大规模并行剪接检测法用于分析疾病相关内含子变异引起的剪接错误

摘要

本文介绍了一种用于执行大规模并行剪接检测（MaPSy）的详细方案，该方法利用微型基因构建体对大量内含子变异进行系统性评估。该方法通过扩增子测序在细胞中实现对变异所致剪接变化的高通量分析，从而对这些变异对前体mRNA剪接的影响进行功能评价。

摘要

剪接错误占导致罕见遗传病的致病性突变的10%至30%。RNA剪接通过选择性连接外显子并去除内含子来确保正常的基因表达，其中关键的调控序列位于内含子内部。5'剪接位点和分支位点与小核RNA相互作用，形成剪接体的识别复合物，而多嘧啶 tract 及剪接增强子/沉默子等元件则招募蛋白质以调控剪接体的组装。由于这些相互作用的复杂性，从内含子变异预测剪接破坏具有挑战性。

内含子变异占人类自然基因变异的90%，可能破坏经典的剪接过程并导致疾病。为了研究这种可能性，我们开发了一种大规模并行剪接检测方法（MaPSy），用于评估在患者中发现的内含子变异。含有参考序列或变异序列的合成寡核苷酸被连接到包含启动子和多聚腺苷酸化信号的剪接迷你基因中。每个构建体包含两个恒定外显子，中间夹着一个外显子，该外显子包含感兴趣的可变内含子-外显子连接序列。通过将变异序列的细胞剪接效率与相应的参考序列进行比较，我们能够识别出对剪接产生显著影响的剪接变异体。

MaPSy 的结果可通过其他方法进行验证，例如微基因检测或 CRISPR 介导的基因组编辑 体内此外，对断裂连接位点的汇总分析可为剪接机制及与剪接错误相关的疾病分子基础提供更深入的见解。

引言

RNA剪接是一个关键过程，通过连接外显子以供翻译，并移除内含子，从而促进RNA的核输出并维持核酸稳态。这一高度调控的机制以时空特异性方式运作，有助于转录组的多样性和复杂性¹。剪接过程由多个关键信号引导，包括5'剪接位点（5'ss）、分支位点和3'剪接位点（3'ss），以及诸如分支位点下游的多嘧啶 tract 和AG二核苷酸排除区等辅助调控元件，这些元件有助于3'ss的识别²。在机制上，U1小核RNA（snRNA）与5'ss配对，而分支位点则与U2 snRNA相互作用³。分支位点、多嘧啶 tract 和3'ss的协同作用促进了U2小核核糖核蛋白（snRNPs）及U2辅助因子的结合，稳定剪接体结构，并将分支点定位，使其对5'ss发起亲核攻击，从而启动剪接反应。

随着测序技术的快速发展，全基因组测序的成本持续下降，导致人类遗传变异的目录不断扩大。据估计，在罕见遗传病中，有10%-30%的致病突变会影响RNA剪接^4,5,6，常常产生异常的基因产物，这些产物可能成为治疗靶点。然而，由于剪接信号复杂，且通常具有冗余性和简并性，评估内含子变异的功能影响仍然具有挑战性。尽管5'和3'剪接位点相对明确，但在高等真核生物中，分支位点、多嘧啶 tract 以及其它剪接调控元件在序列和位置上表现出显著的变异性。大规模定位研究进一步表明，单个内含子中可能存在多个分支位点^7,8,9,10，这使得对内含子-外显子边界变异的解读更加复杂。

深度学习已被用于评估初级序列如何影响剪接位点的识别^4,11,12，研究发现剪接变异主要聚集在经典的剪接位点，而在外显子及内含子3'区域则稀疏延伸。这一模式与已有认知一致：5'剪接位点的选择主要由共识序列决定，而3'剪接位点的识别则依赖于其他内含子元件，如分支位点和多嘧啶 tract。然而，现有模型的训练目标主要是区分组成型剪接位点与可变或人工剪接位点，而非专门针对内含子变异。因此，这些计算工具的预测准确性有限，主要识别剪接位点和外显子内的剪接变异^13,14,15,16。除了预测模型外，若能建立一种可大规模验证剪接变异的实验体系，将显著提升对剪接缺陷的识别与表征能力。

