基于MTT法的甘油释放归一化用于精确量化原代大鼠附睾脂肪细胞中的脂解作用

摘要

实验过程中存在的干扰因素，包括细胞活力的波动以及检测方法的干扰，会阻碍对富含脂质的原代脂肪细胞中甘油释放量的准确测定。为减轻这些挑战，采用基于MTT的归一化策略，根据细胞代谢活性对甘油测定结果进行校正，从而提高脂肪分解定量分析的可靠性。

摘要

脂解作用是一种关键的代谢途径，涉及将储存的甘油三酯水解为游离脂肪酸和甘油。然而，在富含脂质的原代脂肪细胞中，甘油释放量的准确量化常受到实验干扰因素的影响，例如细胞活力的差异以及检测过程中的干扰。为克服这些局限性，已建立一种简便的方法，利用基于3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）的细胞活力检测对甘油释放量进行归一化处理。该实验方案利用脂肪细胞与水溶液之间比重的差异，实现对脂解产物和细胞活力的同时定量。在药物筛选实验中，普伐他汀和辛伐他汀显著增强了腹部脂肪细胞的甘油释放，而阿托伐他汀和洛伐他汀则未显著改变甘油产量。这些结果表明，基于MTT的归一化方法为准确量化脂解作用提供了一种可靠且便捷的策略，在针对肥胖症和代谢综合征的药物研发中具有潜在应用价值。本研究强调有必要重新评估传统的脂解作用检测方法，以区分真实的代谢反应与非特异性的膜通透性增加所导致的假象。

引言

脂肪组织可分为白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）¹。WAT 的功能是将多余的能量以甘油三酯的形式储存，而 BAT 则具有产热功能，可在寒冷刺激下将化学能转化为热能，以维持体温¹。脂肪组织还具有内分泌功能²。它能够分泌多种激素、细胞因子和代谢产物（统称为脂肪因子），并通过调节中枢神经系统对摄食行为的控制以及周围组织的代谢活性，来调控机体的能量平衡²。

脂解作用是在一系列脂解酶的作用下，细胞内脂质逐步水解的过程^3,4。在脂肪细胞中，脂质主要以甘油三酯的形式储存在脂滴中⁵。脂滴表面覆盖有脂滴相关蛋白——perilipin家族，该蛋白可阻止脂解酶对甘油三酯的水解^6,7。然而，当脂解信号增强时，脂肪细胞中perilipin家族蛋白的表达水平下降，脂解酶进入脂滴内部^3,4。结果，甘油三酯被分解为甘油和游离脂肪酸^3,4,5。

脂解作用，即储存的甘油三酯分解为甘油和游离脂肪酸的过程，是脂肪细胞代谢中的一个基本过程⁸。尽管直接测定脂解产物（如甘油）可提供有价值的见解，但准确定量一直具有挑战性，尤其是在悬浮的原代脂肪细胞中，由于实验组之间细胞数量的差异可能导致操作误差。本研究旨在通过采用细胞活力检测来标准化原代大鼠腹部脂肪细胞甘油释放量的定量，从而应对这一挑战。通过标准化测量方法，归一化的甘油释放检测被应用于作为靶向肥胖症和代谢综合征药物发现的潜在工具。

方案

本方案利用脂肪细胞与水溶液之间比重的差异，可在同一块96孔板的各个孔中同时测定甘油释放量（作为脂解作用的指标）和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）细胞活力，从而简化实验流程并提高效率。

所有动物实验均遵循ARRIVE指南，并按照《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第8023号，1978年修订版）进行。本研究方案经机构动物护理和使用委员会批准（批准号：202112，批准日期：2021年5月5日）。本研究所用的雄性Wistar大鼠在标准饲养条件下至少8周大，体重≥200 g。每只大鼠可获得典型的附睾白色脂肪组织产量为0.6–0.8 g。值得注意的是，年龄较大的大鼠或饲喂高脂饮食的大鼠，其白色脂肪组织质量显著增加（通常为1.5–3 g），需按比例调整消化酶（如胶原酶）的浓度，以维持一致的组织解离效率。仅使用雄性大鼠可避免雌性动情周期激素波动可能带来的混杂效应。实验中大鼠品系的选择（如Sprague-Dawley、Wistar或Long-Evans）保持一致，以确保脂肪组织反应的遗传一致性。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 大鼠腹部原代脂肪细胞的分离

