方法文章

从采样到数据非依赖型质谱的神经肽表征工作流程

DOI：

10.3791/68741

⸱

2025年8月8日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案概述了一种在大鼠脑组织中进行神经肽组学研究的综合工作流程，该流程结合了依赖数据采集-并行累积-串联碎裂（DDA-PASEF）与数据非依赖采集（DIA）质谱技术。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

内源性神经肽是脑功能的关键调节因子，在行为、应激、疼痛和稳态调节中发挥重要作用，但其分析仍然具有挑战性。从生物学角度看，神经肽丰度较低，易被快速降解，且由前体蛋白以多变的方式加工产生，仅在局部的小型细胞群体中表达。从技术角度看，其检测受到宽动态范围、多样的翻译后修饰以及质谱数据中信号稀疏的限制。本实验方案介绍了一种在timsTOF平台上，结合数据依赖采集（DDA）和数据非依赖采集（DIA）质谱（MS）技术，对大鼠（Rattus norvegicus）脑组织中神经肽进行分析的综合工作流程。在优化的脑组织样本制备（包括解剖、肽段提取和纯化）之后，进行纳米液相色谱（LC）-MS分析，并结合离子淌度气相分离，以提高检测灵敏度和准确性。由DDA生成的谱图库支持在Skyline中进行基于DIA的定量分析，从而实现高置信度的MS2水平测量。该整合工作流程可提高神经肽的覆盖度，并增强定量的重复性，为在复杂脑组织中研究神经肽提供了一个可靠的平台。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经肽是一类功能多样的内源性信号分子，作为神经元通讯和神经系统功能的关键调节因子 以及神经内分泌系统功能。作为神经调质、激素或共递质，它们影响多种生理过程，包括痛觉调节、应激反应、昼夜节律调控和食欲控制。与作为小分子合成的经典神经递质不同，神经肽由大型前体蛋白编码，这些前体蛋白通过mRNA翻译合成。前体蛋白（即前激素）随后经过蛋白水解加工，释放出具有活性的肽段，并被包装到致密核心囊泡（DCVs）中。在受到刺激时，神经肽被释放出来，通过与G蛋白偶联受体相互作用，发挥调节作用，通常表现为较慢且更持久的效应。由于神经肽在维持中枢和外周神经系统功能中的重要作用，已成为生物学和临床研究的热点领域。1,2,3,4,5.

尽管神经肽具有重要生物学意义，但其分析表征仍面临挑战。神经肽的结构高度异质，序列长度从短到长不等，且常带有多种翻译后修饰（PTMs），如酰胺化、乙酰化、磷酸化、氨基酸异构化或截短，这些修饰导致其在质谱（MS）中的电离和碎裂行为存在较大差异1,6,7,8。此外，神经肽在生物基质成分中的浓度通常较低，易被降解，并在神经系统复杂组织中呈空间局限性分布。这些特性使得神经肽的鉴定与定量均较为困难，尤其是在采用依赖于可预测的酶解过程和均一肽段性质的传统蛋白质组学方法时尤为如此9,10,11。

本文介绍了一种针对Rattus norvegicus（褐家鼠）脑组织中内源性肽段进行鉴定与定量的综合策略，重点聚焦于神经肽。该实验流程始于优化的脑组织取样方法，继而进行深入的液相色谱（LC）分离，最终在捕获离子淌度谱（TIMS）平台上采用平行累积-串联碎裂（PASEF）技术进行高分辨率质谱（MS）分析12,13,14,15,16。通过在前体离子选择前引入离子淌度气相分离（IM-GPF）步骤，数据依赖采集-PASEF（DDA-PASEF）方法实现了更优的前体离子分离效果，并显著增强了对低丰度神经肽的检测能力，许多在传统一维DDA工作流程中难以检出的神经肽因此得以被发现17。

尽管数据依赖性采集（DDA）因其高质量的二级质谱（MS/MS）谱图仍是肽段鉴定中最常用的方法，但其本质上受限于对前体离子强度的选择，导致低丰度物种易被忽略18,19,20此外，其半随机采样策略导致在不同重复间出现缺失值，阻碍了可重复的定量分析。为克服这些局限性，我们利用DDA-PASEF数据构建了一个稳健的谱图库，可用于后续的数据非依赖性采集（DIA）分析。与DDA相比，DIA可在定义的质量范围内对所有前体离子进行采样 m/z 窗口确保对丰度高和丰度低的肽段进行一致采样，结合光谱库及在 Skyline 中的靶向分析，可实现灵敏且可重复的 MS2 水平定量21,22,23,24.

