方法文章

基于荧光探针的PCR检测Aspergillus spp.、Cryptococcus neoformans和Pneumocystis jirovecii

DOI：

10.3791/68819

⸱

2026年5月8日

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1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

本文内容

摘要

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本文介绍了一种基于PCR荧光探针法的临床检测方案，用于同时检测Aspergillus spp、Cryptococcus neoformans和Pneumocystis jirovecii。

摘要

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本方案描述了一种使用基于PCR荧光探针的核酸检测试剂盒，在临床痰液样本中定性检测Aspergillus spp.、Cryptococcus neoformans和Pneumocystis jirovecii的标准化操作流程。该流程包括临床样本采集、碱性液化预处理、自动化核酸提取以及多重实时PCR检测。Aspergillus spp.、C. neoformans和P. jirovecii分别通过靶标特异性的荧光探针（FAM、VIC和CY5通道）进行检测，并整合内标对照（ROX通道）以确保检测质量。检测的有效性及样本结果判读依据预设的循环阈值（Ct）截断值进行判定。阳性对照在所有通道中必须呈现S型扩增曲线，且Ct值≤33.7；阴性对照则不得出现任何扩增信号。对于临床样本，FAM通道Ct值≤33.7判为Aspergillus spp.阳性，VIC或CY5通道Ct值≤36分别判为C. neoformans或P. jirovecii阳性。

引言

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由Aspergillus spp.、Cryptococcus neoformans和Pneumocystis jirovecii等引起的侵袭性真菌感染对免疫功能低下患者构成严重威胁，导致高发病率和死亡率。及时且准确的诊断对于启动适当的抗真菌治疗并改善临床结局至关重要1。传统的诊断方法，包括培养、显微镜检查和抗原检测，存在明显局限性：培养耗时且敏感性低，显微镜检查缺乏种属水平的鉴定能力且依赖操作者经验，而抗原检测（如半乳甘露聚糖、β-D-葡聚糖）可能出现交叉反应且性能不稳定。分子诊断技术，特别是实时PCR，可通过更短的检测周期以及更高的敏感性和特异性，部分弥补上述不足。多重PCR技术的进步更可实现对单个样本中多种病原体的同时检测，从而提高诊断效率。

本方案描述了一种多重荧光探针PCR检测方法，用于定性检测人类痰液样本中Aspergillus spp.、C. neoformans和P. jirovecii的DNA，其靶标分别为18S rRNA基因的保守区（Aspergillus spp.）、ITS基因（C. neoformans）以及mtLSU rRNA基因（P. jirovecii）。该方法的关键特性包括：明确的分析灵敏度：Aspergillus spp.、C. neoformans和P. jirovecii的检测下限均为1,500拷贝/mL；引物/探针特异性：靶标特异性引物和探针可最大程度减少与人源DNA或其他常见菌群之间的交叉反应；有效的污染控制：采用dUTP-UDG（尿嘧啶-DNA糖基化酶）系统，可有效防止先前PCR扩增产物的残留污染，这对于在临床实验室环境中维持检测的可靠性至关重要2；整合式流程对照：共扩增一个以内源性人源RP（核糖体蛋白）基因为靶标的内标，该内标标记有ROX荧光染料，用于监控核酸提取的完整性并识别潜在的PCR抑制，从而降低假阴性结果的发生率3。该方法符合分子诊断领域已建立的质量保证指南4,5。本方案主要适用于血液肿瘤科患者或移植受者等高危人群的呼吸道标本（痰液/BALF）。文中还讨论了可能存在的局限性，例如环境污染物导致的假阳性结果，或因样本过度稀释引起的灵敏度下降，并提出了相应的应对策略。

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方案

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临床样本的使用已获得相应伦理委员会的批准（批准号：ZYS-GCP-2025006）。所有参与者均已签署广泛的知情同意书，同意将其数据和样本用于科研。本方案中使用的所有试剂和耗材均列于材料表中。

1. 样品采集

  1. 在无菌容器中收集 3–5 mL 痰液或支气管肺泡灌洗液，并立即送检。

2. 试剂准备

注意：这些步骤在试剂准备室中进行。

  1. 从 -28 °C 冰箱中取出检测试剂盒，在室温（25–30 °C）下完全解冻 30 分钟。
  2. 计算反应总数（N）：N = 检测样本数（n）+ 阳性/阴性对照（2）+ 1。
  3. 在无菌微量离心管中配制反应体系。单个反应体系包含：35 μL 核酸扩增混合液 + 5 μL 引物-探针混合液，充分涡旋混匀后短暂离心。
  4. 按照试剂盒生产商的说明书，将 40 μL 反应体系分装至各 PCR 管中，并转移至样本处理室的传递窗。