由于疾病相关内含子变异频率较低，且难以从现有数据集中预测剪接结果，因此将此类变异与剪接表型关联的全面RNA测序数据仍然匮乏。为弥补这一空白，研究人员已开发出高通量剪接检测方法和计算模型，以系统性分析剪接变异。大规模并行剪接报告子检测（MaPSy）被设计用于评估可变序列对剪接位点选择的影响。该方法通过在固定的微型基因骨架中引入位于5'和3'剪接位点附近的序列变异，或覆盖整个内含子-外显子区域的变异，从而实现对剪接改变的功能性评估。然而，由于批量寡核苷酸合成技术的限制，该方法无法检测深部内含子变异和假外显子激活事件。

MaPSy 的稳健性已通过 70 个独立的剪接微型基因得到验证，其皮尔逊相关系数达到 0.89¹⁷。值得注意的是，约 90% 的剪接供体变异（+1 和 +2）表现出剪接缺陷，突显了该检测方法的准确性。此外，采用随机化分支位点序列的 MaPSy 揭示了分支位点识别的简并特性及其对 U2 核心蛋白的依赖性¹⁸。进一步地，结合荧光激活细胞分选（FACS）的分裂型 GFP MaPSy 设计已被用于研究由遗传变异引起的外显子跳跃事件。该方法发现，54% 的剪接破坏性变异位于内含子区域，包括经典的剪接位点¹³，强调了内含子元件在剪接调控中的重要作用。综上所述，这些研究结果强化了内含子序列在剪接调控中的重要性，并展示了 MaPSy 在识别与疾病相关的剪接缺陷方面的应用价值（图 1）。

图 1：近外显子区内的内含子突变大规模并行剪接检测（MaPSy）实验设计。 从人类疾病数据库中收集已记录的变异，并合成为 5,307 对寡核苷酸。每对寡核苷酸包含参考等位基因和变异等位基因，覆盖 78 个核苷酸（nt）的内含子区域和 35 个核苷酸（nt）的外显子区域。这些寡核苷酸两端带有通用引物结合位点，用于扩增并连接至包含三个外显子的剪接微型基因（minigene）。因此，合成区域包含微型基因第二外显子的 3' 剪接位点（3'ss）。微型基因构建完成后，将混合的微型基因转入人胚胎肾细胞（HEK293T）中进行剪接。收获剪接后产生的异构体，并通过扩增子测序进行分析。本图经 Chiang 等人¹⁷ 许可改编。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. MaPSy 寡核苷酸（oligo）文库的合成