这种整合性方法——涵盖脑肽提取、色谱分离、离子淌度增强型质谱采集以及基于混合DDA/DIA的定量分析——是针对神经肽的复杂性而设计的。该方法在最大限度提高肽段覆盖度的同时，尽量减少数据丢失，克服了传统依赖DDA的肽组学研究中的关键局限性。因此，我们提出了一种灵活且强大的平台，可用于探索哺乳动物大脑中的神经肽图谱，并可轻松适应多种实验问题和组织样本。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究中的所有动物实验均严格按照伊利诺伊州机构动物护理和使用委员会（23228）批准的动物使用方案进行，并严格遵守国家及ARRIVE关于动物伦理待遇与护理的标准。

1. 动物解剖与脑组织分离

  1. 立即进行冷盐水灌注，随后快速冷冻组织，以保持神经肽的完整性，减少降解产物的产生，并提高后续肽组学分析的数据质量。
  2. 根据机构动物护理指南，采用 CO2 法处死大鼠，并通过心跳消失和反射缺失确认死亡。
  3. 将大鼠仰卧放置，切开皮肤以暴露胸腔。
  4. 在心脏左心室做一小切口。
  5. 在右心房做一小切口，以允许血液和灌注液流出。
  6. 将连接有60 mL注射器（内含50 mL冰冻生理溶液，例如0.9%盐水或mGBSS）的剪裁合适长度的塑料移液枪头插入左心室。
  7. 用该溶液灌注动物全身，随后使用锋利剪刀或断头器将大鼠断头。
  8. 使用咬骨钳或精细剪刀去除覆盖在脑组织上的皮肤和颅骨。
  9. 小心地从颅腔中取出脑组织，必要时切断颅神经。
  10. 立即将脑组织置于干冰上冷冻，或在干冰预冷的异戊烷中进行速冻。
  11. 转移至标记好的冻存管或铝箔中，然后在 -80 °C 下保存。

2. 从大鼠脑组织中提取肽段

  1. 对于全脑样本，使用分析天平快速称量每份冷冻组织。使用含有10%冰醋酸和1%水的甲醇溶液（LC-MS级），按照10:1（v/w）的溶剂与组织比例进行组织匀浆。
  2. 将匀浆后的样本在冰上孵育20分钟。
  3. 在4 °C条件下，以16,000 × g离心20分钟。小心收集上清液，避免扰动沉淀。
  4. 用LC-MS级水重新悬浮沉淀，溶剂与组织比例为10:1（v/w），并在冰上再次孵育20分钟。
  5. 在相同条件下（16,000 × g，20分钟，4 °C）再次离心，收集第二次的上清液。
  6. 合并两次上清液，取总体积的1/10转移至新管中用于后续处理。使用真空浓缩仪将此等分试样完全干燥。将剩余提取物于-80 °C保存以备后续使用。

3. 使用 C18 离心柱进行固相萃取（SPE）

注意：所有溶剂均应为液相色谱-质谱联用级。除非另有说明，离心步骤均使用台式离心机在室温下以1,500 × g 进行。

  1. 试剂准备
    1. 配制活化溶液（A）：50% 乙腈/50% 含 0.1% 甲酸的水溶液。
    2. 配制平衡与洗涤溶液（B）：含 0.1% 甲酸的水溶液。
    3. 配制洗脱溶液（C）：50% 乙腈/50% 含 0.1% 甲酸的水溶液。
  2. 样品准备
    1. 将干燥的肽提取物用 200 µL 溶液（B）重新溶解。
    2. 在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 10 分钟。
    3. 小心收集上清液用于固相萃取（SPE）。
  3. 色谱柱活化与平衡
    1. 向 C18 离心柱中加入 150 µL 溶液（A）。
    2. 以 1,500 × g 离心 1 分钟。
    3. 重复步骤 3.3.1 和 3.3.2 两次，以确保完全活化。
    4. 加入 150 µL 溶液（B）。
    5. 离心 1 分钟。
    6. 重复步骤 3.3.4 和 3.3.5 两次。
  4. 样品上样与洗涤
    1. 将 200 µL 制备好的样品 溶液加载到柱上。
    2. 离心 1 分钟。
    3. 将穿流液重新上样至柱中三次，以最大化肽的保留。
    4. 加入 150 µL 溶液（B）。
    5. 离心 1 分钟。
    6. 重复步骤 3.4.4 和 3.4.5 三次，以去除未保留的杂质。
  5. 肽的洗脱
    1. 向柱中加入 150 µL 洗脱溶液（C）。
    2. 离心 1 分钟。
    3. 重复洗脱步骤 3.5.1–3.5.2 一次。
    4. 合并两次洗脱液，并置于冰上保存，或立即进行真空干燥。

