建立并评估下肢动脉硬化闭塞症糖尿病大鼠模型

摘要

下肢动脉硬化闭塞症是糖尿病常见的并发症。本文介绍一种新型动物模型构建方法，通过向血管内注射乙醇破坏血管结构，模拟动脉粥样硬化闭塞性疾病的进展过程，从而为血管疾病治疗提供新的研究平台。

摘要

本研究旨在建立并验证一种新型的糖尿病大鼠下肢动脉硬化闭塞症（ASO）模型。与传统的股动脉结扎方法不同，我们向髂外动脉内注射95%乙醇（0.1 mL）。术后于第1、3、7和14天通过多普勒超声、热成像及湿肌重量测量评估动脉闭塞和后肢缺血情况。通过对血管和肌肉组织进行组织学分析，评价该模型的成功率与稳定性。高浓度乙醇（95%）可诱导血管内皮细胞损伤，进而导致股动脉闭塞。与对照组相比，多普勒超声显示患肢动脉直径进行性减小，血流速度增加；热成像显示肢体温度降低，肌肉重量测量显示同侧肌肉质量显著减少。组织病理学分析证实存在动脉管腔闭塞、微血管密度下降以及病变随时间推移逐渐加重的现象。综上所述，髂动脉注射95%乙醇可有效模拟下肢动脉闭塞的病理生理特征，为研究糖尿病大鼠动脉硬化闭塞症提供了一种新型模型。

引言

糖尿病下肢动脉闭塞（DLEAO）是糖尿病患者致残和死亡的主要原因，严重影响患者生活质量，并带来重大的社会经济负担¹。糖尿病性动脉疾病的发病机制涉及高血糖、脂质代谢紊乱、慢性炎症和血管功能障碍之间的复杂相互作用²。动物模型在阐明这些机制方面发挥了重要作用，为治疗策略的开发提供了关键见解。动物模型是模拟人类糖尿病患者外周动脉疾病（PAD）病理生理过程的有力工具。这些模型能够实现高通量、可重复的研究，用于探讨疾病进展过程并揭示其潜在机制。此外，利用动物模型开展的临床前试验可为新型治疗方法（包括药物制剂、基因治疗和再生医学手段，如干细胞治疗）提供必要的数据支持³。此类基础研究对于指导后续临床试验、推动转化医学发展至关重要。

目前，股动脉结扎（FAL）方法在实验室中被广泛用于建立大鼠后肢缺血模型⁴。该方法可快速诱导下肢缺血表现⁵；然而，由此产生的动脉血栓形成与糖尿病患者下肢动脉疾病（LEAD）所观察到的病理生理进程不同，后者涉及内皮损伤、炎性因子积聚以及平滑肌细胞增殖^2,6。此外，FAL会迅速触发新生血管形成和侧支血管生成，导致建模后短时间内恢复低流量灌注^5,7，这与糖尿病性LEAD的慢性进展过程形成对比。因此，亟需建立一种能更准确模拟人类动脉粥样硬化病理生理机制的动物模型。

在糖尿病动物模型中，通过球囊导管对股动脉内膜造成机械性损伤或化学诱导（例如氯化铁刺激）可有效触发包括内皮剥脱、炎性细胞浸润以及平滑肌细胞迁移/增殖在内的病理改变⁸。该方法能更好地模拟人类动脉粥样硬化的典型病理特征。与传统的股动脉结扎（FAL）模型相比，乙醇诱导法的核心优势在于其能够更准确地模拟糖尿病下肢动脉疾病（LEAD）复杂的病理生理过程。乙醇可直接破坏血管内皮，激活血小板聚集和血栓形成，从而模拟糖尿病LEAD的初始事件⁹。更重要的是，通过逐步破坏血管微观结构，乙醇诱导法有效避免了FAL模型中常见的快速侧支循环代偿，因而成功复制了糖尿病LEAD典型的慢性低灌注状态¹⁰。相比之下，股动脉结扎诱导的缺血模型存在明显局限性：啮齿类动物（如小鼠、大鼠）由于侧支循环发达，能够迅速代偿急性缺血，导致缺血程度不一致，难以真实再现人类严重肢体缺血（CLI）的病理过程^11,12。此外，人类外周动脉疾病（PAD）主要源于动脉粥样硬化的慢性进展，而股动脉结扎模型代表的是急性缺血事件，两者具有根本不同的病理生理机制¹³。本研究的主要目的是建立并表征一种稳定、长期的糖尿病下肢动脉硬化闭塞症（LEAOD）实验模型，以准确模拟患者疾病的发展进程。乙醇诱导闭塞操作简便，仅需微创注射，降低了技术门槛和动物死亡率。其关键参数易于标准化，确保了高度的可重复性。此外，该方法成本低廉，无需特殊设备，易于在不同实验室间推广。目前，仍缺乏可用于验证新型治疗干预措施的持久性动物模型。