3. 样品处理

注意：这些步骤在样品处理室中进行。废物处理：将步骤 3.2.2 中的上清液及其他含 NaOH 的液体废物丢弃至指定的化学废液容器中。

  1. 液化
    1. 将痰液/支气管肺泡灌洗液（BALF）加入一个50 mL螺口管中。
    2. 加入1–2倍体积的4% NaOH消化液（根据痰液黏稠度调整）。
      注意：NaOH具有腐蚀性，避免接触皮肤和眼睛。
    3. 拧紧管盖，涡旋振荡1分钟，并在生物安全柜中室温孵育15–20分钟。
  2. 富集
    1. 将液化后的样品在3,000 rpm下离心5分钟。
    2. 用移液器弃去上清液，保留1,000 μL沉淀。
    3. 充分涡旋振荡沉淀。
  3. 裂解
    1. 将500 μL沉淀转移至裂解管中，涡旋振荡10分钟，然后短暂离心。
  4. 提取
    注意：废弃物处理：使用过的提取板、枪头和接触过生物样本的试管必须丢弃至经批准的生物危害废物容器中。
    1. 将全部裂解液上清及100 μL阴性/阳性对照转移至提取板的第2列孔中。
    2. 使用指定程序的自动化核酸提取系统进行核酸提取6。
  5. 加样
    1. 将10 μL提取的核酸（第6列）及对照加入PCR管中。短暂离心后，转移至扩增室的传递窗。

4. 核酸扩增

注意：这些步骤在扩增室中进行。

  1. 将PCR管放入自动核酸扩增仪中，并选择合适的扩增程序。
  2. 设定检测通道：Aspergillus spp.：FAM通道；C. neoformans：VIC通道；P. jirovecii：CY5通道；内参：ROX通道7,8,9。
  3. 设置样本名称并运行程序。

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结果

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使用该多重荧光探针PCR检测方法获得的代表性扩增曲线如图1和图2所示。检测的有效性依据预设的对照标准进行判断。在有效的运行中，阳性对照在FAM、VIC、CY5和ROX通道中均产生典型的S形扩增曲线，且所有检测通道的循环阈值（Ct）均≤33.7（图1A）。阴性对照在任何通道中均未出现S形扩增曲线，Ct值报告为“未确定”（图1B）。只有同时满足上述两项对照条件，实验运行才被视为有效。

在临床样本判读中，需评估病原体特异性荧光信号（图2）。若样本在FAM通道中呈现S型扩增曲线且Ct值 ≤ 33.7，则判读为曲霉菌属（Aspergillus spp.）阳性；若在FAM通道中无扩增曲线或Ct值 > 33.7，则判读为阴性。同理，若样本在VIC通道中呈现S型扩增曲线且Ct值 ≤ 36，则判读为...

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讨论

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本研究建立的多重实时PCR方案为临床痰液样本中三种主要侵袭性真菌病原体（Aspergillus spp.、Cryptococcus neoformans和Pneumocystis jirovecii）的同步快速检测提供了标准化操作流程。该方法可直接从临床标本中检测病原体DNA。与传统的诊断方法（如培养、显微镜检查或血清学抗原检测）相比，这种分子检测方法不受上述技术固有局限性的影响，包括培养所需的较长处理时间、显微镜检查的敏感性差异及操作者依赖性，以及抗原检测中可能出现的交叉反应。

本方案的成功实施依赖于多个关键步骤的严格质量控制。充分的样本预处理，包括碱性液化及用于富集的离心，对于获得高质量的真菌DNA至关重要。液化不完全可能影响细胞壁的破碎，降低核酸释放效率。使用自动化提取系统进行核酸纯化同样重要，该步骤可去除痰液样本中存在的PCR抑制物（如黏蛋白和血液成分），从而确保扩增反应的稳定性和可重复性。此外，分区实验室操作流程结合dUTP-UDG防污染系统，是防止假阳性结果、维持检测特异性的基本要求。这一点在高灵敏度检测环境中尤为重要，特别是当样本中含有高拷贝数的人类内源性对照基因时。...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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我们感谢佛山市山水分区人民医院临床检验科提供设备和技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 μL型滤芯无菌加长移液器吸头（盒装）肖瑞生物技术S20221126
1000 μL 无菌移液器吸头江苏新康医疗仪器有限公司241101
200 μL 延长滤芯无菌吸头肖瑞生物技术241001
裂解管北京泽辰生物科技 &安普科技有限公司F1040
核酸检测试剂盒 曲霉属 种（spp.） 新型隐球菌，以及 耶氏肺孢子菌北京泽诚生物科学 & 技术有限公司CT8143-48T
核酸提取试剂北京泽诚生物科技 & 技术有限公司CN8053-B40T
样品稀释缓冲液北京泽诚生物科学 &安普科技有限公司SP7065

参考文献

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  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 11 (9), 1026-1030 (1993).
  3. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in PCR. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  4. Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), research0034.1-research0034.12 (2002).
  5. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  6. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
  7. Loeffler, J., et al. Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the LightCycler system. J Clin Microbiol. 38 (10), 3463-3466 (2000).
  8. Bovers, M., et al. Six monophyletic lineages identified within Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii by multi-locus sequence typing. Fungal Genet Biol. 43 (5), 353-359 (2008).
  9. Wakefield, A. E., et al. Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification. Lancet. 336 (8726), 751-753 (1990).
  10. Schrader, C., et al. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  11. White, T. J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, J. J. , Academic Press. 315-322 (1990).

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