4. 液相色谱-串联质谱分析

  1. 配制溶液（A）：水中含0.1%甲酸的溶液；溶液（B）：乙腈中含0.1%甲酸的溶液；溶液（C）：水中含0.1%甲酸的25 fmol/µL保留时间标准品（iRT）溶液。
  2. 在进行液相色谱-质谱（LC-MS）进样前，将样品重悬于20 µL溶液（C）中。
    注意：共分析两个生物学样品，每个样品分别进行五次DDA和DIA运行，每种方法每个样品获得五个技术重复。
  3. 使用高效液相色谱（HPLC）系统进行肽段分离，流动相A为溶液（A），流动相B为溶液（B）。
  4. 将1 µL样品载入二十五烷基C18分析柱（150 µm × 250 mm，1.9 µm粒径，120 Å孔径），并在整个运行过程中保持柱温为40 °C。
  5. 以600 nL/min的流速执行液相分离，采用以下梯度程序：0–5 min：2–10% B；5–85 min：10–45% B；85–87 min：45–50% B；随后进行高有机相冲洗及重新平衡。
    注意：液相系统通过离子源直接连接至timsTOF质谱仪。
  6. 对于DDA分析，在timsTOF质谱仪上使用默认应用方法 DDA PASEF-standard_1.1sec_cycletime。
    1. 简要而言，在PASEF模式下操作质谱仪，并启用动态排除功能。每个循环包含10次PASEF MS/MS扫描，循环周期为1.1秒。
    2. 设定质荷比（m/z）范围为100–1700，离子淌度范围为0.60–1.60 V·s/cm2，斜坡时间为100.0 ms。碰撞能量根据离子淌度从20.0 eV线性增加至59.0 eV。
  7. 离子淌度气相分馏（IM-GPF）
    1. 将离子淌度范围0.6–1.6 V·s/cm2划分为三个重叠窗口：0.6–1.0、0.9–1.3和1.2–1.6 V·s/cm2。
    2. 为此，需在timsControl或timsControl编辑器的TIMS设置选项卡中，将淌度起始值和终止值更改为对应窗口的数值。
    3. 对每个窗口分别采集数据。所有离子淌度采集窗口均使用恒定的累积时间和斜坡时间，均为100 ms。
    4. 采用与步骤4.6中详述相同的参数，在DDA-PASEF模式下采集数据。
  8. 对于DIA分析，在质荷比（m/z）400–1200范围内使用25 m/z的隔离窗口宽度。采用与DDA方法相同的离子淌度实验（IMEX）设置。
    1. 其他DIA设置包括每个循环包含一次MS1斜坡和16次MS/MS斜坡，总循环时间为1.8秒。
    2. 使用默认蛋白质组学DIA-PASEF方法作为DIA方法开发的模板。创建DIA方法后，将其加载至Hystar软件的方法选项卡中。无需激活DIA模式。
      注意：DIA方法成功加载后将自动注册。

5. 数据处理

注意：在完成数据采集后，应使用生物信息学工具（如 PEAKS Online、PEAKS Studio、MSFragger、Maxquant 或类似平台）进行肽段鉴定。本研究使用了能够处理 .d 格式原始数据的 Peaks Online。