方案

本研究在烟台毓璜顶医院动物伦理委员会批准的方案下进行。研究使用40只雄性Sprague-Dawley大鼠（体重：250–300 g，年龄：6周），在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养。从7周龄开始，大鼠自由摄食高脂高蔗糖饮食¹⁴^,¹⁵ ad libitum，并可自由饮水，持续8周。在饮食干预第4周时，通过链脲佐菌素（STZ）注射诱导糖尿病¹⁶。8周后，在进行后续实验前，确认糖尿病模型成功建立。对14周龄大鼠按照下述方法进行后肢动脉阻塞手术。

1. 糖尿病大鼠后肢闭塞性动脉硬化的手术诱导

1. 按照材料表所列并参照图1所示，准备所有手术器械和材料。
2. 使用麻醉机通过异氟烷（1.5–2.5%）和氧气（O₂，1–2 L/min）对大鼠进行麻醉。全程保持自主呼吸。通过夹趾反射评估麻醉深度，以确保达到外科手术所需的麻醉水平。
3. 将大鼠仰卧位固定于固定平台上。使用脱毛膏和剃刀从腹部至下肢去除毛发。
4. 固定四肢。用酒精对后肢皮肤进行消毒。使用弯钳和剪刀在右侧大腿内侧做一2–3 cm的切口。
   注意：所有手术操作均由经验丰富的外科医生完成，以确保动物模型的一致性和可重复性。
5. 在显微镜下分离周围组织，暴露髂外动脉/静脉和股神经。分离血管和神经。沿髂外动脉追踪至其分叉为浅股动脉和深股动脉处。
6. 使用血管夹夹闭股动脉中段和深股动脉。缓慢向远端髂外动脉注入0.1 mL 95%乙醇。60秒后移除血管夹，通过压迫实现止血。逐层缝合切口。
   注意：注射过程中可见动脉立即变白及同侧足部短暂震颤，证实乙醇已成功注入血管内。
7. 术后无需对患肢进行固定。肌肉注射青霉素钠（400,000 IU）以预防感染。
   注意：在该单侧下肢动脉闭塞模型中，对侧肢体作为对照。闭塞时间自术后24小时开始计算。

2. 下肢温度的测定

1. 麻醉大鼠，并将其仰卧位固定于手术台上。
2. 剃除双侧后肢毛发，并将后肢对称放置。
3. 使用红外热成像系统测量双侧后肢的温度。

3. 动脉直径与血流速度

1. 麻醉大鼠。
2. 准备超声系统和探头。
   1. 按下前面板上的电源按钮，打开超声设备。
   2. 选择高频线阵探头（例如 40 MHz），并将其连接至系统。
   3. 在探头表面涂抹足量的声耦合凝胶。
3. 定位股浅动脉。
   1. 将大鼠仰卧位放置在加热垫上，以维持体温。
   2. 使用电动剪刀剃除双侧大腿内侧区域的毛发，位置约在膝关节上方 1-2 cm 处。
   3. 将探头轻轻垂直置于已剃毛区域的皮肤表面。
   4. 在 B 模式下调整探头位置，以观察到股动脉呈搏动性、无回声的管状结构。
4. 测量动脉直径。
   1. 按下设备或软件界面上的 冻结 按钮，冻结 B 模式图像。
   2. 从屏幕菜单中选择 测量工具。
   3. 使用 游标 功能测量动脉近壁至远壁的内径。
   4. 在同一位置重复测量三次，并记录平均值。
5. 测量血流速度。
   1. 点击 PW 多普勒 图标，切换至 脉冲波多普勒模式。
   2. 将取样门置于动脉管腔中心。
   3. 使用 角度校正工具 将 多普勒角度 调整至 ≤ 60°。
   4. 按下 更新 或 捕获 按钮，记录至少三个心动周期的血流速度波形。
   5. 使用软件的 自动描记功能 计算收缩期峰值速度（PSV）和舒张末期速度（EDV）。
   6. 点击 保存 并导出结果至电子表格文件（例如 CSV、Excel）以保存数据。

