使用配备双聚光镜系统的200 kV透射电子显微镜实现高质量断层数据采集

摘要

电子断层扫描技术能够对冷冻生物样品中的细胞器、细胞以及组织内的大分子实现近原子级成像。要达到如此高的分辨率，需要严格控制成像条件。本文以配备两级聚光镜系统的200 kV透射电子显微镜为例，介绍如何进行高质量的电子断层扫描数据采集。

摘要

冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）已成为解析细胞器和大型蛋白质复合物在天然环境中结构的有力手段。与传统的常温电子显微镜技术相比，cryo-ET 能最大限度地减少辐射和样品制备过程中对内部结构造成的损伤。此外，与单颗粒分析（SPA）不同，cryo-ET 减少了对重复纯化的依赖，从而保留了样品最真实的结构信息。为了实现高分辨率成像，cryo-ET 对透射电子显微镜（TEM）的成像条件也提出了严格要求。尽管 cryo-ET 数据采集效率不断提升，并涌现出大量软件平台，但大多数解决方案均为专有软件，依赖特定厂商且与某些电子显微镜型号紧密绑定，导致实施成本高昂。在本研究中，我们将开源软件 SerialEM 安装于配备双聚光镜系统的 200 kV 电子显微镜（Glacios 2 cryo-TEM）上，并进行了全面校准，以实现高质量的断层数据采集。以脱铁铁蛋白作为模型样品，我们详细描述了从冷冻样品制备、自动化 cryo-ET 数据采集，到断层图重建及子断层图分析的完整工作流程。该方法为 cryo-ET 数据采集提供了一种经济高效且易于获取的解决方案，尤其适用于使用 Glacios 显微镜但无法获得专有软件的实验室。

引言

冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）已成为在原位研究大分子复合物和细胞器天然结构的一种强大手段。与单颗粒分析（SPA）相比，cryo-ET 的主要优势在于其能够避免过度的纯化步骤，从而在生物环境中保持目标生物分子的天然状态。目前，多种类型的样品——包括纯化的细胞器^1,2,3,4、细胞膜片、大分子复合物⁵、病毒⁶、细胞薄层⁷以及组织切片^8,9,10 ——均可通过 cryo-ET 进行研究。鉴于样品类型和实验目标的多样性，数据采集策略存在显著差异，必须根据具体样品和仪器配置进行精心设计。

数据采集是冷冻电子断层扫描（cryo-ET）工作流程中的关键步骤，因为数据质量和采集效率直接影响下游处理以及整个实验的成功。为了满足不断变化的实验需求，已开发出多种数据采集平台。其中应用最广泛的包括商业软件 Tomography 和开源软件 SerialEM^11,12,13。Tomography 提供高度集成且用户友好的界面，学习门槛较低，但灵活性较差，且需要商业许可证。相比之下，SerialEM 是一款免费的开源软件包，支持基于图形用户界面（GUI）和基于脚本的工作流程，具有更高的灵活性和可扩展性。

从冷冻薄片中进行断层扫描数据采集面临独特的挑战。高质量薄片的制备难度较大，且其机械不稳定性及对电子辐照的高度敏感性进一步增加了数据采集的复杂性。为应对这些挑战，Fabian Eisenstein 开发了 PACEtomo 工作流程¹⁴，该流程是对 SerialEM 的改进，引入了电子束-图像偏移技术，可在每个倾斜系列中获取多个断层图像，从而减少调焦和追踪校正的频率。该策略在最大限度提高每一样本区域可用数据量的同时，最小化了不必要的电子束暴露。类似功能也可在商业软件 Tomography5 中获得。

相比之下，从冷冻固定的细胞器或膜片中收集数据通常更为直接，因为这些样品通常制备在有孔碳支持膜载网上，提供了充足的区域用于聚焦和追踪^15,16。在此类情况下，SerialEM 内置的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）数据采集工作流程——可通过其图形用户界面（GUI）直接访问——为初学者或规模较小的实验室提供了一种便捷且无需编写脚本的选项。然而，从效率角度出发，我们仍然建议在条件允许时优先采用基于电子束图像偏移的策略。

鉴于冷冻电子显微镜的高昂成本，优化数据采集策略以最大化仪器利用率至关重要。配备两级聚光镜系统的200 kV透射电子显微镜对厚样品的电子穿透能力略低于300 kV仪器，但在正确校准后仍完全适用于冷冻电子断层扫描（cryo-ET）。然而，由于其平行束条件的调节范围相对较窄，且在不同放大倍数下光斑尺寸固定，除非系统经过精确优化，否则通常不太适合高分辨率的冷冻电子断层扫描。