1. 寡核苷酸基本结构：设计155个核苷酸（nt）的寡核苷酸文库，使每个寡核苷酸包含35-nt的外显子序列和80-nt的内含子序列，形成一个115-nt的基因特异性区域，其两端各被20-nt的通用引物序列所侧翼（图2A）。
2. 变异位点收集：为保持基序完整性并聚焦于影响剪接的调控区域，收集以下范围内的内含子变异位点：
   -距3'剪接位点（3'ss）-78至+10 nt
   -距5'剪接位点（5'ss）-3至+30 nt
   注：临床变异可来源于ClinVar¹⁹、dbSNP²⁰中的低频条目、相关出版物及其他临床数据库。可利用基因组坐标与目标基因组区域进行交集分析（例如使用BEDTools²¹）。仅选择单核苷酸多态性（SNPs）以及小于15 nt的小插入/缺失（indels），以最小化寡核苷酸文库在批量合成过程中的长度差异。
3. 微型基因基本结构：为保留剪接连接结构，每个微型基因骨架包含三个外显子：两个恒定的外侧外显子编码EGFP片段（来自pGint，Addgene质粒#24217），中间外显子来源于人CAMTA2的第15号外显子（图2B）。使用BamHI和SalI限制性内切酶对CAMTA2片段和pGint质粒进行双酶切，将CAMTA2片段连接至pGint中两个EGFP外显子之间，构建pGint-CAMTA2三外显子微型基因（补充文件1）。
   注：中间外显子（即CAMTA2第15号外显子）在靶细胞中表达时应表现出中等水平的剪接效率。该特性至关重要，因其提供了平衡的基础水平，便于检测由变异引起的剪接效率升高或降低。
4. 引物位点设计：在文库两端添加插入位点序列，使每个寡核苷酸包含约20-nt的侧翼序列，与中间外显子/内含子内的目标插入位点重叠（图2A）。
   注：若寡核苷酸文库设计用于多个微型基因构建体，可引入多个引物位点。
5. 条形码设计：对于内含子变异，外显子条形码对于区分基因型与剪接产物至关重要，因为内含子序列在剪接后会被去除。为避免条形码序列引起剪接改变（即条形码效应），应将条形码置于外显子远端，远离剪接位点（即紧邻外显子引物位点）。
   注：建议在可能的情况下为每个变异使用多个条形码。所需条形码长度取决于文库复杂度。例如：
   若一个参考等位基因仅与一个变异配对，则1-nt条形码已足够。
   若一个参考等位基因与六个不同变异配对，则建议使用2-nt条形码。
   对于多个变异紧密关联于单一参考等位基因的文库（例如仅单核苷酸差异），可能会增加分析复杂性。
6. 订购寡核苷酸：以FASTA文件格式订购寡核苷酸，每个变异连接处需与其对应的参考等位基因成对列出。
   ​注：对于具有多个变异的连接处，每个连接处仅需一个参考等位基因。多家公司提供寡核苷酸池合成服务，例如GeneScript（https://www.genscript.com/gentitan-oligo-pools.html）、Twist Bioscience（https://www.twistbioscience.com/products/oligopools）、IDT（https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos/opools-oligo-pools）和Agilent（https://www.agilent.com/en/product/oligo-pools-oligo-gmp-manufacturing/pooled-oligo-synthesis）。合成长度、文库容量及成本可能因供应商和地区而异。

图 2：用于MaPSy的Oligo和剪接微型基因设计。（A）内含子3'或5'末端的混合Oligo合成设计。图示为155-nt寡核苷酸的基本结构。Oligo的实际合成容量取决于所选生产公司。（B）MaPSy微型基因的设计。三外显子微型基因（ii）由pGint质粒（i）改造而来，并通过混合Oligo替换剪接位点以引入剪接信号变异（iii）。请点击此处查看该图的放大版本。