1. 按照机构批准的实验方案，通过腹腔注射7%水合氯醛（溶于蒸馏H₂O中）对一只成年雄性Wistar大鼠进行麻醉。
2. 通过检测反射反应是否消失确认麻醉完全，然后使用无菌手术剪在腹部正中做切口。
3. 小心地从附睾脂肪垫左右两侧去除内脏脂肪组织。
   注意：附睾脂肪细胞相对较大且具有浮力，有利于分离和分析。
4. 将收集的组织转移至磷酸盐缓冲液（PBS；图1A）中。
5. 用PBS清洗组织两次，以去除杂质，包括附着的血管和血凝块。
6. 将清洗后的组织切成小块。

2. 大鼠腹部原代脂肪细胞的纯化

1. 将分离的脂肪组织与胰蛋白酶和II型胶原酶（10 mg溶于10 mL胰蛋白酶溶液中）在37 °C下振荡孵育2小时。
2. 通过细胞筛过滤消化后的脂肪组织（图1A）。
3. 在室温下以120 × g离心滤液3分钟，以去除残留的酶活性。
4. 将悬浮的脂肪细胞（上层白色层）转移至洁净离心管中，并用PBS洗涤。
5. 在室温下以120 × g离心滤液3分钟，以去除PBS。
6. 将过滤后的脂肪细胞（上层白色层）在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素溶液的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中孵育，时间不超过30分钟。

3. 甘油释放的分析

1. 将过滤后的脂肪细胞（每孔 10⁴-10⁵ 个细胞；200 µL）接种至 96 孔细胞培养板中。
   注意：使用标准血细胞计数板对脂肪细胞进行计数。由于脂肪细胞大小差异较大，部分较大的细胞无法准确计数，因此细胞计数可能不能精确反映脂肪细胞的实际数量。主要目标是实现细胞在各孔中的均匀分布，而非精确量化。
2. 在 37 °C 条件下，以 0.05% 二甲基亚砜（DMSO；作为对照组）以及 50 µM 阿托伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀和辛伐他汀处理脂肪细胞，轻柔振荡孵育 4 小时。
   注意：上述处理条件仅供参考，可根据实验的具体目标和设计需要进行调整。
3. 收集细胞培养基（下层红色部分），用于分析甘油释放量，以指示脂解作用的启动（图 1B）。
4. 使用商用甘油释放检测试剂盒评估不同处理条件下脂肪细胞的脂解反应。
5. 使用酶标仪在 570 nm 波长下测定吸光度。

4. 细胞活力分析

1. 将 MTT 粉末以 5 mg/mL 的浓度溶于蒸馏水 H₂O 中，并在使用前通过 0.22 µm 滤膜灭菌。
2. 在完成甘油释放分析后，向细胞中加入 MTT 溶液（终浓度为 0.5 mg/mL），于 37 °C 孵育 2 小时。
3. 将悬浮的脂肪细胞（上层紫色层）转移至含有 DMSO 的洁净离心管中，用于细胞活力分析（图 1B）。
4. 短暂涡旋震荡，以溶解形成的紫色甲臜结晶。
5. 使用酶标仪在 570 nm 处测定吸光度。

5. 标准化计算

1. 所有实验均设三个重复，并重复四次（n = 4）。
   注意：每次独立实验（n = 4）均从三只大鼠中分离脂肪细胞，每种处理条件均设三个重复。
2. 对于每个处理组，将甘油释放吸光度值除以相应的细胞活力吸光度值。
3. 数据以均值 ± 标准差（SD）表示。
   注意：使用 Microsoft Excel 中的 =AVERAGE(range) 和 =STDEV.S(range) 函数计算均值和标准差。组间比较采用 GraphPad Prism 6 中的“比较均值”功能进行非配对双尾 t-tests 分析。
4. 采用 Student's t-test 确定组间差异的统计学显著性，以 P 值小于 0.05 为具有统计学显著性。