4. 肌肉称重

1. 在深度麻醉后，通过颈椎脱位处死大鼠。
2. 从后肢双侧分离腓肠肌，保留跟腱（图2）。
3. 立即将肌肉置于电子天平上测量湿重。
4. 使用对侧肌肉作为对照。
5. 比较四个时间点的测量结果，并以曲线图形式呈现。

5. 组织病理学分析

1. 在四个时间点中的每一个时间点，迅速处死一组大鼠。
2. 立即采集双侧股浅动脉。
3. 用4%多聚甲醛固定动脉组织。
4. 将组织包埋于石蜡中，并切片至5 µm厚度。
5. 进行苏木精-伊红（H&E）染色以观察组织病理学变化。

6. 统计学分析

1. 所有数据均以均值 ± 标准差（SD）表示。当 p 值 <0.05 时，认为差异具有统计学意义。

结果

本研究采用动脉内乙醇注射法在糖尿病SD大鼠（n = 40）中建立模型。根据注射后14天内超声确认对侧动脉直径和血流速度降低的结果，模型建立成功率为85%（33/40）。记录到与模型相关的死亡率为8%（5/40），主要发生在初期阶段。尽管乙醇的细胞毒性可能导致坏疽等非特异性组织损伤，但通过密切监测证实，观察到的动脉直径和血流速度降低是主要的预期效应。尽管各组间重复性良好（组间变异度<15%），但个体间在变化幅度上仍存在明显差异。

下肢温度结果分析
热成像结果显示，与对侧相比，手术侧后肢温度降低。随着时间推移，患肢与健肢之间的温度差异逐渐增大，手术侧温度下降更为明显。肢体温度的降低表明血管灌注不足，无法维持基础体温调节（图3）。该结果进一步证实了动脉闭塞，表明动物模型成功建立。

动脉直径和血流速度
在预定时间点进行动脉直径和血流速度的超声测量（

讨论

综上所述，我们已成功建立了一种渐进性动脉闭塞的大鼠模型，该模型能够很好地模拟糖尿病患者中观察到的临床表现。通过超声测量和肌肉湿重评估，实现了对后肢低灌注状态持续超过两周的一致性评价。股动脉结扎可导致浅表血管闭塞，同时允许血液通过完整的深静脉系统重新循环¹⁷。当结扎部位位于近端动脉或其分支时，侧支血流减少，从而引起严重的缺血表现。然而，即使在不同个体中对同一动脉的相同位置进行结扎，由于个体间侧支血管数量和缺血进展程度存在显著差异，缺血性损伤的程度仍有所不同^18,19。

所观察到的急性缺血与患者疾病的临床进展不一致。股动脉结扎后，缺血后肢的血流显著减少，通常仅达到未结扎侧的25%。连续的激光多普勒成像（LDI）测量显示，缺血区域的血流随时间推移逐渐恢复正常²⁰。事实上，使用酒精溶剂诱导血管内皮硬化和肌肉萎缩，能够很好地模拟临床糖尿病患者下肢血管闭塞的疾病进展过程。这为疾病进展...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GraphPad 版本 8.0.1			RRID:SCR_002798
基于手机的红外测温仪	HIKMICRO		HM-TJP10B-3AMF
Sprague-Dawley 大鼠	济南朋悦实验动物 breeding Co., Ltd.		250 g
超声成像仪	Vevo 2100