快速检测 金黄色葡萄球菌 和耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌 通过多重实时荧光PCR

摘要

本方案采用多重实时荧光定量PCR，引物和探针靶向金黄色葡萄球菌（SA）特异性的nuc基因和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的mecA基因，可实现快速（<1 小时），可定性检测人痰液样本中的SA/MRSA核酸，克服了基于培养方法的局限性。

摘要

Staphylococcus aureus（S. aureus）是一种常见的人类革兰氏阳性病原菌，可引起社区获得性感染和医院内感染，临床表现多样，从局部浅表病变和食物中毒到致命性全身感染不等。抗生素的发现显著降低了其所致疾病的死亡率，但随之而来的耐药性问题日益突出。自1960年首次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）以来，该菌株已成为全球公共卫生的重大威胁。MRSA是医院内感染的主要病原体之一，可导致心内膜炎、慢性骨髓炎、肺炎、化脓性关节炎和菌血症等多种严重疾病。因此，对S. aureus及其耐药性的快速、准确检测对于指导临床治疗至关重要。

当前常规检测方法 S.aureus 以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）存在显著局限性。传统的细菌培养方法作为数十年来的“金标准”，虽可提供明确的菌种鉴定和药物敏感性结果，但耗时较长，通常需要48至72小时。此外，该方法易受污染，且依赖专业的实验室设备和熟练的技术人员。血清学检测通过检测 S.aureus 患者血清中的抗体，但无法区分活动性感染与既往感染，也不能识别耐药菌株（如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA）。

本研究旨在开发一种新型多重实时荧光PCR检测方法，以克服上述局限性。该方法针对金黄色葡萄球菌（S.aureus）的种特异性nuc基因以及介导甲氧西林耐药的mecA基因，设计特异性引物和TaqMan荧光探针，可在同一反应体系中实现对S.aureus和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的同步扩增与检测。该技术显著缩短了检测时间，为S.aureus和MRSA的检测提供了一种快速、准确且经济高效的方法。这一创新策略显著提高了临床诊断效率，有助于尽早实施靶向抗菌治疗，对控制耐药菌感染具有重要意义。

引言

S. aureus 是一种广泛存在的革兰氏阳性条件致病菌，可定植于健康个体的鼻黏膜^1,2。当宿主免疫力受损时，可引起局部皮肤感染、深层组织侵袭或全身性疾病（如肺炎、心内膜炎、骨髓炎和菌血症）³。甲氧西林是一种半合成青霉素，于1959年首次用于临床治疗金黄色葡萄球菌感染，两年后， 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在英国出现，并迅速传播至丹麦、法国和瑞士等欧洲国家⁴。MRSA对β-内酰胺类抗生素的耐药性不仅使临床治疗复杂化，还显著增加了感染风险⁵。多种因素，包括难以控制的定植与传播、高昂的预防成本以及抗生素的过度使用，共同导致MRSA感染率持续上升⁶。由于其传播迅速且耐药机制复杂，MRSA感染具有较高的病死率；据报告，欧盟国家每年约有15万例病例，>7,000例死亡⁷。根据CHINET监测数据，中国MRSA感染率在过去五年中一直保持在30%以上⁸。医院内交叉感染的高风险进一步加重了公共卫生负担，并对医疗系统造成压力^9,10。因此，开发高效、精准的MRSA快速检测技术在临床上极为迫切，有助于实现早期诊断、个体化治疗、降低病死率并阻断传播链。

目前针对S.aureus和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检测技术涵盖多个领域，包括表型检测、基因组检测、转录组检测、蛋白质组检测、质谱技术以及基于生物信息学的分析¹¹。

表型检测方法，如纸片扩散法（KB法）和最低抑菌浓度法（MIC法），被美国临床和实验室标准协会（CLSI）及欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）推荐为"金标准"。这些方法具有无需专用仪器、广泛适用于耐药谱监测和流行病学调查的优点。然而，其缺点也较为明显：培养周期较长（超过24小时），且某些新型抗生素的KB法结果需通过MIC值进行验证，折点菌株的结果易受人为因素影响^12,13。