2. MaPSy文库DNA模板的构建

1. 收到寡核苷酸文库后的初始扩增
   1. 收到寡核苷酸文库后，使用高保真DNA聚合酶（High-Fidelity DNA Polymerase）对10–50 ng的寡核苷酸文库进行100 µL的聚合酶链式反应（PCR）扩增，利用设计好的侧翼引物结合位点将寡核苷酸转化为双链结构（引物LibF和LibR见表1，热循环仪设置见表2）。
   2. 使用纯化柱对PCR产物进行纯化。具体操作为：将PCR产物结合至柱膜上，随后用含70%乙醇的缓冲液洗涤，以去除残留的引物、盐分和聚合酶。最后使用低盐缓冲液或无核酸酶水洗脱纯化的PCR产物。
   3. 通过凝胶电泳检测扩增后的寡核苷酸片段大小。取5 µL纯化后的PCR产物，上样至用1× TAE缓冲液（40 mM Tris碱，20 mM乙酸，1 mM EDTA，pH 8.0）配制的1.5%琼脂糖凝胶中。
      注意：PCR扩增循环数应限制在15个循环以内，以防止过度扩增和PCR偏差。若出现一条较模糊的次级条带，且其大小通常大于目标产物，则可能提示存在过度扩增及寡核苷酸文库内部退火不完全。建议保留部分PCR产物并进行测序，以评估文库质量和错误率，再继续后续实验（暂停点）。
2. MaPSy剪接微型基因构建——初始PCR
   1. 骨架片段：以0.5 ng的pGint-CAMTA2质粒骨架作为两个主要PCR片段的模板
      1. PCR产物1：扩增CMV启动子、第一外显子（N端EGFP）以及第一内含子的部分序列（见表1和表2）。
      2. PCR产物3：扩增中间外显子的部分序列（CAMTA2外显子15）、第二内含子、第三外显子（C端EGFP）以及SV40多聚腺苷酸化信号（见图3、表1和表2）。
   2. 文库扩增子：PCR产物2：针对3'ss文库，扩增两端带有重叠序列的文库扩增子，使其与PCR产物1和PCR产物3的内侧末端匹配，从而实现高效整合至CAMTA2外显子15的3'ss位点（见图3、表1和表2）。
      注意：对于5'ss文库，需将中间外显子连接处的5'端替换为文库序列。
3. PCR完成后，使用纯化柱对所有产物进行纯化（操作同步骤2.1.2）。为避免模板质粒污染，需通过琼脂糖凝胶回收法对PCR1和PCR3中的目标产物进行进一步纯化。具体操作为：电泳后切下约100 mg含有目标PCR产物的琼脂糖凝胶，溶于结合缓冲液中，将溶解后的凝胶溶液结合至柱膜，随后按标准PCR纯化流程进行操作。
4. MaPSy剪接微型基因构建——重叠延伸PCR：进行一轮或多轮连续的重叠PCR，将三个主要片段（PCR产物1、文库扩增子和PCR产物3；每种模板各使用约20 ng）连接成全长剪接微型基因（使用最外侧引物CAMGFPF和CMVGFPR，见表1；热循环仪设置见表2）。
   注意：最终产物包含CMV启动子和三个外显子，其中第一个3'ss来源于寡核苷酸文库，可直接用于细胞转染实验。
5. 完成组装后，使用PCR纯化柱对全长DNA模板进行纯化。若凝胶中观察到非特异性条带，应参照步骤2.3进行凝胶回收，以精确分离目标全长产物。
   ​注意：文库中高度相似的序列可能导致组装不完全。若单次PCR难以实现完整组装，可尝试分步进行重叠PCR（先连接两个片段，再加入第三个）。为提高PCR特异性，可考虑调整退火温度或采用降落PCR（touch-down PCR）以增强复杂模板的结合特异性。应准备足够量的MaPSy构建体，以支持至少四次独立实验。每种构建体保留少量样品用于下一代测序，以验证序列完整性，因为部分寡核苷酸可能扩增效率较低，导致组装不完整（暂停点）。

图3：文库构建流程。（A） 重叠PCR中使用的引物（另见 表1). （B） 重叠PCR操作步骤。简言之，通过25个PCR循环扩增寡核苷酸池及拼接迷你基因的其他部分。含有启动子和第一外显子的片段（PCR产物1）通过20个扩增循环的重叠PCR与寡核苷酸池（PCR产物2）连接。随后，将连接产物（PCR产物1+2）进一步与含有3′端的片段进行连接^rd 外显子和多聚腺苷酸化信号（PCR产物3），使用20个扩增循环以获得最终构建体（PCR产物1+2+3）。本图已获Chiang等授权改编。¹⁷. 请点击此处以查看此图的放大版本。

