使用水培 14C-放射性标记实验和磷屏成像技术监测有机化合物在植物组织中的吸收与定位

摘要

本文概述了一种利用¹⁴C标记的有机污染物研究植物介导修复的方法。该方法包括水培植物的制备、放射性标记物的吸收以及磷屏成像技术，用于追踪污染物的吸收、转运和代谢过程。该技术为评估不同植物种类对各类环境污染物的植物修复潜力提供了有力工具。

摘要

植物修复，即利用植物减轻环境污染物的技术，为治理污染场地提供了一种可持续且成本效益高的方法。开发有助于阐明植物吸收和代谢污染物机制的方法，对于改进植物修复实践至关重要。本文介绍了一种利用放射性标记化合物评估植物对有机污染物吸收与转化的方法。 ¹⁴C标记的有机化合物，例如模型 ¹⁴C-环烷酸用于追踪其在植物组织中的吸收、转运、定位和代谢。我们此前已在多种植物物种中应用过该方法，包括 Elymus trachycaulus 和 Salix interior这些观察结果在本研究中通过模式植物得到了进一步验证， 拟南芥，采用改良霍格兰溶液水培法培养。通过监测放射性标记物的吸收情况 通过 液体闪烁计数与磷屏成像技术，可实现对植物组织内放射性标记化合物的可视化与定量分析。本方法详细描述了植物材料的制备、放射性标记化合物的使用，以及分析污染物在植物体内分布与归趋的过程。该方法还包括评估化合物分泌的策略，可用于评价植物对环境污染物的吸收与转运。该技术有助于理解植物介导的修复过程，可广泛应用于多种环境污染物及植物种类的研究。

引言

生物修复是一种由生物体（如植物和微生物）介导的环境修复技术。植物修复利用植物或植物产物从环境中去除污染物，可作为微生物修复的补充或替代方法，克服单独使用微生物修复时存在的一些局限性^1,2,3,4。由于植物依赖太阳能驱动其生理过程，植物修复具有成本效益，污染物可通过植物根系或茎叶被吸收，并在细胞和组织间转运，进而被代谢、固定或挥发⁵。最适合用于植物修复的植物通常具有较强的抗逆性和抗胁迫能力，同时具备高蒸腾速率、快速的生物量积累以及发达的根系，例如杨属（Populus）和柳属（Salix）植物⁶。作为固着生长的生物，植物在进化过程中发展出多种多样的代谢途径，以应对环境中的有毒化合物¹。这使得植物拥有丰富的基因资源和生化过程，从而增强其处理污染物的能力。

植物降解框架最初由 Sandermann 等人（1977 年）提出⁷，该框架描述了植物介导污染物解毒的三个阶段：转化、结合和区隔化。在每个阶段中，污染物都会经历酶促修饰，从而增加其亲水性、降低其毒性，并使其更易于被隔离或进一步矿化⁴。然而，由于植物主要依赖大气中的二氧化碳进行碳固定，其完全矿化有机污染物的能力可能有限。污染物可能反而被隔离在液泡或细胞壁中（植物固定），或挥发进入大气（植物挥发）¹。

植物修复研究中的一个关键挑战是检测植物是否能够从环境中吸收并转化有机污染物¹。传统的检测方法通常难以准确追踪污染物的吸收与转运途径，因而难以评估植物对特定污染物的修复能力^1,5。使用放射性碳-14（¹⁴C）标记的有机化合物为此问题提供了有力的解决方案。通过将植物暴露于¹⁴C标记的污染物中，研究人员可以追踪放射性标记的碳在植物组织中的结合情况，从而精确了解污染物的吸收、转运和转化过程。该技术有助于鉴定能够修复特定有机污染物的植物种类，并为评估所涉及的生理途径提供可靠手段。最终，¹⁴C标记化合物的应用深化了我们对植物修复潜力的理解，推动了更高效、更具针对性的环境修复策略的开发。

本文介绍了一种利用¹⁴C放射性标记的有机污染物来监测植物从水培溶液中吸收、转运及归趋这些污染物的方法。最近一篇文献描述了一种类似方法，用于追踪¹⁴C标记除草剂在叶面施用后的归趋⁸。然而，本文所述方法重点阐述如何评估放射性标记污染物从水培溶液中的去除与转运过程，并附有将该方法适用于土壤体系的改进建议。

