和脱落的毛发。否则，毛发会粘附在10-0尼龙缝线上并污染坐骨神经。剃毛后可用实验室胶带或透明胶带轻轻粘除残留毛发，以确保手术区域清洁。使用经高压灭菌的棉球，依次以70%乙醇、碘伏及70%乙醇擦拭剃毛区域，对手术部位进行消毒。
4. 定位股骨，在大腿中段水平，沿股骨后侧约1 mm处，使用精细手术剪做长约1.0 cm（范围0.8–1.2 cm）的小切口，切口方向与股骨平行。
   1. 轻柔地牵开臀大肌，以暴露其下方的股二头肌。然后使用剪刀尖端轻柔分离股二头肌的前头和后头，注意不要剪切，以暴露坐骨切迹下方的坐骨神经。上述操作均在直视下进行，而非在显微镜下。
5. 使用显微镊将坐骨神经从体内拉出，以方便进行坐骨神经手术（图1A).
   注意：用胶带固定镊子，防止其张开超过一定程度，以尽量减少对坐骨神经的损伤。将镊子尖端置于坐骨神经下方，以小鼠大腿为支点，向上抬起坐骨神经。注意仅需抬起神经至便于缝合的程度，避免施加张力或向外牵拉，过度牵拉可能损伤轴突或周围结构。
6. 将显微镜聚焦于暴露的坐骨神经。从这一步开始，继续进行至第15步 使用显微镜（图1A).
7. 用10-0尼龙缝线穿透坐骨神经两次（图1B，C）。对于未切割对照组，进入步骤1-8；对于神经横断组，进入步骤1-11。
   注意：两次穿刺位置位于预定横断位置两侧，相距约一个神经宽度（~0.7 mm），呈对称分布。该间距可确保近端与远端神经残端正确对位，同时最大限度减少损伤部位的机械应力。使用缝线穿过坐骨神经中心进行穿刺，确保缝线形成的两个穿刺点精确平行。10-0 缝线非常细小，需用超细镊子进行操作。选用不可吸收的 10-0 尼龙缝线，因其在 30 天观察期内具有优异的抗张强度和极低的组织反应性。该材料已广泛应用于小鼠和大鼠的显微外科神经修复模型。^18,31未使用可吸收缝线，因为其逐渐降解可能在神经功能完全恢复之前影响横断神经断端的对位。为尽量减少操作者间差异，所有手术操作均由一名经过大量显微外科训练的外科医生在体视显微镜下完成。 "结扎前打结" 该方法本身通过消除横断后对神经的额外操作，进一步减少了实验变异，从而确保不同动物之间神经对接的一致性和张力。这需要大量的练习和高超的操作技能。在进行动物手术前，初学者可在体视显微镜下使用细的合成线（如牙线）练习缝合动作，以提高操作的灵巧性和控制能力。
8. 用尼龙缝线仔细打一个结。
9. 将暴露的坐骨神经置于肌肉层下方，使用4-0尼龙缝线缝合皮肤。
10. 确定坐骨神经使用10-0尼龙缝线进行双穿刺不影响小鼠行为。
    注意：为验证这一点，对接受双缝线穿刺但未进行横断的小鼠进行了与实验组相同的各项行为学测试，包括针刺反应、足部错误不对称性和脚趾伸展测试。这些小鼠的测试得分始终与未手术的野生型对照组相当，表明仅缝线操作本身并未损害坐骨神经功能。
11. 使用手术刀在两条10-0尼龙缝线之间的坐骨神经中点处切断图1D).
    注意：为了尽量减少变异，所有手术均由同一名经过培训的实验人员采用标准化操作程序进行。此外， "结扎前打结" 设计本身通过避免切断后对神经的额外操作，最大限度地减少了变异，确保所有动物的缝合位置和张力保持一致。在解剖显微镜下验证缝合位置，以确保各动物之间的一致性。
12. 将镊子收好。
13. 用不含 Ca²⁺ 的溶液冲洗切断的神经²⁺无磷酸盐缓冲液（PBS；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄NaH₂PO₄，pH 7.4），不加氯化钙配制
    注意：用无钙 PBS 冲洗切断的神经残端约 10–20 秒，以清除血液并防止过早封闭。应于 1–2 分钟内迅速完成重新缝合，以保持组织对齐和活性。
14. 去除 Ca²⁺用纸巾吸去多余的 PBS。
15. 用尼龙缝合线小心打一个结（图1E如果不需要进行药物处理，则继续执行第20步。
    注意：显微缝合采用标准方结，即在体视显微镜下用精细镊子轻柔打两个相反方向的结。通过缝线连接的两条离断轴突恢复至接近其原始形态。离断血管的重新连接可作为近端与远端神经残端正确对位的视觉指标。操作过程中，组织应保持新鲜湿润，无苍白或受压表现。避免过度收紧缝线，以免导致血管塌陷或神经变形。在打最后一个结之前，应确保神经断端无张力对合。必要时可轻柔调整肢体位置以促进神经自然对齐，避免牵拉神经，因为过度张力可能增加神经瘤或纤维化的风险。
16. 使用注射器将溶于PBS的0.25 µM ML162（DMSO稀释）置于缝合后的坐骨神经上，使缝合后的坐骨神经浸入药物中1分钟。
17. 用无菌棉签吸除ML162。
18. 使用注射器将预热至 37 °C 的 500 mM PEG 溶液滴加到缝合后的坐骨神经上，使缝合后的坐骨神经在药物溶液中浸泡 1 分钟。
    注意：500 mM PEG 溶液浓度较高，在室温下可能凝固。操作时应将注射器置于加热垫上，以确保 PEG 保持液态。PEG 被认为可通过去除相邻脂质双分子层之间的水分子，促进膜融合，从而实现膜的紧密接触并触发自发融合。尽管其精确的分子机制仍在研究中，但已有研究表明，该方法可在周围神经损伤模型中促进轴突连续性并增强功能恢复。
19. 用纸巾吸除PEG。
20. 用 Ca 洗涤缝合后的神经²⁺含 PBS（添加 1 mM CaCl 的 PBS）₂；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.4）。
21. 去除 Ca²⁺用组织吸收法去除含 PBS 的液体。
22. 将暴露的坐骨神经置于肌肉层下方，使用4-0尼龙缝线缝合皮肤。
23. 待动物从麻醉状态恢复后，将其放回笼中。
    注意：皮肤缝合后，手术部位涂抹含有止痛成分的局部抗生素软膏。每只动物在加热垫上进行监测，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。动物随后单独饲养，直至运动功能完全恢复后才重新放回群体。尽管手术环境未在层流罩内进行，但所有手术器械均经过灭菌处理，且操作过程中均采用无菌技术，佩戴手套并使用无菌器械。