MaPSy文库引物的构建		备注
CMVGFPF	CCGCCATGCATTAGTTATTAATAG	PCR产物1
LibR2	CAGGTCTTCAGGCCCCAGCC	PCR产物1
LibF	GGCTGGGGCCTGAAGACCTG	PCR产物2
LibR	AAGGCGCACATGACCCCGGG	PCR产物2
LibF2	CCCGGGGTCATGTGCGCCTT	PCR产物3
CMVGFPR	GGACAAACCACAACTAGAATGC	PCR产物3
用于扩增子测序的MaPSy文库PCR引物
P7-Lib0F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib1F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib2F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib3F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P5-Lib0RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib1RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib2RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib3RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
验证引物
Lib0F（文库验证）	AAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
Lib0R（文库验证）	CAGCTTGCCGTAGGTGGCAT

表1：本方案中使用的引物。

PCR 反应体系
组分	体积
ddH2O	13.4 μL
5x HF Buffer	4 μL
10 mM dNTPs	0.4 μL
正向引物 10 µM	0.5 μL
反向引物 10 µM	0.5 μL
cDNA	1 μL
高保真 DNA 聚合酶	0.2 μL

运行PCR程序（20 µL反应体系）
	温度	时间	循环数
初始变性	98°C	1 min	1
变性	98°C	30 s	10–20
退火	65°C	30 s
延伸	72°C	30 s	返回变性步骤
最终延伸	72°C	5 min	1
保存	4°C	保存	保存

表2：PCR仪设置。

3. 从哺乳动物细胞中表达并回收剪接微基因

1. 细胞培养：在 37 °C、5% CO₂ 条件下，将 HEK293T 细胞培养于添加了 10% 胎牛血清（FBS）、100 单位/mL 青霉素和链霉素以及 2 mM L-谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。
2. 剪接微型基因的转染：
   1. 转染前 24 小时，将 5 × 10⁵ 个 HEK293T 细胞以 2 mL 培养基接种于 6 孔板中。
   2. 按照生产商说明书，将细胞与 1–2 µg MaPSy 载体共转染，该载体需预先与 3.75 µL 转染试剂在室温孵育 5 分钟。成功转染的标志是剪接文库中出现 EGFP 信号。
   3. 转染后 24 小时，使用 250 µL Trizol（或等效试剂）裂解细胞。
3. RNA 提取：使用 RNA 小量提取试剂盒，按照生产商说明书提取总 RNA。具体操作包括：将 Trizol 中的 RNA 结合至柱膜上，用含 70% 乙醇的洗涤缓冲液去除盐类、蛋白质及其他杂质，最后用低盐缓冲液或无核酸酶水洗脱纯化后的 RNA。
   警告：Trizol（或等效试剂）具有强腐蚀性和毒性，接触可能导致严重化学灼伤、永久性瘢痕以及肾功能衰竭。
   注意：RNA 可在 Trizol（或基于 Trizol 的等效试剂，如 TOOLS 公司的 TOOLSmart RNA 提取试剂）中于 -80 °C 保存长达一年（可暂停点）。若尽量减少冻融循环，纯化后的 RNA 可在 -80 °C 保存长达两年（可暂停点）。
4. 逆转录：使用随机六聚体引物和逆转录酶，以 2 µg 总 RNA 制备 cDNA，操作遵循生产商说明书。具体步骤为：将 RNA 与 50 µM 随机六聚体在室温孵育 10 分钟以促进退火，随后在 55 °C 进行逆转录反应 10 分钟。
   注意：cDNA 可在 -20 °C 保存长达一年（可暂停点）。
5. 剪接微型基因的扩增：使用针对剪接微型基因的特异性引物序列进行 PCR 扩增（表 2）。采用能够使琼脂糖凝胶上可见条带的最少循环数。
   注意：琼脂糖凝胶上应可见未剪接和剪接产物的混合条带。由于 DNA 物种群体的异质性，条带可能出现弥散现象（图 4A）。
6. 使用纯化柱对 PCR 产物进行纯化，操作同步骤 2.1.2。
7. 连接测序接头：通过最后一轮 PCR 将测序接头序列连接至扩增子末端。在扩增子末端加入 0–3 个随机核苷酸，以确保在 NextSeq 平台上实现均衡的荧光检测（表 1）。
8. 使用纯化柱对 PCR 产物进行纯化，操作同步骤 2.1.2。