我们的电子显微镜系统配备了一台Falcon 4i直接电子探测相机，该相机在单电子计数能力和高速连续成像方面具有显著优势。为了充分挖掘该探测器的性能，透射电子显微镜（TEM）必须在优化良好的成像条件下运行。对于采用两级聚光镜系统的TEM，精确校准平行光照明条件是提升成像质量的重要因素^17,18。在现代两级聚光镜系统中，第二级聚光镜的焦点必须与上部物镜的前焦平面重合，以确保穿过样品平面的光路保持平行。准确建立的平行光条件对于保证所采集图像中局部位置的欠焦值和放大倍数的一致性至关重要。

本研究聚焦于利用脱铁铁蛋白作为模型样品，建立高质量的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）工作流程。由于200 kV透射电子显微镜系统未获得商业断层成像软件的使用许可，我们转而安装并校准了开源的SerialEM平台。通过精细优化显微镜两级聚光镜系统的平行光参数，我们借助SerialEM图形界面实现了自动化的断层数据采集，无需编写Python脚本或进行复杂配置。该方法为在Glacios等200 kV仪器上高效获取冷冻电子断层数据提供了一种操作简便且成本低廉的解决方案。

方案

1. 冷冻样品的制备与上样

1. 准备 Vitrobot 时，先将其打开并将温度设为 10 °C，湿度设为 100%。更换滤纸。
2. 将一块 300 目 R1.2/1.3 空心碳膜 Quantifoil 铜网放入电晕放电系统中。设置电晕放电条件为：电流 15 mA，时间 60 秒，真空压力 0.39 mBar，负电荷模式。通过电晕放电处理使网格表面亲水化。
3. 设置 Vitrobot 参数如下： blotting 时间：3 秒，等待时间：0 秒，blotting 力：2，温度：8 °C，湿度：90%。
4. 使用液氮冷却包裹在液氮中的乙烷杯，从而在其中制备液态乙烷。
5. 将 3 µL 去铁蛋白样品滴加到经电晕放电处理的网格上，并立即在液态乙烷中进行玻璃化冷冻。
6. 将样品从乙烷中转移至预先用液氮冷却的储存盒中。至此，冷冻样品制备完成。
   注意：操作液氮和乙烷时必须严格遵守以下安全规程：必须佩戴个人防护装备（如耐低温手套和护目镜），以防止冻伤；在冷凝乙烷前，确保接收杯中无残留液氮，以避免因快速沸腾导致飞溅；使用后应牢固关闭乙烷气体系统的主阀和调压阀，防止泄漏；样品制备完成后，残留的乙烷和液氮必须在制备室内的指定通风设备中妥善处理。

2. 确定透射电子显微镜的平行光条件

1. 在进行平行光束校准之前，首先调整电镜的以下参数：样品台处于齐焦高度，物镜聚焦，纳米探针模式下的光束倾斜 ppX/ppY，无像散枢轴点 X/Y，像散和消像散器。
2. 使用十字栅格样品，在纳米探针模式下以 SA 73,000× 的放大倍数（不使用能量过滤器）确认样品处于齐焦高度并正确聚焦。
3. 切换至衍射模式（相机长度：D750 mm），并插入 100 µm 的物镜光阑（图 1A、1B）。
4. 点击物镜光阑的调节选项卡，使用多功能 X 和 Y 旋钮将物镜光阑移离中心，使光阑边缘与金衍射环重叠，并部分遮挡中心斑点（图 1C）。
5. 通过调节聚焦旋钮调整衍射聚焦，使物镜的后焦平面清晰可见，直至物镜光阑边缘尽可能锐利（图 1D）。
6. 调节光束强度（C2 强度），直到金衍射环的宽度最小化。
7. 将物镜光阑重新居中。增加衍射相机长度，直至仅中心斑点可见（图 1E）。
8. 点击消像散器面板中的“衍射”选项卡，使用多功能 X 和 Y 旋钮，在略高于和略低于束斑交点的位置之间反复调节，调整中心斑点的形状，使光束呈圆形（图 1F）。
9. 调节光束强度，使中心斑点最小化。此步骤将建立平行照明条件。由于平行照明条件可能随不同束斑尺寸而变化，应记录每种常用束斑尺寸对应的 C2 设置，以便在后续实验中快速配置。
   注意：数据采集过程中使用的具体束斑尺寸取决于放大倍数和 C2 光阑设置；我们需要确保成像时相机的电子剂量率处于最佳水平。