  1. 数据库搜索
    1. 使用适合肽段搜索的参考数据库，例如经过整理的大鼠信号肽数据库、大鼠蛋白质组数据库或人类蛋白质组数据库，或根据样本来源构建的经过整理的信号肽数据库。
      注意： 数据库中仅包含的蛋白质或肽段才能被鉴定。大鼠信号肽数据是通过在UniProt中以“"Signal peptide"”注释筛选大鼠蛋白质组获得的。在UniProt术语中，按“"Signal peptide"”进行筛选意味着将蛋白质组缩小至参与分泌、膜定位或区室间转运的蛋白质。该自定义数据库包含5630个蛋白质。将蛋白质数据库的规模从50,000减少到5,000具有多个优势：首先，它通过降低随机肽段-谱图匹配的可能性，提高了鉴定置信度，从而增强了肽段指认的准确性；其次，较小的数据库提高了计算效率，加快了处理速度并减少了对计算资源的需求；第三，更简洁的数据库有助于更好地控制错误发现率（FDR），从而获得更可靠且统计学上更稳健的蛋白质鉴定结果。然而，数据库仍需保持相对较大的规模，以避免置信度评分的人为虚高和FDR估计的不准确。
    2. 在程序图形界面中配置数据库搜索，推荐参数如下：前体离子质量误差容限：10–25 ppm；碎片离子质量误差容限：0.01–0.05 Da；酶切特异性：无（非特异性消化）；肽段长度范围：4–45个氨基酸。
    3. 定义在搜索中需包含的翻译后修饰（PTMs） 集合。
    4. 完成数据库搜索后，导出对应于每个离子淌度窗口的pepxml和mzXML（或MGF）文件，包括标准的完整淌度范围（0.6–1.6 V·s/cm2）。
  2. Skyline谱库构建
    1. 打开Skyline，创建新文档，确保选择蛋白质组学界面，并使用默认设置，除非另有说明。
    2. 导航至文件 > 导入 > 肽段搜索。
    3. 在导入肽段搜索向导中，选择构建并添加相关的pepxml文件（确保对应的mzXML或MGF文件位于同一目录中）。
    4. 将iRT标准肽段设置为自动，选择DIA作为工作流程，然后点击下一步。
    5. 完成谱库构建后，选择约10–15个肽段作为iRT标准，用于在重复样本间进行对齐。如果系统提示重新校准iRT，请点击确定继续。
    6. 在提取色谱图页面，点击浏览以选择并导入所有DIA原始文件，然后点击继续。
    7. 在过渡离子设置窗口中，将前体离子电荷范围设为1–5，产物离子电荷范围设为1–3，离子类型设为b、y、p，并定义产物离子选择从第2个离子到最后一个离子。其他推荐设置：离子匹配容差：0.05 Da，峰提取数量：5。
    8. 在肽段设置窗口中，设置与第4.1.3节所述Peaks搜索设置相匹配的修饰项。
    9. 在隔离方案页面，输入隔离方案名称并选择预设隔离窗口。点击导入并加载一个DIA文件，以自动导入实验的隔离窗口配置。
    10. 设置全扫描采集参数如下：采集方法：DIA；产物离子质量分析器：Centroided；隔离方案：使用上述定义的方案；质量精度：10–20 ppm；淌度分辨能力：30–50；启用仅使用预测保留时间前后5分钟内的扫描；如需导入MS1色谱图，可选择性修改MS1过滤。选择合适质量分析器和分辨率以优化MS1色谱图提取。
    11. 导入FASTA文件并生成诱饵库。设置诱饵库生成方法：随机打乱序列（Shuffle Sequence）。
    12. 选择酶：内源性肽段分析中为非特异性消化。通过从下拉酶菜单中选择添加来编辑酶。设置酶名称，类型为both，在C端切割KR，在N端切割KR，允许半切割，然后点击确定。将漏切位点数设为3。
    13. 导入目标FASTA文件，然后点击完成。如提示，请确认关联蛋白质页面。
    14. 确保谱库已成功创建且DIA数据已导入。手动检查已鉴定肽段列表，并继续进行下游的定性和定量分析。
  3. 定性与定量测量
    注意：定性与定量分析均在Skyline中完成。有关在Skyline中分析DIA数据的详细信息，请访问 https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorial_dia_swath。
    1. 若已加载DDA数据，从菜单中选择设置 > 过渡离子设置，在采集方法中选择DDA；在设置 > 肽段设置中，选择MS1水平用于定量。
    2. 若已加载DIA数据，在设置 > 过渡离子设置中选择DIA作为采集方法；在设置 > 肽段设置中，选择MS2水平用于定量。
    3. 在视图 > 文档表格中，选择肽段定量，然后导出电子表格。合并DDA结果和DIA结果的电子表格。
      注意：该电子表格汇总了所有样本中谱库内各肽段的峰面积。在本实验中，肽段峰面积被归一化至保留时间标准肽段GISNEGQNASIK（属于Pierce保留时间混合物）。归一化通过计算每个肽段峰面积与标准肽段峰面积的比值实现。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

