基于跑步机的小鼠模型结合连续皮肤温度监测用于潮热研究

摘要

本研究通过结合卵巢切除术、运动诱导的产热作用以及连续高分辨率尾部皮肤温度监测，建立了一种绝经期潮热的小鼠模型。

摘要

潮热显著影响绝经期女性的生活质量，但其潜在的神经机制和有效疗法仍不明确。该领域的一个主要挑战是缺乏可靠的动物模型以及用于持续监测皮肤温度的非侵入性方法。本文建立了一种结合卵巢切除与运动诱导产热的小鼠模型，用于研究潮热现象。通过使用3D打印尾套固定的遥测记录仪，在无应激状态下对小鼠尾部皮肤温度进行连续监测。此外，红外热成像相机提供了监测热量产生与散失的补充方法，从而实现对体温更全面的评估。利用该模型发现，卵巢切除小鼠表现出更高的皮肤温度升高幅度和更低的核心体温，有效模拟了人类绝经期所观察到的潮热表型。该方法建立了一个精确的潮热监测模型，将为体温调节、神经科学及临床绝经研究领域的科研人员提供重要工具。

引言

潮热是绝经期最常见且最具干扰性的症状之一，显著影响生活质量¹。这些发作的特点是皮肤温度突然升高，随后核心体温出现短暂下降²，常伴有心率加快、焦虑和头晕³。尽管其影响深远，但目前有效的治疗方法仍然有限⁴，凸显出深入理解其潜在机制的必要性。

研究潮热的一个关键步骤是建立能够准确模拟体温调节功能障碍的可靠动物模型。目前主要采用卵巢切除术（OVX）方法，该方法可引起皮肤温度和核心体温的改变⁵。然而，这些变化往往不一致，可能受到应激或环境温度波动的干扰⁶。此外，捕捉偶发的类似潮热事件仍然具有挑战性。替代方法则使用药理学试剂（如senktide、辣椒素、他莫昔芬或纳洛酮）在啮齿类动物中诱发急性皮肤血管扩张^7,8,9。尽管这些化合物可导致快速且可测量的皮肤温度升高，但其侵入性给药方式及剂量依赖性效应使体温调节反应的解释变得复杂。此外，药物诱导的血管扩张是否能完全重现自然潮热的生理状态仍不明确。因此，迫切需要一种更精确且可靠的动物模型。

运动是体温的已知调节因素，并且与人类潮热的诱发有关¹⁰一些研究利用小鼠的强制运动来模拟类似潮热的散热模式^11,12,13尽管这种方法能够以非侵入性方式诱发温度波动，但在活动中的小鼠身上监测皮肤温度仍具有挑战性，尤其是 通过 红外热成像技术在操作上具有较高难度。此外，对类似潮热症状的全面评估需要持续、长期地同步记录尾部（皮肤）温度和核心体温。

为了克服这些局限性，研究人员开发了一种优化的小鼠模型，将卵巢切除术与跑步机诱导的运动相结合，以可靠地诱发类似潮热的体温调节反应。在实验中，8至10周龄的C57BL/6J小鼠在标准条件下饲养（12:12明暗循环，22 °C ±1 °C，50% ± 10%湿度）。此外，设计了一种由3D打印尾套固定的遥测温度记录仪，以实现对自由活动小鼠尾部温度的无应激、连续监测。同时结合红外热成像技术，以提供有关产热和散热的补充数据。该模型将为研究潮热的机制及评估潜在治疗干预措施提供一种有价值的工具。

方案

这些方法是为小鼠模型设计的。小鼠实验已获得复旦大学机构动物护理和使用委员会的批准（2021JS0040）。在实施实验方案之前，动物的饲养遵循《实验动物护理和使用指南》的要求。本研究中使用8至10周龄的雌性C57BL/6J小鼠，体重为20–23 g，在标准条件下饲养（12:12小时明暗循环，22 °C ± 1 °C，湿度50% ± 10%）。所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 实验准备