结果

经过初步药物筛选后，采用标准化的甘油释放法研究降脂药物他汀类药物对脂肪细胞的促脂解作用⁹。

他汀类药物对原代大鼠腹部脂肪细胞甘油释放的影响
通过用50 µM普伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀以及0.5% DMSO处理细胞4小时，评估他汀类药物对原代大鼠腹部脂肪细胞脂解作用的影响。甘油释放分析表明，与对照组相比，普伐他汀和辛伐他汀处理均诱导了脂解效应（图2）。然而，仅普伐他汀处理显著诱导了脂解作用（P < 0.05），而辛伐他汀处理未见显著诱导作用（图2）。

他汀类药物对原代大鼠腹部脂肪细胞甘油释放的归一化影响
为提高精确性并减少操作误差，在定量原代大鼠腹部脂肪细胞甘油释放时采用MTT细胞活力检测法进行归一化处理。MTT检测结果显示，与对照组相比，普伐...

讨论

本研究提供了一种更准确的方法来测量富含脂质的原代脂肪细胞中的脂解作用。研究发现，普伐他汀和辛伐他汀可诱导甘油释放并降低大鼠附睾脂肪细胞的活力，而阿托伐他汀和洛伐他汀则未表现出显著影响。辛伐他汀的使用仅导致脂肪细胞甘油释放量轻微上升。为解决这一问题，采用了MTT法对脂解作用的测量进行标准化。该方法显著提高了对普伐他汀和辛伐他汀所诱导脂解效应的评估能力，这可能归因于这两种药物对细胞活力的影响。

脂解作用评估中的方法学进展
本研究强调了利用MTT法评估脂质负荷型原代脂肪细胞中脂解作用的重要性与优势。通过整合该方法，成功实现了对脂解作用测量结果的标准化，特别是在实验条件或待测化合物可能影响脂肪细胞活力的情况下。这种标准化过程使得对普伐他汀和辛伐他汀所诱导的脂解效应能够进行更清晰的评估，而这些效应可能因细胞活力的差异而被掩盖。因此，该方法为原代脂肪细胞中脂解作用的评估提供了更精确且可靠的手段，提高了脂解研究的准确性，并有助于以调控脂肪细胞功能为目标的药物开发工作。

该方法在药物研发领域，特别...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22-µm 滤膜	Sangon Biotech Co. Ltd.	F513165-0001	注射器滤器，水相系统，无菌
3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基氯化四氮唑	Sangon Biotech Co. Ltd.	A600799-0001	1 g
96 孔细胞培养板	Sangon Biotech Co. Ltd.	F603204-0001	无菌
阿托伐他汀钙盐	Cayman Chemical	10493-5	5 mg
细胞筛	Sangon Biotech Co. Ltd.	F513450-0001	80 目筛网
水合氯醛	Sangon Biotech Co. Ltd.	A500288-0250	250 g
二甲基亚砜	Sangon Biotech Co. Ltd.	A460700-0100	100 mL
杜氏改良伊格尔培养基	Sangon Biotech Co. Ltd.	E600003	500 mL，高糖，无菌
胎牛血清	Sangon Biotech Co. Ltd.	E600001	100 mL，无菌
甘油比色法检测试剂盒	Cayman Chemical	10010755-96	96 孔
洛伐他汀	Cayman Chemical	10010338-5	5 mg
雄性成年大鼠	莆田学院	Wistar	约 10–12 周龄
青霉素-链霉素溶液	Sangon Biotech Co. Ltd.	B540732-0010	10 mL，无菌
磷酸盐缓冲液	Sangon Biotech Co. Ltd.	E607009-0500	500 mL，无菌，不含钙和镁
普伐他汀钠盐	Cayman Chemical	10010343-5	5 mg
辛伐他汀	Cayman Chemical	10010344-5	5 mg
胰蛋白酶溶液	Sangon Biotech Co. Ltd.	E607003-0100	100 mL，不含 EDTA 和酚红，无菌
II 型胶原酶	Sangon Biotech Co. Ltd.	A004174-0100	100 mg