图 1 展示了一个代表性的实验方案。对使用标准离子淌度范围和 IM-GPF 方法获得的 DDA-PASEF 数据进行分析（图 2），结果显示 IM-GPF 方法的肽段覆盖度显著更高（图 2B）。值得注意的是，使用标准 DDA-PASEF 方法鉴定出的大多数肽段与 IM-GPF 数据集中的肽段高度重叠。为了最大化肽段鉴定的覆盖度，通过整合两种方法鉴定出的结果构建了一个全面的谱图数据库。

使用经过筛选的大鼠信号肽数据库，对通过 DDA-PASEF 和 DIA-PASEF 获得的重复数据集进行进一步的数据库分析（图 3），结果显示两种方法共同鉴定出 217 种蛋白质。此外，DIA-PASEF 独特鉴定了 115 种蛋白质，而 DDA-PASEF 独有 69 种蛋白质。利用从 DDA 和 IM-GPF 数据衍生的谱图库进行的探索性分析表明，DIA-PASEF 能够可靠地检测到神经肽，例如 NPAFLFQPQRF（神经肽 SF）和 YGGFMRRVGRPEWWMDYQ（源自前脑啡肽原）。由于峰归属不佳，这些神经肽在相应的 DDA-PASEF 数据集中未能被可靠检测到（图 3B、C）。

从定量角度来看，图4A中的散点图显示了DDA前体离子强度与DIA碎片离子强度之间存在中等程度的正相关关系，这符合预期，因为这两种方法均用于定量相同的肽段，但捕获的是不同类型的离子。如图4B所示部分肽段的箱线图进一步说明了两种方法所获得定量测量结果的可重复性。箱线图展示了通过DIA和DDA测得的每种肽段的相对峰面积，误差条表示技术重复之间的测量变异性。所选肽段来源于阿片类前体激素，包括前脑啡肽原（PENK）和前强啡肽原（PDYN），二者在疼痛调节和镇痛过程中均发挥核心作用。

肽提取和纯化流程图；LC-IM-MS 分析及数据处理步骤。
图 1：从大鼠脑组织中鉴定和定量内源性肽的肽组学工作流程概览。 该工作流程包括组织解剖、肽的提取与纯化、采用气相分离（IM-GPF）技术进行液相色谱-离子淌度-质谱（LC-IM-MS）数据采集，以及数据处理以生成谱图库并进行定量分析。图中部分内容使用 BioRender 绘制。Tan, Y. (2025)  https://BioRender.com/vrejrsk. 请点击此处查看该图的高清版本。

蛋白质组学数据分析：柱状图、维恩图、离子淌度图、交集大小图、肽段热图。
图 2：数据库肽段与蛋白质鉴定。（A）柱状图比较在不同离子淌度窗口中鉴定到的前体离子总数、肽谱匹配数（PSMs）以及唯一肽段的数量。（B）饼图展示在所有淌度窗口中共同鉴定到的肽段比例，以及仅在单个窗口中特异性检测到的肽段比例。（C、D）热图显示在整个淌度范围（0.6–1.6 V·s/cm2）（C）和受限淌度窗口（0.6–1.0 V·s/cm2）（D）内，离子信号在 m/z 和离子淌度维度上的分布情况。（E）Upset 图展示使用 DDA 和 DIA 方法获取的数据集中鉴定到的蛋白质数量，突出显示共有的和特有的蛋白质鉴定结果。（F）热图表示在 DIA 采集的重复样本（上图）和 DDA 采集的重复样本（下图）中鉴定到的源自前脑啡肽原（proenkephalin）前体的肽段。Leu-脑啡肽在四次 DDA 重复中的两次未被检测到，表明基于 DDA 的采集可能存在缺失值。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质组学数据分析；色谱保留时间，DIA与DDA强度图，质谱峰。
图3：使用谱图库对DDA-PASEF和DIA-PASEF数据进行比较与探索性分析。 （A）神经肽SF在DIA与DDA-PASEF重复实验中的保留时间对齐情况。（B）来自DIA（上图）和DDA（下图）数据集的PENK（212-229）片段离子的提取离子色谱图（EIC）。（C）来自DIA重复实验的神经肽SF片段离子色谱图，显示高度共洗脱和高质量谱图特征。 请点击此处查看该图的放大版本。