方案

注意：在进行本实验方案之前，必须查阅相关机构及国家关于放射性同位素的安全指南和法规。简而言之，在操作所有放射性物质或可能接触过放射性同位素的物品时，应佩戴双层手套、实验服和护目镜。实验应在实验室指定区域内进行，并使用胶带标记含有放射性同位素的区域。此外，所有操作完成后，应立即清洗玻璃器皿和仪器，随后对其进行擦拭并检测是否存在放射性同位素污染。 通过 闪烁计数。所有在这些检测中使用过的材料和液体均按照卡尔加里大学和加拿大核安全委员会的指南，置于专用的放射性废物容器中并妥善处理。

1. 霍格兰溶液的制备

1. 使用市售混合物配制0.5倍浓度（半强度）的霍格兰溶液，或从头配制培养基，其成分为：0.5 mM NH₄H₂PO₄、3 mM KNO₃、2 mM Ca(NO₃)₂、1 mM MgSO₄、23 µM H₃BO₃、5 µM MnCl₂•4H₂O、400 nM ZnSO₄•7H₂O、200 nM CuSO₄•5H₂O、70 nM H₂MnO₄•1H₂O、45 µM FeSO₄•7H₂O。
2. 加入MES或其他合适的缓冲剂，使其终浓度为10 mM。
3. 将pH值调节至所需数值（本实验中pH为5.0）。

2. 放射性标记溶液的制备

1. 将所需体积的0.5倍浓度Hoagland溶液（每个重复50 mL）转移至洁净的烧瓶中。
2. 向Hoagland溶液中加入0.1–0.26 kBq/mL的放射性标记化合物。
   注意：本研究中使用溶于甲醇的¹⁴C标记AdCA（金刚烷-1-羧酸）。
3. 轻轻旋转烧瓶2–3分钟，充分混匀。
4. 将50 mL放射性标记溶液分装至每个125 mL锥形瓶中，用于各重复实验。

3. 拟南芥（ 拟南芥 (L.) Heynh. 植物制备

注意：拟南芥水培培养方案详见 Conn 等（2013）⁹。

1. 对于每株植物，使用剪刀从标准的1.7 mL微量离心管盖上取下帽盖，并使用皮革打孔器在盖子中心打一个直径为3 mm的孔。
2. 暂时用胶带密封盖子顶部，并将熔化的含0.8%琼脂的0.5x Hoagland培养基填充至盖中，然后放入经改造的枪头盒盖内（即萌发槽）（图1A）。
3. 将拟南芥种子依次用70%乙醇分别清洗10分钟和5分钟进行表面灭菌，随后在无菌滤纸上于超净工作台中干燥。
4. 通过微量离心管盖顶部所打的孔，将种子播种到琼脂培养基中。
5. 将种子在枪头架中于4 °C条件下进行2–4天的春化处理。
6. 将萌发槽转移至生长室中，在长日照条件下培养（16小时光照，8小时黑暗，光照强度约为150 µmol/m²s，温度为22 °C）。
7. 用0.5x Hoagland溶液填充枪头架。
   注意：确保溶液与琼脂接触，以防止干燥。
8. 继续培养植株2–3周，根据需要（每3–4天）补充溶液，以保持琼脂始终与水培溶液接触。
9. 将带有幼苗的管盖移植到一个直径为10 mm的开口中，该开口由电钻和钻锯钻头在50 mL Falcon管盖中心切割而成（图1B）。
10. 使用直径为30 mm的钻锯钻头在10 L塑料收纳箱盖上钻出12个孔（即成熟槽）。
11. 将Falcon管盖放置在收纳箱盖的开口上，使根系伸入下方的收纳箱中。
12. 将气石固定在成熟槽底部，并加入Hoagland溶液，直至根系大部分浸没于溶液中。
13. 将植株放回生长室，继续培养6–8周（16小时光照，8小时黑暗，光照强度约为150 µmol/m²s，温度为22 °C），直至莲座叶直径达到约10 cm。

图1：拟南芥发芽与成熟期水培装置及¹⁴C-AdCA处理容器。（A）用于拟南芥种子发芽以进行水培生长的发芽装置。（B）处于成熟装置中、准备用于实验的拟南芥植株。（C）实验过程中根部浸入¹⁴C-AdCA溶液中的拟南芥植株。50 mL烧瓶（即¹⁴C处理容器）在处理期间通常用铝箔覆盖（图中未显示），以防止藻类生长。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 波罗的海灯心草 (Juncus balticus Willd.) 植物制备