3. 脱铁铁蛋白样品的高质量电子断层扫描数据采集

注意：本部分概述了一种高通量断层扫描数据采集的标准化操作流程，适用于经验丰富的使用者以及新进研究人员。

1. 将O形圈放入对准工具中，并将制备好的载网置于O形圈中心，以固定载网并将制备好的冷冻样品装入电子显微镜。使用弹簧笔将C形圈夹在O形圈上，使样品固定于两者之间。
2. 将Autogrid垂直插入胶盒的插槽中，通过工作站将其转移至纳米杯，然后装入电子显微镜。
3. 使用 SerialEM 捕获整个网格的完整拼图时，启动 SerialEM 软件，启用低剂量模式，并将搜索模式设置为 115× 放大倍数。
   注意：搜索放大倍数通常用于获取大范围的图像拼接图。该放大倍数应尽可能设为最低，以加快成像拼接速度，同时仍确保图像拼接的准确性。
4. 打开 Navigator 文件。转到 导航器 > 拼接成像 & 网格 > 设置全蒙太奇在对话框中，设置 使用搜索模式；将图像以 bin4 格式保存。单击 开始 在“蒙太奇控制”下。
5. 为校准搜索和观察视野，在搜索模式下，定位一个易于识别的标志性结构（图2A）。点击 添加标记 在导航器中点击 前往标记 移动到标记位置。
6. 切换至观察模式（2600×），找到相同的标记位置。单击 标志性事件. 转至导航器，点击 切换至标记 以对齐视野（图2B）。根据对话框中的提示，将两种放大倍数下的电子束偏移量分配给搜索图中的所有标记，并保存偏移值（图2C).
   注意：视图放大倍数通常设置为选区（SA）的最低放大倍数，以确保视图和记录模式一致，从而在切换放大倍数时使居中过程更加简便。
7. 校准视野并记录观察区域（图3）。在查看模式下，找到一个易于识别的标志性位置。切换至记录模式（120k×）。使用鼠标将该标志性位置置于记录模式视野中央。
   注意：记录放大倍数的设置取决于估计的目标分辨率（目标分辨率为像素大小的两倍）以及样品的尺寸。
8. 切换回观察模式并拍摄图像。使用鼠标右键将观察放大倍数下的目标物体拖动至视野中心的十字准线处。
9. 点击 设置 在离焦部分中，使用 Shift 功能对齐视野。
10. 在完整拼接图中，点击5.1以选择目标方格并获取中等放大倍数的图像地图 添加多边形 勾画出需要捕获的区域。完成区域勾画后，单击 停止添加 以完成筛选。
11. 对所有目标区域重复步骤 3.10。在导航器中，针对每个多边形勾选“采集 (A)”和“逐项新建文件”选项。
12. 在选中“项目”中的“新建文件”后出现的对话框中，选择以下内容： 拼接图像；将拼接图拟合至多边形；打开下一个新文件时关闭当前文件. 点击 好的.
13. 在新打开的对话框中，选择以下内容： 移动载物台而非移动图像；在低剂量模式下使用视图参数将图像保存至指定位置。
14. 在 Navigator 菜单中，点击“Items”下的“Acquire”以获取中等放大倍数的图像地图。勾选以下选项：获取并保存图像或拼接图；生成 Navigator 地图。
15. 在“主要操作相关”部分，勾选“使用查看模式捕获图像”。在“主要操作之前或之后的任务”部分，勾选 粗略居中度单击“GO”以开始捕获中等放大倍数的图像。
16. 在中等放大倍数图上选择点位。在 Navigator 界面中打开中等放大倍数图，点击“添加点”（Add Point），然后在图中左键点击目标对象。
17. 对所有需要的点重复上述步骤。选择完所有点后，单击 停止添加 以完成筛选。
18. 为进行光阑对中，需在显微镜用户界面中使用直接对中功能，调节纳米探针束倾角 ppX/ppY 以及无彗差支点 X/Y，以最小化视场中电子束斑的晃动。
19. 使用 SerialEM 脚本库中的脚本执行调谐校准（https://serialemscripts.nexperion.net/script/47）。
20. 在 Navigator 界面中，定位 ROI 以启动断层扫描数据采集，并进行检查 倾斜系列在对话框中，选择 帧图像；选择数据存储位置。
21. 在设置对话框中，将角度范围设置为 -50° 至 50°，基础增量设为 2.5°，起始角度设为 0°，并启用剂量对称模式。
    注意：每个倾斜角度的剂量、倾斜角度范围和倾斜步长的设置通常遵循以下原则：总剂量应保持在约 100 e⁻/Ų。选择倾斜角度范围时，需确保即使在最大倾斜角度下，样品仍基本无遮挡，能够保证足够的电子透过和成像质量。若倾斜范围较大（例如超过 ±60°），倾斜步长可设为 3°；若倾斜范围较小（例如约 ±50°），则可将倾斜步长减小至 2.5° 或 2°，以确保总剂量维持在约 100 e⁻/Ų。这一点对于 200 kV 电镜尤为重要，因为相较于 300 kV 电镜，其辐射损伤更为显著，因此必须避免总剂量过高。
22. 在光束强度或曝光控制部分，检查 保持光束强度将离焦目标值设为 -3 µm，将自动对焦频率设为每倾斜一次对焦一次。
23. 检查 停止 如果自动对齐（Autoalign）的位移超过图像尺寸的60%，请设置“跟踪前”（Track Before） &；之后。
24. 要开始数据采集，在 Navigator 中点击 获取项目在主要操作中，检查 在自动对焦中循环离焦目标，等待漂移 & TS.
25. 将离焦范围设置为 -3.5 至 -4.5 µm，分 4 步进行。在“常规”中启用 结束时关闭柱阀门在“主要步骤之前或之后的任务”部分，启用 重新对齐到项目 和 初级前精细同光心调节.