2. 行为学测试 - 针刺法

注意：用于评估损伤后对高强度机械刺激的反应性³³。

1. 将小鼠放入金属网格中，使其自由活动30分钟，以适应新环境。
2. 将后肢足底最外侧区域分为5个部分（A至E）。使用Austerlitz针（规格000）轻轻触碰同侧足底表面。从最外侧脚趾（区域A）到足跟（区域E）的方向，每个区域进行两次针刺刺激。
   注意：切勿刺破皮肤。
   注意：当动物在两次针刺刺激下迅速将足部移开时，视为阳性反应。该区域评分为1，随后继续测试下一个区域（最高5分）。若两次刺激均未引发阳性反应，则该区域总评分为0。使用同侧隐神经支配区域作为阳性对照，该区域始终会引发阳性反应。

3. 行为学实验 - 足错步（FF）不对称性

注意：用于测量坐骨神经轴突对更近端肌肉的支配程度³⁴。

1. 将动物置于笼子上方的金属丝网格上，使其自由活动，以适应环境。每次试验每只后肢共行走50步。
2. 记录动物发生踏空时的情况。评分标准如下。
   评分1分：部分踏空。腿部在完全滑出至大腿之前已收回。
   评分2分：完全踏空。腿部完全滑出至会阴部。
3. 在每个术后时间点，根据所有动物损伤和未损伤后肢的总踏空情况计算综合踏空评分。
   综合踏空评分 = （部分踏空次数 × 1）+（完全踏空次数 × 2）
4. 将综合踏空评分除以50（每肢总步数），得到每只后肢的踏空百分比。
    %踏空 = 综合踏空评分 / 50（总步数）× 100%
5. 用完整后肢的踏空比例减去损伤后肢的踏空比例，得到每只动物在特定术后时间点的不对称评分。
   踏空（FF）不对称评分 = %FF（完整肢体） - %FF（损伤肢体）