1. 将种子置于培养皿中两张湿润的滤纸之间，在 4 °C 下进行分层处理 1-2 周。
2. 移除上层滤纸，将培养皿放入生长室，在长日照条件下培养 1 周（16 小时光照，8 小时黑暗，光照强度约 150 µmol/m²s，温度 22 °C）。
3. 将幼苗移栽至经改造的移液器吸头架中，操作方法同拟南芥（步骤 3.1–3.4）。
4. 继续培养植株 2–3 周（16 小时光照，8 小时黑暗，光照强度约 150 µmol/m²s，温度 22 °C），或直至根长达到 3–4 cm。
5. 将植株移栽至装有气石的改造 10 L 储物箱中，加入霍格兰营养液至根部大部分浸没，再继续培养 6–8 周（16 小时光照，8 小时黑暗，光照强度约 150 µmol/m²s，温度 22 °C）。

5. 沙洲柳 ( Salix interior Rowlee) 植株准备

注意：沙洲柳幼苗的培养方案详见 Alberts 等（2021）¹⁰。

1. 剪取10 cm长的茎段插条（直径5 mm），在室温下用去离子水（diH₂O）浸泡过夜，以充分补水并促进生根。
2. 将已补水的插条转移至装有10 L 0.5×Hoagland营养液的通气水培槽中，在光照强度约150 µmol/m²s、温度22 °C、光照16小时/黑暗8小时的条件下培养1个月，以促进根系和地上部分的生长。
   注意：每2周更换一次Hoagland营养液，以防止幼苗发育期间出现营养缺乏。

6. 放射性同位素标记

1. 配制放射性标记溶液后，从中取出100 µL等分试样，用于液体闪烁计数，以确定初始同位素浓度。
2. 轻轻吸干植物根部，将Falcon管帽组件转移至含有0.5×Hoagland溶液和第2.4步中¹⁴C标记有机化合物的125 mL锥形瓶（¹⁴C处理容器）中。
3. 在瓶壁上标记溶液液面位置，以便在实验过程中根据蒸腾作用损失补充溶液至初始体积。
4. 用铝箔包裹锥形瓶，在培养光照条件下以40–60 rpm振荡，持续整个检测过程，或直至将标记植株转移至不含放射性标记的0.5×Hoagland溶液中进行追踪期处理。
5. 在收集100 µL等分试样前，每隔1–2小时用不含放射性标记的Hoagland溶液将瓶内液体补充至第6.3步标记的液面线。务必测量每次加入的Hoagland溶液体积，以便比较各处理组的蒸腾速率。在最初的6–8小时后，取样间隔可延长至每12–24小时一次。
   注意：此步骤可根据需要持续数天，但需每日监测等分试样中的放射性，以跟踪实验进展。
6. 可选步骤：若需在追踪期间监测根系分泌情况，可将植株及Falcon管帽组件转移至含50 mL新鲜Hoagland溶液（不含¹⁴C标记化合物）的锥形瓶中，并在实验开始后的前6–8小时内每2小时取100 µL等分试样，之后每24小时取样一次。
   注意：为区分化合物从植物根部释放是被动扩散还是主动分泌，可加入20 µM的主动运输抑制剂（如环孢菌素A）进行处理。
7. 使用液体闪烁计数器测定第6.1–6.6步所收集各等分试样的放射性计数。