在基因组水平的检测方法中，常规PCR具有高灵敏度和强特异性的特点，可对耐药性进行初步判断，缩短实验时间，且成本低、效率高。但其局限性在于只能检测已知的耐药基因，且依赖专业仪器¹⁴。微生物耐药机制极为复杂，因此开发能够覆盖未知耐药表型并实现快速鉴定的技术方法至关重要。新兴的GoPhAST-R技术（通过RNA检测实现基因型与表型联合药敏试验）通过检测mRNA表达水平来确定耐药表型，可同时检测多种病原体中不同的耐药相关基因，缩短实验周期，结合机器学习后准确率可达94-99%¹⁵。

在蛋白质组学水平的检测方法中，PBP2a乳胶凝集法基于抗原-抗体的特异性结合，具有操作简便、结果快速的特点，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）具有较高的特异性和敏感性。然而，该方法无法区分不同种类的葡萄球菌，且商用试剂盒的检测灵敏度有所下降，需用苯唑西林诱导后重新检测⁸。

基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的检测方法，例如DOT-MGA（DNA寡核苷酸标签-基因组扩增微阵列检测）方法，在6–8小时的孵育时间内可达到最佳分析性能，检测率高达96.4%，且灵敏度和特异性均达到100%。但该方法成本较高，且目标板上的检测位点有限，难以同时检测数百个样本^16,17。

在结合组学数据用于耐药性预测的生物信息学分析技术中，全基因组测序技术因其高分辨率和全面的信息分析能力而尤为突出。结合Resfinder等耐药基因分析数据库，该技术可分析菌株是否携带特定的耐药基因，预测其耐药潜力，检测单核苷酸多态性（SNPs）及与耐药相关的基因突变，同时支持全基因组数据的存储与再分析¹⁸。然而，该方法需要具备生物信息学背景的专业人员操作，在日常检测中较少使用，通常用于病原体的流行病学分析或分子监测¹⁹。

上述方法要么成本高昂，要么耗时较长，要么仍处于研发阶段。临床上迫切需要一种能够在"即时性"与"准确性"之间取得平衡的解决方案。一种新型多重荧光PCR技术通过在单管中同时扩增nuc/mecA基因，将检测周期压缩至1小时，填补了这一空白。该技术精准弥合了传统"急诊筛查—耐药分型"流程中的时间窗口，为医院感染的预防与控制提供了一种更高效的时间节约型分子诊断工具。该特定PCR检测主要用于呼吸道标本的检测，痰标本即为典型示例。其检测灵敏度达500拷贝/mL，具有高特异性，且不受抗菌药物干扰。由于具备上述优良性能特征，该PCR检测在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的呼吸道感染诊断及医院感染监测中具有重要的应用价值。

方案

本研究经广东省人民医院伦理委员会批准（伦理编号：KY2025-510-01）。有关本研究中所用材料（试剂、化学品、仪器设备和软件）的详细信息见材料表。

1. 标本采集与保存方案

1. 纳入标准：除质控物质外，使用金标准方法（基于培养的检测）将所有采集的样本鉴定为阳性标本。
2. 人痰液样本采集
   1. 使用无菌采样管，从受试者下呼吸道采集1-3 mL深咳痰液。立即密封采样管并运送至实验室进行分析。样本应立即处理并开展检测。
3. 标本储存：
   1. 应尽快分析上述方法采集的样本。在以下条件下允许短期储存：
      2-8 °C：≤7天
      -20 °C ± 5°C：≤6个月
      -70 °C ± 5°C：≤24个月
      注：本研究中，痰液样本未使用任何防腐剂（如BHI肉汤+甘油等）。采集后，样本按照上述条件保存，严格避免反复冻融。允许的最大冻融次数：≤3次。