4. 脱铁铁蛋白的亚断层平均化

1. 使用 Warp¹⁹ 进行运动校正和 CTF 估计。使用 AreTomo3²⁰ 进行断层倾斜系列图像的对齐。
2. 使用 Warp 执行断层重建和去卷积。使用 PyTom²¹ 进行基于模板的颗粒挑选。
3. 使用 RELION 5²² 进行初步精细重构。使用 M²³ 进行高分辨率精细重构。
4. 通过处理八个倾斜系列图像，随后挑选 5,939 个颗粒并进行迭代精细重构，最终确定结构，达到 2.8 Å 的分辨率（图 4）。

结果

在精确对准平行光束后，我们使用 SerialEM 的图形界面功能对脱铁铁蛋白进行了断层数据采集。随后利用 Warp、AreTomo、PyTom、RELION 及其他相关软件进行处理，最终获得了分辨率为 2.8 Å 的结构。该分辨率充分证明了我们数据的高质量，达到了目前亚断层平均法在相对高分辨率下可实现的水平。如图4所示，对齐并重建的结果（图4A）清晰展示了脱铁铁蛋白的整体结构及其空间分布。我们对从八个对齐并重建的倾转系列中提取的颗粒进行了亚断层平均分析，获得了分辨率为 2.8 Å 的结构（图4B）。相应的傅里叶壳层相关（FSC）曲线如图4C所示。

图1：利用第二聚光镜系统确定平行照明条件。（A）无光阑时衍射模式下的衍射图样。（B）插入100 µm物镜光阑后的衍射图样。（C）将光阑偏离衍射中心以更清晰地观察边缘锐度。（D）通过调节物镜和C2透镜电流，使光阑边缘聚焦并优化衍射环。（E）中心衍射斑呈椭圆形，需通过消像散器面板进行校正。（F）中心衍射斑呈圆形且尺寸最小，表明平行照明已优化。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：从搜索模式（115×）到观察模式（2600×）的由低倍至高倍对齐过程。（A）搜索模式图像，标记（红色箭头）位于孔边缘处。（B）观察模式图像，标记（红色箭头）位于与（A）中相同的目标位置。在导航器中点击“移至标记”选项。（C）在弹出窗口中，将两个放大倍数下的电子束偏移量分配给搜索图中的所有标记，并保存偏移值。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：从观察模式（2600×）到记录模式（120k×）的由低倍至高倍对中过程。（A）在记录模式下，目标物体位于视野中心（红色虚线圆圈标示目标物体）。（B）在观察模式下采集的图像，其中目标物体未与红色十字线对齐（红色虚线圆圈标示目标物体，红色十字线标示中心位置）。（C）通过右键点击并拖动目标物体至红色十字线中心，随后按下位于 Shift 按钮旁的 Set 按钮完成对中（红色虚线框标示该按钮）。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：脱铁铁蛋白的结构解析。（A）结构成像。最终子断层平均图的局部分辨率图。图像纹理均匀，整个视场内呈现出紧密排列且重复的纳米级特征。（B）空间分辨的定量映射。同一或相关纳米结构区域的伪彩环形图。颜色从蓝色/绿色过渡到黄色/红色，对应于下方色标所示的数值（约2.5至3.5，任意单位）。颜色分布的非均质性表明样品中某一测量性质（例如高度、厚度、折射率或力学/光学响应）在空间上存在变化。（C）整体谱学或功能表征。用于分辨率评估的傅里叶壳层相关（FSC）曲线。虚线（FSC = 0.143）所指示的最终分辨率为2.8 Å。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