7. 植物的磷屏成像

1. 用不含放射性标记的0.5倍霍格兰溶液冲洗根部15分钟，以去除松散结合的放射性同位素。
2. 收集 100 µL 冲洗液用于液体闪烁计数。
3. 称量植物或非木质植物材料以确定鲜重。
4. 在50 °C下真空条件下，使用凝胶干燥仪将植物材料干燥2小时，干燥时置于标有标签的滤纸上，随后在室温下过夜晾干。
   注意：干燥后，植物可长期保存（4-6个月），且可在后续时间进行成像，放射性信号几乎无明显下降。
5. 将磷屏置于磷屏消隐仪中强光照射15分钟以清除磷屏。
6. 将已知放射活性的2-10 µL放射性标记溶液滴加到滤纸上，室温下过夜晾干。
   注意：此处使用的标准放射性为 67、33、17、8、4 和 2 Bq，但可根据植物样品的信号强度进行调整。
7. 将磷屏置于干燥的植物样品和放射性标准品上方，于避光环境或密闭不透光容器中曝光至少24小时。
   注意：如果图像曝光不足或过度，请相应调整曝光时间。
8. 使用激光扫描磷光成像系统以 50 µm 分辨率对筛板进行成像。
9. 使用 ImageJ 软件分析磷屏图像的信号强度与分布¹¹.
   1. ImageJ 操作步骤：通过选择打开图像 文件 > 分析 > 设置测量参数... 选择 区域 和 平均灰度值 > 好的选择 形状选择工具 最适配该组织的 点击 和 拖拽 单击图像以突出显示感兴趣区域。按 Ctrl + M。将该区域及其平均灰度值复制到电子表格中。
10. 使用标准曲线中的放射性标准品将平均灰度值转换为Bq。
11. 使用以下公式计算植物组织中的总活性（积分密度）：
    ​积分密度（Bq）= 组织平均 Bq（Bq/cm²）× 组织面积（cm²）²) - 背景（Bq/cm²)) * 面积（cm²)
    1. 可选：使用 ImageJ 软件将灰度图像转换为彩色强度标尺¹¹.

结果

该¹⁴C标记物吸收方法适用于多种植物物种，不仅限于拟南芥，还包括内生柳（Salix interior）、粗壮偃麦草（Elymus trachycaulus Link Gould ex Shinners）以及湿地物种如波罗的海灯心草（Juncus balticus）^10,12。然而，为便于代表性说明，本文展示的是拟南芥生态型Columbia-7（Col-7）的实验结果。此前，我们已证明环境污染物（如环烷酸，NAs）可被在水培溶液中生长的多种植物吸收并代谢^10,12。已知环烷酸会影响模式植物拟南芥的生长、细胞器形态与动态变化以及基因表达^13,14

讨论

近年来，植物修复作为一种被动、经济且环境友好的工业废物和污染场地治理方法，受到广泛关注¹。筛选具有较强污染物吸收能力的植物种类，并阐明调控有机分子吸收的分子机制，有助于提升植物修复策略的效率。与其他间接方法不同，本文所述的放射性标记吸收结合磷屏成像技术可广泛用于追踪目标外源性物质及内源性有机化合物在植物体内的吸收与转运过程。

为了模拟根际环境，将放射性标记溶液的 pH 值调节至 5.0，以反映植物根部周围通常存在的微酸性环境。然而，这种在土壤中可能持续存在的自然酸性梯度在水培溶液中无法维持，因此需要添加缓冲剂^12,16。此外，出于安全性和获得最佳信噪比的考虑，建议将放射性同位素浓度控制在 0.1–0.26 kBq/mL 之间。在需要更高浓度以模拟环境条件或观察特定效应的情况下，可通过添加更高浓度的相应非放射性 ¹²C 同位素来提高浓度。本方案还可通过将 ¹⁴C 标记的模型化合...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
霍格兰改良基本盐混合物	Phyto Technology Laboratories	H353	含硫酸亚铁
琼脂	BioShop	AGR001
MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）	BioShop	MES555
pH计	Mettler Toledo	FiveEasy
甲醇	BioShop	MET302
12C-金刚烷甲酸	Sigma Aldrich	106399
14C-金刚烷甲酸	ViTrax		定制合成
125 mL 锥形瓶	VWR	30623-174
50 mL Falcon 管	VWR	CA21008-940
微量离心管	VWR	87003-294
植物生长箱	Conviron
移液器吸头盒	DiaMed	DIATEC530-8376
Rubbermaid Roughneck 3 加仑转运箱	Amazon	B0B3345MYH
滤纸	VWR	CA28320-020
培养皿	VWR	11019-566
带瓶夹的摇床	Forma Scientific	Model 4516
闪烁液	Research Products International	111195
闪烁瓶	VWR	10014-296
闪烁计数器	Beckman Coulter	LS 6000IC	所用瓶子取决于所使用的闪烁计数器
凝胶干燥仪	Bio-Rad	Model 583
激光扫描磷光成像仪	Bio-Rad	Molecular Imager FX