2. 核酸提取

注意：为避免污染，所有操作均须在生物安全柜内完成。

1. 对于痰液样本预处理，将样本与4% NaOH溶液按1:4的比例（痰液样本:4% NaOH溶液）混合，以液化黏稠的痰液标本并去除干扰性杂质，随后充分涡旋振荡（30秒），并在室温（22–25 °C）孵育30分钟，以完成液化。
2. 核酸提取试剂的准备
   1. 从试剂盒中取出预包装的96孔板。轻轻弹击96孔板，使试剂和磁珠集中至孔板底部。
   2. 小心撕去铝箔封口膜，避免振荡96孔板，以防液体溅出。
   3. 在96孔板的第1列和第7列孔中：先加入20 µL蛋白酶K，再加入200–300 µL待提取样本。
3. 自动化核酸提取（基于磁珠法）
   1. 将已加入样本的预包装96孔板放入自动化核酸提取仪的对应插槽中。
   2. 按照以下所述的核酸提取流程进行操作。
      1. 使用实验舱内的磁棒，将吸附有核酸的磁珠转移至不同的试剂孔中。
      2. 使用搅拌装置快速反复混合液体，使液体与磁珠充分均匀混合。
      3. 随着液体与磁珠的协同结合，自动化核酸提取仪依次完成细胞裂解、核酸吸附（70 °C，15分钟，磁吸附3次）、洗涤（3次，每次混合2分钟，随后进行两次磁吸附，每次15秒）和洗脱（2次，每次混合5分钟，磁吸附3次）等阶段，最终获得高纯度的核酸。
      4. 使用分光光度计检测核酸浓度和纯度。核酸样本体积为50 µL，浓度范围为50–100 ng/µL，A260/A280比值为1.8 ± 0.2。
   3. 程序结束后，直接从第6列和第12列孔中吸取含有核酸的洗脱液用于后续检测。如需长期保存以备后续使用，可将剩余提取的核酸样本储存在-20 °C。

3. qPCR检测 S. aureus 核酸和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸

1. 扩增试剂的制备
   1. 从试剂盒中取出核酸扩增反应液和nuc/mecA反应液（针对金黄色葡萄球菌的nuc基因特异性引物/探针，以及针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因）。在22–25℃解冻后，轻轻混匀，短暂离心后置于冰上待用。  °C，充分振荡并混匀，然后进行瞬时离心（约6000） g，15 秒，22–25 °C。
   2. 根据待检测样本数量 N，按照 N+2 的总量准备试剂（N 为样本数，2 为阴性和阳性质控样本）。具体步骤如下：
      1. 配制反应体系混合液（16 µL 核酸扩增反应液（缓冲液、dNTPs、DNA 聚合酶、UDG 酶）+ 4 µL nuc/mecA 反应液（针对目标检测基因 nuc、mecA 及 GAPDH 内参基因的引物和探针））。
      2. 将其加入适当大小的离心管中，充分振荡混匀，并进行瞬时离心（约6000） g，15 秒，22 °C–25 °C）。然后将 20 µL 分装至每支 PCR 反应管中。
2. 加入核酸和质控样本：
   1. 向上述已准备好的 PCR 反应管（20 µL）中分别加入 5 µL 待测样本、阳性对照和阴性对照的核酸，使每管终体积为 25 µL。
   2. 盖紧管盖并进行瞬时离心（约6000 × g，15 秒，22–25 °C），然后将试管放入 PCR 仪中。
3. PCR扩增：
   1. 设置循环程序如下：预变性：97 °C，90 s，1个循环；随后进行42个循环的以下两步：97 °C 变性2 s，55 °C 退火15 s。
   2. 设定荧光信号检测参数如下：使用FAM荧光标记的 nuc 基因；VIC 荧光标记 mecA 基因；以及使用试剂盒内的GAPDH基因CY5荧光标记作为内参。在55 °C收集数据。反应完成后，确保保存数据以供后续分析。
   3. 使用qPCR专用软件（SLAN 96P）分析数据：
      1. 样品信息：在软件的孔板布局图中，标注各加样位置所对应的样品类型（例如阳性对照、阴性对照、未知样品、内参基因等）。
      2. 放置反应管：打开仪器加热模块的盖子，将密封好的PCR板或反应管平稳放入加热模块内，确保其与加热模块紧密贴合，然后紧紧关闭模块盖子（以避免温度不均）。
      3. 开始反应：确认软件中的程序设置正确后，点击 开始运行 并记录实验编号以供日后参考。
      4. 停止运行并取出管子：程序运行结束后，等待加热模块的温度降至50 °C以下，然后打开盖子取出PCR板或管子，并妥善处理样品。
4. 数据分析
   1. 在数据分析前，确认以下三项视觉结果：1）所有样本（包括内参对照）的扩增曲线呈典型的S形，无平坦或异常延迟上升的曲线；2）荧光阈值线穿过曲线的指数增长期，且内参对照（如GAPDH）的Ct值在≤38个循环范围内（变异系数 < 5%）；3) 在整个实验过程中包含阴性/阳性对照，以监测污染的可能性。
      1. 如果实验失控，需重新检查整批样本。若某样本显示异常扩增（如非典型S形曲线或Ct值处于临界范围内），应重新检测该特定标本。
   2. 在软件中调出实验数据，设置阈值和基线，可选择自动或手动计算Ct值，仪器将自动选定基线阈值。最终阳性判定标准为Ct ≤ 36；内参基因的参考范围要求Ct ≤ 38。确认其扩增曲线呈现典型的S型特征。