1. 准备10只8至10周龄的雌性小鼠，在标准条件下饲养（12小时光照-12小时黑暗循环，22 °C ±1 °C，50% ± 10%湿度）， 随意摄取 食物和水
2. 将小鼠随机分为OVX组和假手术组（每组n = 5）。分笼饲养以帮助同步动情周期。
3. 跑步机实验方案设置
   1. 打开跑步机控制软件 "TSE 跑台（USB）5.1.7_2" 在连接的计算机上（补充图1).
   2. 通过选择初始化一个新的实验文件 文件 > 新建文件 从菜单栏中。
   3. 设定运行程序：
      1. 设置第一阶段：0–20 秒内加速度从 0 加速至 0.17 m/s。
      2. 设置第二阶段：20-150 秒以 0.17 m/s 的恒定速度运行。
      3. 设置第三阶段：150–170 秒内加速度从 0.17–0.25 m/s。
      4. 设置最终阶段：170-600 秒以 0.25 m/s 的恒定速度运行^10,12.
         注意：本实验中不要使用电刺激，以避免额外的应激反应。

2. 动情周期监测

1. 每天同一时间，连续8天，用移液器将100 µL无菌PBS冲洗阴道拭子，并将冲洗液涂布于染色玻片上。
2. 在通风橱中将载玻片上的样品风干24小时。
3. 将样品在室温下短暂浸入100%甲醇中。
   警告：甲醇通过吸入、食入或皮肤接触均有毒性。应在通风良好的通风橱中使用，佩戴腈类手套，并避免接触火花或火焰。
4. 将商品化的20×吉姆萨染液用PBS稀释至1×。
5. 染色  用甲醇固定的载玻片在避光条件下用1×吉姆萨染液染色1-2小时。
6. 根据这些研究，通过检查阴道细胞学来确定动情周期的各个阶段^14,15.
7. 当小鼠处于动情前期时进行实验（图2B).
   注意：操作小鼠时应轻柔，避免因应激导致动情周期紊乱。移液器枪头避免插入过深，以防诱发假孕。

3. 卵巢切除手术

1. 记录小鼠的体重 使用异氟烷麻醉小鼠。手术期间使用加热垫维持动物体温。
2. 在后肢前双侧背外侧区域剃毛，然后用70%乙醇和碘液交替消毒3次。
3. 在皮肤上做一个1 cm长的椎旁切口，使用钝头器械将皮肤与下方肌肉组织分离。然后切开肌壁，用棉签暴露卵巢脂肪垫。
4. 用缝线结扎卵巢血管，使用手术剪切除卵巢¹⁶.
5. 用不可吸收缝线逐层缝合肌肉和皮肤切口。用生理盐水轻轻清洁手术部位周围的皮肤，以去除干燥的血迹或残留的消毒剂。
6. 对于假手术对照组，剪取一块脂肪垫，但不接触卵巢。
7. 术后每天监测小鼠健康状况，持续7天。
   注意：在整个麻醉过程中，应将小鼠置于约 35 °C 的加热垫上。

4. 核心温度记录仪植入

1. 记录仪编程与初始化（补充图2）。
   1. 将温度记录仪垂直插入对接站。
   2. 在软件菜单栏中点击 Recorder > Connect。
   3. 从菜单栏中选择 Edit > New Measurement Seq. Def.。
   4. 在记录模式选项中选择 Multiple Record Intervals。
   5. 设置参数：开始日期：[YYYY-MM-DD HH:MM]，结束日期：[YYYY-MM-DD HH:MM]，记录间隔：5 min。
   6. 将间隔设置添加到序列中。
   7. 点击 Recorder > Start New Measurement Sequence。
2. 在麻醉状态下，剃除并清洁腹部皮肤。
   注意：该腹部温度记录仪植入手术可与卵巢切除术（OVX）同时进行，以避免多次手术。
3. 在膈肌下方约1 cm处，沿中线做一长约2 cm的皮肤切口。
4. 沿腹白线延长切口，打开腹膜腔。
5. 沿矢状面将核心温度记录仪轻柔地插入腹腔。
   注意：正确放置对获得准确的温度读数至关重要。应避免将记录仪置于靠近皮肤的浅表位置，以免环境温度干扰测量结果。
6. 使用5-0不可吸收缝线缝合腹部切口。
7. 用碘溶液对腹部进行消毒。
   注意：恢复期间需密切监测动物状态。使用加热垫维持温暖环境，直至小鼠完全清醒。