4. 扩增子测序与分析

1. 短读长测序：通过核心设施或商业服务，使用Illumina MiSeq、NovaSeq或同等设备对PCR扩增子进行150 bp双端测序。
2. 序列比对：
   1. 构建参考基因组：通过将每个唯一基因型标记为独立染色体，构建一个合成的“参考基因组”。该参考基因组包含扩增子内的合成外显子和内含子。
   2. 比对测序读段：使用HISAT2^22,23将双端读段比对至参考基因组，并调整参数以控制剪接特异性元件（命令行详细信息见补充文件2）。
   3. 筛选高质量读段：将SAM格式转换为BAM格式，筛选高质量读段（比对质量≥60），然后对BAM文件进行排序和索引²⁴（命令行详细信息见补充文件2）。
   4. 识别剪接位点并计算剪接读段数：通过从比对后的BAM文件中的CIGAR字符串提取外显子跳跃事件，量化剪接位点的使用情况。基于“N”操作识别跨越剪接位点的读段，并按剪接位点坐标和链方向汇总读段数，以评估剪接模式（命令行详细信息见补充文件2）。
   5. 分类经典剪接位点：若剪接位点与注释的GT-AG位点匹配，则归类为经典剪接位点。
      注意：在极少数情况下，MaPSy中的参考等位基因可能使用非经典剪接位点。未跨越指定剪接位点位置的读段将保留为未剪接读段。
3. 统计分析以鉴定剪接变异体：将读段分为三类：
   (1) 剪接读段与未剪接读段；
   (2) 所有剪接读段中经典与非经典剪接位点的读段；
   (3) 经典剪接读段与非经典剪接加未剪接读段。
   进行双侧Fisher精确检验，并随后进行错误发现率（FDR）校正（表3），以评估变异对剪接效率和准确性的影晌。
4. 筛选高置信度剪接变异体：将四次重复实验中参考/变异对读段数均超过100且q值小于0.05的结果归类为显著。随后，若候选变异的比值比变化达2倍，且参考或变异等位基因中未剪接和非经典剪接读段比例任一超过>5%，则将其视为高置信度剪接变异体（图4B）。

读段	已剪接	未剪接和/或非经典型
参考序列	a	b
变异序列	c	d

表3：Fisher确切检验的2×2表。

5. 验证

1. 用于验证的微基因剪接：
   1. 寡核苷酸合成与扩增：分别合成选定的 MaPSy 候选序列的 DNA 寡核苷酸（例如，由 Integrated DNA Technologies 合成）。然后，使用设计好的侧翼序列，通过高保真 DNA 聚合酶（表 2）进行 PCR 扩增，将寡核苷酸扩增为双链。
   2. 微基因克隆：用 BbsI 和 SmaI 分别对 PCR 产物和 pGint-CAMTA2 载体进行酶切，并利用 DNA 连接酶将酶切产物连接。
   3. 转染：使用转染试剂将构建好的质粒转染至 HEK293T 细胞，操作参照步骤 3.2.2。
   4. RNA 提取：按照步骤 3.3 所述方法，从转染后的细胞中提取 RNA。
   5. 逆转录：使用随机六聚体引物进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。
   6. 剪接异构体扩增：使用靶向微基因前两个外显子的引物（Lib0F 和 Lib0Rl，表 1，热循环仪设置见 表 2）扩增剪接异构体。通过电泳分离扩增产物，并使用凝胶成像系统进行可视化检测。
   7. 定量分析：使用 ImageJ（美国国立卫生研究院，USA）^25,26 对各剪接异构体的信号强度进行定量。或者，使用 eGENE HDA-GT12 高性能核酸分析仪配合 DNA 筛查试剂盒，对 PCR 产物的强度和分子量进行定量。
   8. 异构体提取与验证：参照步骤 2.3，通过琼脂糖凝胶回收法分离各剪接异构体，并通过核心设施或商业服务对 PCR 产物进行 Sanger 测序，确认剪接结果，评估正常剪接、内含子保留及外显子跳跃等情况。
2. 多外显子剪接微基因：
   1. 在验证 MaPSy 结果后，选择感兴趣的变异体，并从基因组 DNA（gDNA）中克隆三个至五个外显子，以提供更接近基因组环境的剪接缺陷背景。
   2. 使用定点突变引物和重叠 PCR 进行定点突变，构建在目标位点含有特定序列改变的微基因载体。
      注：若侧翼内含子过长而不利于克隆，应保留每个剪接位点两侧约 300 nt 的内含子序列，以确保正确的剪接环境。
   3. 按照上述 5.1 节所述方法进行基于细胞的剪接功能检测。
3. 细胞水平验证：为在细胞中验证剪接效应，应使用基于模板的 CRISPR 编辑技术，在合适的细胞模型中对选定变异的序列进行修饰。
   注：在条件允许的情况下，应使用携带特定变异的人源样本，直接评估其剪接模式。