结果

使用qPCR检测S. aureus和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）
基于S. aureus的种特异性nuc基因和MRSA的mecA耐药基因，我们设计了带有不同荧光标记的引物和探针用于qPCR检测。qPCR实验过程中所有质量控制结果均持续处于推荐阈值范围内，证实了检测结果的可靠性（图1）。

在本研究中，我们验证了该检测试剂盒的灵敏度（检测限）、精密度以及阳性/阴性符合率。

检测下限（LOD）：为评估试剂盒检测低丰度核酸的能力，对浓度为500拷贝/mL的质控样品进行了8次重复检测。结果显示，nuc基因的Ct值范围为33.56至34.69，mecA基因的Ct值范围为34.33至35.35。所有扩增曲线均呈现典型的S型荧光曲线，符合高效的指数扩增特征，阳性检出率达到100%（图2

讨论

准确且早期检测耐甲氧西林耐药性对于由S. aureus引起的感染的预后至关重要。早期鉴定S. aureus和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）可减少广谱抗生素的滥用，并降低导致细菌耐药性出现和传播的选择性压力。

传统的表型检测方法（如头孢西丁纸片扩散法）需要18-24小时的培养周期，且对异质性耐药菌株的假阴性率较高，难以满足严重感染的快速诊断需求²⁰。实时荧光PCR技术的出现推动了病原体鉴定从依赖表型推断向直接基因型检测的转变。通过高特异性识别靶向核酸序列，该技术可实现耐药基因的快速分型，为临床精准管理提供分子依据。

PCR 技术长期以来已应用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检测，其中多重 PCR 已成为 MRSA 检测的关键方法²¹。Pereira 等人建立了一种用于 MRSA 检测的多重 PCR 方案²²。然而，临床样本中含有蛋白质等杂...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动化核酸提取仪	DAAN	Smart 32	用于DNA提取
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	生物安全柜
E-Centrifuge	WEALTEC		离心去除管壁残留液体
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因检测试剂盒	BOJIE	ZC-HX-38-2	检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因
核酸提取试剂盒	BOJIE	TQ-BG-001-96B	提取核酸
SLAN全自动医用PCR分析系统	HONGSHI		数据分析
SLAN-96S实时荧光定量PCR仪	HONGSHI	SLAN-96S	荧光定量PCR扩增
Thermo Scientific NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop One	对DNA、RNA和蛋白质进行定量分析
超低温冰箱（DW-YL450）	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C用于试剂储存
Vortex-5	Kylin-bell		用于试剂混匀