5. 尾部安装的温度记录仪固定

1. 记录仪编程与初始化（参考步骤4.1的操作流程，将记录间隔修改为2分钟）。
2. 用乙醇棉片清洁尾部。用70%乙醇对3D套管进行消毒，并将温度记录仪固定于套管内部。
3. 在套管上涂抹快干胶。将记录仪置于距尾根部1 cm处（图1A）。确保记录仪的检测面与皮肤紧密接触。将记录仪固定在尾部腹侧，以尽量减少活动负担。
4. 施加压力固定2分钟。如需精确定位，可使用短暂麻醉。
   注意：放置后需每日监测尾部是否出现肿胀或记录仪脱落情况。正确安装的设备可稳定留存至少3天。

6. 跑台运动及数据采集

1. 在光照阶段，使用1.3步骤中的方案，让小鼠在跑步机上适应3天。
   1. 将小鼠单独置于静止的跑步机传送带上，使其自由探索环境并适应10分钟。
   2. 执行实验方案：
      1. 点击 测量 按钮。单击 开始 启动跑步机。
      2. 选择 开始档案 开始程序化跑步方案。
2. 实验前24小时安装尾部温度记录仪，以确保充分适应（见步骤5）。
3. 实验日光照期的跑步机跑步：
   1. 运动前10分钟，使用红外相机记录30秒的基础温度。同时使用植入式腹腔温度记录仪记录核心温度。
   2. 按照步骤1.3中的方案让小鼠在跑步机上跑步。
      注意：确保小鼠持续跑动600秒。若小鼠停止跑动，可使用毛刷轻轻刺激以鼓励其继续运动。
   3. 跑台运动后，将小鼠转移至清洁笼具中。测量尾温 通过 运动后0分钟、5分钟、10分钟和15分钟进行红外热成像。

7. 数据分析

1. 对于红外和核心温度数据：
   1. 将运动前温度的平均值计算为基线值。
   2. 绘制每个时间点的 ΔT（运动后温度－基线值）。
2. 对于尾部温度记录仪数据：
   1. 使用运动前10分钟的平均值作为基线值。
   2. 在运动后15分钟内，每2分钟计算一次 ΔT。

结果

可靠体温调节监测系统的开发

为了建立一种可靠的测量核心温度和皮肤温度的模型，设计了一种定制的3D打印尾套，可将温度记录仪牢固地固定在尾根部1 cm处（图1A），从而在运动诱发的潮热期间持续、精确地测量散热情况。

该系统实现了连续24小时不间断的尾部温度监测（图1B）。记录的数据显示出明显的昼夜节律，表现为在活跃期（夜间）温度较低，而在静息期（白天）温度较高。值得注意的是，尾部皮肤温度与核心体温呈良好的负相关关系，提示皮肤散热机制在调节核心体温中的作用。这种昼夜节律不仅验证了模型的生理相关性，也证明了套管在长期体温调节评估中的可靠性。

讨论

本研究建立了一种实用且定量的小鼠模型，用于研究更年期潮热，填补了该领域的一项关键空白。通过将卵巢切除术与运动诱导的产热作用相结合，成功再现了人类潮热的核心特征，即尾部皮肤温度迅速升高，随后核心体温下降¹⁸。该模型融合并拓展了现有方法的优势，能够放大温度变化，并实现对潮热诱发时间的精确控制。因此，该模型为探究更年期体温调节的神经生物学机制以及评估潜在治疗干预手段提供了一个可靠的平台。

尾部佩戴式温度记录仪相较于以往研究中常用的有线核心体温监测设备，展现出多项显著优势^6,19首先，其牢固的固定 通过 一种3D打印的固定装置实现了连续、高分辨率的体温数据采集，且不会限制动物活动或改变其自然行为，克服了有线核心体温监测系统的主要局限性。重要的是，该装置重量不足2.3 g，不会影响动物运动能力，也不会造成可观察到的尾部损伤。其开放式设计还保留了正常的热量散失，这对于准确测量皮肤温度至关重要。其次，结合腹腔内传感...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物可植入式温度记录仪	Star-Oddi	DST nano-T
C57BL/6J 小鼠	GemPharmatech	N000013
吉姆萨染色液	Beyotime	C0133
红外热成像	VarioCAM	VC HD head 980
跑步机系统	TSE	Treadmill_6M