分析蛋白质表达的散点图和箱形图；DIA 与 DDA 方法的数据比较。
图 4：DIA-PASEF（MS2 水平）与 DDA-PASEF（MS1 水平）定量测量结果的比较。（A）该散点图比较了使用 DIA 和 DDA 模式获得的肽段信号强度。具体而言，x 轴表示来自 DDA 的前体离子峰面积的 log10 转换值，y 轴表示来自 DIA 的每个肽段碎片离子峰面积的 log10 转换值。（B）箱形图显示了四个代表性肽段 PENK 107-133、PENK 188-195、PDYN 221-233 和 PDYN 235-248 的相对峰面积。误差条表示技术重复之间的变异性。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在肽组学研究中，尤其是在分析内源性肽时，保持肽的天然谱型对于数据完整性和生物学解释至关重要。冰冷生理盐水灌注不仅能清除血液，还可降低脑组织温度，从而显著减缓因内源性蛋白酶活性导致的死后蛋白质快速降解。通过降低脑温，可减缓酶活性，并将循环中的蛋白酶从血管系统中冲洗出去，同时减少死后代谢变化25,26。使用冰冻生理盐水灌注还可清除脑血管系统中的血液。此步骤尤为重要，因为血液中含有高丰度蛋白（如白蛋白和球蛋白）以及循环蛋白酶，这些成分可能干扰神经肽的检测。死后高丰度血浆蛋白的降解会增加神经肽提取物的复杂性，并掩盖低丰度信号，最终影响鉴定与定量的准确性25,26,27。脑组织在干冰上或通过冷异戊烷快速冷冻，几乎可立即终止酶促反应。这种保存方式对于检测低丰度且完整的成熟神经肽、确保可靠的定量结果尤为重要。若不采取这些步骤，肽的降解可能导致变异性增加和产生假象，从而影响鉴定与定量的可靠性。因此，在进行检测之前，清除血液、低温灌注和快速冷却脑组织是直接影响肽组学数据质量、灵敏度和可重复性的基础技术。

对从大鼠脑组织中提取的肽段进行分析，结果显示存在两个不同的离子迁移率峰群（图2C、D）。该现象可能归因于不同分子类别，或肽段具有不同的电荷态。如果这些峰群对应于不同的分子类别，则共洗脱的非肽类物质可能会与肽段竞争选择和碎裂。此外，如果分离源于电荷态的差异，则含有高电荷肽段的峰群预期会产生更高质量的MS/MS谱图，从而有助于更可靠地鉴定肽段。

为研究这一现象，我们采用了一种离子淌度分级策略，跨三个离散的淌度窗口采集数据：0.6-1.0、0.9-1.3 和 1.2-1.6 V·s/cm²。这些窗口共同覆盖了在标准 DDA-PASEF 实验中通常用于分析肽段的完整离子淌度范围。如图2所示，尽管在全扫描范围（0.6-1.6 V·s/cm2）内检测到的前体离子总数最多，但在 0.6-1.0 V·s/cm2 窗口内观察到的肽谱匹配数（PSMs）显著更高。该结果表明，两个羽流的存在可能确实是由于其他分子的干扰所致。

基于离子淌度的前体分离方法相较于传统的全扫描方法，使肽段覆盖度提高了30%。在全扫描数据集中鉴定出的肽段中，约有82%与分离方法鉴定出的肽段重叠（图2B），表明该分离策略具有良好的一致性和稳健性。基于上述结果，我们结合离子淌度分离和全扫描数据，构建了用于DIA-PASEF定量分析神经内分泌肽的谱图库。