4. 行为学检测 - 趾展实验

注意：用于评估神经损伤后的运动功能恢复。根据先前的研究，脚趾外展运动试验在检测坐骨神经损伤后运动功能恢复方面比步态分析更为敏感³⁰。

1. 用一块布轻轻盖住动物，抬起尾巴以清晰观察后肢足部。
   注意：替代方法：轻轻抓住小鼠颈背部皮肤，固定尾巴，将其翻转，使小鼠轻微扭动，以便观察脚趾运动。
2. 按以下标准评定脚趾伸展评分：
   评分 2 分：完全伸展。定义为所有脚趾完全、充分且持续伸展至少 2 秒。
   评分 1 分：部分伸展。任何未达到完全伸展程度的动作，包括轻微颤抖或部分运动。
   评分 0 分：无伸展。完全无运动。
   注意：所有行为学评估（针刺反应、足错步实验和脚趾伸展）均由对处理分组不知情的实验人员进行双重核查。动物在手术时根据我们先前研究（Ko 等²⁵）所采用的设计随机分配至各处理组，共包括四种实验条件（仅再缝合、PEG、ML162、ML162 + PEG）。本文仅展示 ML162 + PEG 组的数据，在保持原始实验严谨性的前提下独立进行分析。

5. 组织灌注与组织学处理

1. 深度麻醉动物，并用磷酸盐缓冲液（PBS）进行心脏灌注 通过 左心室
2. 切开右心房以确保血液完全排出。
3. 将收集的组织置于4%多聚甲醛（PFA）中，4 °C条件下过夜浸渍以固定。
4. 用 PBS 清洗固定后的组织三次，然后在 4 °C 下用 PBS 孵育过夜。
5. 将组织浸入30%蔗糖溶液中，在4 °C下过夜以进行冷冻保护。
6. 将组织包埋于OCT包埋剂中，冷冻后使用冷冻切片机切取12 µm厚的切片。
7. 将组织块保存于 -80 °C，冷冻切片保存于 -20 °C，直至使用。
8. 单独采集坐骨神经时，可省略灌注步骤，因为血液含量对这些外周组织的免疫染色质量无显著影响。

结果

先前的PEG融合方案¹⁸ 经过改进以保持手术效果的一致性，并尽量减少缝合引起的神经损伤²⁵通过在横断神经前将缝线穿过神经，可最大限度减少横断后使用镊子夹持或针刺造成的损伤。为检验缝线穿过神经并打结对其功能的影响，将缝线在完整神经上穿过两次并打结。图2A，不进行SNT的缝合）。术后30天检查发现，穿过神经的缝线并未在神经上形成瘢痕图2A，仅缝合未进行SNT）。仅接受缝合而未进行SNT的小鼠在所有行为学测试中均表现正常，表明缝合所致的神经穿刺并未影响神经功能（图3B, 图4B，以及 图5B).

在之前的一项研究中，通过四个实验组...

讨论

利用神经横断模型进行神经再生研究在小鼠坐骨神经上被广泛开展^31,39。然而，由于小鼠坐骨神经体积小且质地柔软，使用手术器械轻柔操作较为困难，组织在缝合过程中容易发生撕裂。显微缝合过程常伴随过度操作，可能导致神经变形和创伤。即使尽量减少不必要的器械刺激，缝合后神经的过度移动仍可能导致对位不良，进而影响早期功能恢复。这些因素降低了横断模型中实验结果的一致性和可靠性，凸显了建立一种可重复且能最大限度减少神经损伤的手术方法的必要性。

该手术方案旨在控制变量的同时尽量减少外科医生的干预。在设计该手术方案时，考虑了以下因素：（1）尽量减少手术器械的使用，以降低对神经的刺激；尽可能避免使用镊子夹持神经；（2）尽量减少缝合打结的次数，因为打结操作也可能对神经造成足够程度的损伤；（3）尽量减少对手术医生操作技术的依赖。经过广泛评估后得出结论：神经损伤或变形最常见的原因是缝合过程中使用器械牵拉切断后的神经。因此，采用了一种在切断神经前先穿入并定位缝线的方法，从而避免在操作中使用手术器械...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#55 镊子	Dumostar-Biology	11295-51	每手各持一把。用于夹持10-0尼龙缝线时需使用两把。
10-0 尼龙缝线	DemeTECH	NL761000,4F0P
4-0 尼龙缝线	Matrix Wizard	0197
抗 β-tubulin 抗体	R&D Systems	MAB1195
抗 NF-200 抗体	Millipore Sigma	N4142
Austerlitz 000 号			用于针刺试验
CF488 标记的 α-银环蛇毒素	Biotium	00005
解剖剪刀	Kent Scientific
精细缝合剪刀	Kent Scientific
虹膜镊	Kent Scientific
K&H 小动物加热垫	K&H pet products
ML162	Millipore Sigma	SML2561
小鼠手术器械包	Kent Scientific
持针器	Kent Scientific
聚乙二醇（PEG）	Millipore Sigma	P5413
SCG10	Novus Biologicals	NBP1-49461
SomnoSuite	Kent Scientific		用于异氟烷麻醉
分路镊			用于暴露坐骨神经。