冷冻样品制备和电子断层数据采集的步骤必须根据具体的样本类型进行调整。此处描述的实验策略非常适合生物大分子、蛋白质复合物以及小型细胞器。这些样本可直接玻璃化固定在电镜载网上，其相对较薄的厚度有助于实现高效的电子束穿透，并获得高对比度的图像。理想情况下，样本厚度不应超过 200 nm。

对于冷冻固定样品，通常建议侧向尺寸小于10 µm，以尽量减少结晶冰的形成，因为结晶冰可能破坏结构完整性。对于较大的样品，可通过高压冷冻或在缓冲液中添加冷冻保护剂（如甘油）来延缓冰核形成²³。然而，为满足透射电子显微镜（TEM）对厚度的要求，通常还需进一步减薄。在现有的减薄方法中，聚焦离子束（FIB）铣削²⁴因具有高精度和低损伤的特点而被最广泛采用，可制备出适用于高分辨率冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的薄片样品。

在收集 lamella 数据时，最大限度地提高 lamella 的利用率至关重要。采用束斑-图像偏移采集技术可减少重复进行聚焦和追踪步骤的需求，从而提高数据采集通量。尽管此处未详细描述该技术，但其已在 PACEtomo 方法学中得到充分阐述。

目前，用于断层扫描数据采集的主流软件包括 Tomography（赛默飞世尔科技）和 SerialEM。Tomography 是一种商业软件，其自定义灵活性有限；而由科罗拉多大学博尔德分校的 David Mastronarde 开发的 SerialEM 是一款开源软件，支持基于脚本的自动化操作。然而，充分挖掘 SerialEM 的功能需要较高的学习成本。在本研究中，我们提出了一种简化的操作流程，该流程充分利用 SerialEM 的图形用户界面（GUI），无需编写脚本或进行基于 Python 的配置，即可实现无人值守的过夜数据采集。

采用该方法进行断层扫描数据采集时，常遇到的一个挑战是追踪不准确，这可能导致倾斜系列数据不完整（缺失某些角度）或给后续的对齐带来困难。为减轻这些问题，必须根据样品的衬度和倾斜台的稳定性优化追踪参数。有效的策略包括：调整追踪位置的曝光时间以确保图像清晰度，将追踪位置与聚焦位置在物理上分开以减少累积辐射损伤，以及在台体稳定性较差时降低追踪放大倍数，以利于可靠的图像模式匹配。总体而言，这些调整对于在不同实验条件下实现稳定的追踪性能至关重要。在本研究中，我们以脱铁铁蛋白（apoferritin）作为模型样品，在完成平行光测试与校正的基础上，利用SerialEM内置功能采集高质量的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）数据，并对铁蛋白样品进行子断层图平均计算，最终获得了分辨率为2.8 Å的三维结构。

本方法旨在拓展200 kV电子显微镜在高分辨率冷冻电子断层扫描（cryo-ET）中的应用。实现此类分辨率的根本在于获取高质量的成像数据，而这又依赖于精确的照明条件。为此，我们执行了准确的平行照明对中，作为关键的准备工作。此处描述的对中程序专为配备双聚光镜系统（如Thermo Fisher Scientific Talos Arctica和Glacios）的透射电子显微镜（TEM）设计。与具有第三聚光镜（C3）的仪器不同，这些系统将平行照明条件限制在C2透镜的唯一特定激励值上。这一固有约束要求电子束必须进行极为精确的对中，以将光源像定位在上部物镜的前焦平面——这是实现最佳成像性能的前提条件。我们后续的数据处理结果表明，在完成此对中后，该200 kV显微镜在测试样品上的数据采集质量几乎可与通常300 kV仪器所预期的水平相媲美。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ANTCryoTM niti 网格	Najingdingxin	M04240922A	用于冷冻样品制备
脱铁铁蛋白	Biortus	BP17854-00A	用于冷冻样品制备
交叉刻栅网格	Agar Scientific	AGS106	用于确定平行光条件
Glacios2	thermo fisher	9959084	用于断层扫描数据采集
2 号滤纸，55 mm	Whatman	10311807	吸水纸
PELCO easiGLOW	TED PELLA	91000-01020	用于辉光放电处理
Quantifoil 铜网	quantifoil	N1-C14nCu30-01	用于冷冻样品制备
Vitrobot Mark IV	thermo fisher	230101164	用于冷冻样品制备