结果

细胞剪接MaPSy构建体后，剪接产物和未剪接产物以混合物形式同时存在。由于文库存在大小多样性以及可能发生非经典剪接，这两类产物在凝胶电泳中均可能呈现一定程度的弥散。在靶向3'端的构建体中，含有部分腺病毒序列的第二个内含子通常能够非常高效地发生剪接（图4A）。

在MaPSy实验中，大约10-30%的疾病相关变异体会表现出剪接改变，其中大多数显著情况显示出经典剪接效率降低（图4B）。尽管非经典剪接可能轻微改变剪接变异体的分布，但在分析中纳入这些事件对于识别在剪接位点竞争框架下促进非经典剪接位点的变异体至关重要（图4C）。先前一项研究指出，3'剪接位点的选择特别容易受到邻近区域突变竞争的影响¹⁷。

讨论

MaPSy 构建体中的内源性 EGFP 信号可实现基于荧光的外显子跳跃检测。如果中间外显子或内含子序列促进外显子跳跃，则第一和第三外显子的连接将产生可通过 FACS 检测到的 EGFP 信号，这使其成为识别影响外显子跳跃变异体的有价值方法，并有助于基于显微镜观察剪接变异体¹³。然而，本文所述的扩增子测序方法无法捕获外显子跳跃产物，因为这些产物缺乏文库信息，因此不会被测序。因此，我们的方法不能直接鉴定诱导外显子跳跃的变异体。尽管如此，根据先前的研究分析，削弱经典剪接的变异体通常会引发多种非经典剪接事件，包括非经典剪接位点的使用和外显子跳跃^17,27。因此，即使不检测外显子跳跃事件，我们的扩增子测序方法仍能可靠地鉴定剪接变异体。

与基于FACS的检测方法相比，扩增子测序在识别非经典剪接位点使用方面更具稳健性。基于FACS的检测依赖于中间外显子的插入来破坏EGFP的阅读框，因此对剪接信号的细微变化敏感性较低。此外，基于FAC...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Direct-zol RNA MiniPrep Plus 试剂盒	Zymo Research	R2072
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（DMEM）	Thermo Fisher Scientific	11965084
胎牛血清（FBS）	Thermo Fisher Scientific	26140079
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	A2916801
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122
pGint 质粒	Addgene	24217
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	Thermo Fisher Scientific	F530L
QIAquick 凝胶回收试剂盒	Qiagen	28706
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28106
QIAxcel DNA 筛查试剂盒（2400）	Qiagen	929004
SuperScript IV 逆转录酶	Thermo Fisher Scientific	18090010