对通过 DDA 和 DIA 获得的重复数据集进行数据库分析表明，DIA 数据中鉴定出的肽段和蛋白质数量更多，其中包括 115 种仅由 DIA 鉴定出的蛋白质（图 2E）。这些蛋白质包括神经肽，如 Pro-FMRF酰胺相关肽 FF 和 VF。相比之下，有 69 种蛋白质仅通过 DDA 鉴定出，其中许多与细胞黏附和神经元发育相关。这些结果表明，DDA 和 DIA 方法可互补使用，以实现更广泛的肽段覆盖。

进一步分析表明，DIA 采集模式能有效解决在使用 DDA 进行内源性肽段分析时经常遇到的部分缺失值问题。例如，脑啡肽-Leu 在四次 DDA 重复实验中仅在两次中被检测到（图 2F，底图），而在四次 DIA 重复实验中则均被稳定检出（图 3F，顶图）。

Skyline 是一种广泛用于定量蛋白质组学的平台，被用于分析 DDA 和 DIA-PASEF 数据集28。该软件通过谱图库匹配、碎片离子共洗脱以及保留时间对齐来辅助肽段鉴定。为了评估 DIA-PASEF 在减少缺失鉴定方面的性能，我们对仅在 DIA 数据集中检测到的肽段进行了定性评估。

如图所示 图3D，神经肽SF在所有DIA重复中均在同一保留时间窗口内被稳定检出。而在DDA重复中的检测则表现出较大变异性，保留时间范围从25分钟至45分钟（图3A）。观察到的不一致现象，包括置信度较低的峰归属错误，可能是由于片段离子覆盖范围有限或质量较差所致，如图所示 图3B相比之下， 图3C 显示与神经肽SF相对应的碎片离子在所有DIA重复实验中高度一致，支持自动鉴定的可靠性。

对源自前脑啡肽原的 PENK（212-229）肽的 MS/MS 谱图质量进行比较，进一步证明了 DIA-PASEF 的优势。DIA 获得的谱图相较于 DDA 具有更高的强度和更优的碎片离子质量（图 3），这对于检测低丰度的内源性肽段尤为有利。

定量分析证实，DIA-PASEF 在生物学重复样本中产生了稳定且可重复的测量结果，其性能与 DDA 相当（图 4）。此外，DIA 能够在 MS2 水平实现定量，提供片段离子水平的特异性，相较于基于 MS1 的 DDA，可显著提高肽段鉴定的置信度。这些结果表明，DIA-PASEF 是一种可靠且高效的靶向神经肽定量方法，特别适用于对数据完整性与可重复性要求较高的复杂生物基质研究。

本方案概述了一种神经肽分析与定量的综合策略。IM-GPF 方法有助于构建高质量的谱图库。与 DDA-PASEF 相比，DIA-PASEF 提高了重复性并增加了肽段覆盖度，同时增强了基于 MS2 的定量能力。结合这两种采集策略可提高整体肽段覆盖度，因为每种方法在鉴定不同肽段方面均具有独特贡献（图 2E）。本方案的局限性在于需要充足的样品量，以支持通过 DDA-PASEF 和 DIA-PASEF 方法进行谱图库构建和数据采集。

披露

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作者无任何竞争利益需要披露。

致谢

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本工作获得了美国国立卫生研究院国家药物滥用研究所资助，资助编号为 P30DA018310（J.V.S.）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1% 甲酸水溶液Fisher Scientific LS118-500LC/MS级
乙酸 Fisher Scientific A11350LC/MS级
乙腈Fisher Scientific AA47138K7LC/MS级
甲酸Fisher Scientific PI28905LC/MS级
甲醇Fisher Scientific AA47192K7LC/MS级
nanoELute2BrukerN/A
Pierce C18 离心柱Fisher Scientific AA47192K8
Pierce 肽段保留时间校准混合物赛默飞世尔科技A11351LC/MS级
SpeedVac 真空浓缩仪Genevachttps://scientificproducts.com/product_cat/benchtop-solvent-evaporators/本研究中使用的特定型号已不再由制造商提供。为便于参考，此处提供了当前等效型号的链接
timsTOF Pro2布鲁克https://www.bruker.com/zh/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-pro-2.html
水Fisher Scientific AA47146M6LC/MS级

参考文献

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