麝香酮通过靶向IL-1R1抑制NF-κB通路活性减轻雪旺细胞氧化应激损伤的实验研究

摘要

本研究探讨了麝香主要成分麝香酮对雪旺细胞增殖和凋亡的影响。结果初步阐明了麝香通过抑制IL-1R1来降低NF-κB通路活性，从而减轻贝尔麻痹中氧化应激损伤的潜在机制。

摘要

天然麝香治疗贝尔麻痹的潜在机制尚不明确。本研究旨在揭示麝香在治疗周围神经损伤中的可能作用机制 体外. 为此，采用氯化钴（CoCl₂）在施万细胞（SCs）中建立氧化应激损伤模型。₂）。为评估麝香酮（Muscone, Mus）对上述损伤的保护作用并探讨其机制，研究采用了细胞活力检测、siRNA转染、酶联免疫吸附测定（ELISA）、定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、蛋白质印迹（western blotting）、免疫荧光染色以及细胞超微结构分析。结果显示，Mus干预在缺氧条件下增强了施万细胞（SC）的增殖能力及S-100b mRNA表达，同时减少活性氧（ROS）水平并提高超氧化物歧化酶（SOD）含量。Mus通过降低IL-1β和TNF-α水平，改善了缺氧SC中的氧化应激与炎症反应。此外，Mus还调节了与氧代谢、细胞修复及神经代谢相关的关键指标，包括C-JUN和GDNF。定位于SC膜上的IL-1R1在缺氧条件下表达上调，而Mus干预后显著下调。Mus还抑制了NF-κB信号通路组分（IRAK1、IKK、p65、p50）的表达，并增加了IκB-α的表达。关键的是，通过siRNA敲低IL-1R1所获得的效果与Mus处理一致。研究得出结论：Mus通过抑制IL-1R1表达，继而阻断NF-κB通路，减轻缺氧SC中的炎症反应。本研究揭示了IL-1R1在缺氧诱导的SC功能障碍中的作用，同时提示Mus可能成为治疗贝尔麻痹的一种潜在有效药物。

引言

麝香酮（Muscone，Mus）早在1906年即从天然鹿麝香提取物中分离得到¹。麝香是一种珍贵且有效的传统中药（TCM），具有广泛的治疗作用，如消肿、抗炎、复苏和促进血液循环²。含麝香的中药已被用于多种常见疾病的治疗，包括中枢神经系统疾病³、解毒⁴、胃肠道肿瘤⁵、病毒性肝炎⁶和冠心病⁷等。作为麝香中的活性药用成分，麝香酮表现出优异的生物学效应，包括抗炎⁸、抗氧化^8,9、神经损伤修复以及缓解心肌梗死¹⁰等。在作用机制方面，研究表明麝香酮可减少白细胞介素（Interleukin, IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）-α和活性氧（reactive oxygen species, ROS）等炎症因子的释放^1,8，并可调节丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）、活化B细胞核因子κ轻链增强子（Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB）、AKT/雷帕霉素机制靶点（mechanistic target of rapamycin, mTOR）以及CaN/Erk1/2信号通路^1,8,11等。

在中国，根据早期文献记载和临床经验，有报道称一些医生已成功使用天然麝香治疗贝尔麻痹^12,13,14,15。麝香并未被列为诊断与治疗指南中的推荐药物，但在医疗条件欠发达地区，或对某些无法使用糖皮质激素或抗病毒药物的患者而言，麝香可作为另一种优选方案。近年来的文献分析也显示，在已发表的用于治疗周围性面瘫的中药贴敷处方和穴位研究中，麝香是使用频率最高的中药¹⁶。尽管目前已有大量关于麝香的药理学和医学研究，但麝香确切如何治愈贝尔麻痹，以及其潜在的神经化学和细胞生物学机制，仍尚不明确。

贝尔麻痹是一种急性特发性面瘫，由支配所有面部肌肉的周围性面神经功能障碍引起。贝尔麻痹最明显的症状是单侧面部肌肉无力和下垂。尽管贝尔面瘫并不危及生命，但会影响患者的生活质量，甚至引发焦虑和抑郁。尤其令人担忧的是，即使接受适当治疗，仍有高达30%的患者会出现长期后遗症，包括联带运动、挛缩、永久性面肌轻瘫和面部不对称。因此，明确贝尔麻痹的发病机制并降低面瘫风险是我们的主要目标。目前对贝尔麻痹致病机制的认识仍不清晰。近期研究表明，病毒再激活可能是贝尔麻痹的主要病因，这些病毒可导致神经元水肿和炎症，从而诱发贝尔麻痹发作。

基于近期证据，我们提出假设：木犀草素（Mus）通过减轻面神经的氧化应激损伤，缓解贝尔麻痹症状。本研究通过实验证实了Mus的治疗作用，揭示施万细胞（SCs）中白细胞介素-1受体1（IL-1R1）的上调可激活NF-κB通路，导致细胞损伤。关键的是，我们证明Mus通过下调IL-1R1表达抑制NF-κB信号通路。研究结果明确了在氧化应激条件下，施万细胞中IL-1R1上调所发挥的作用。 体外 并将Mus给药定位为一种新的治疗策略。

方案

本实验研究已获得机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号：LL-240077）。

细胞培养与药物干预
大鼠施万细胞（SCs）在施万细胞培养基中进行培养，该培养基包含基础培养基、5% 胎牛血清、1% 施万细胞生长添加剂、1% 青霉素和 1% 链霉素。所有细胞均置于 37 °C、5% CO₂ 的培养环境中。当细胞生长至 70–80% 汇合度时，分为四组（每组 n = 5）：（1）NC 组；（2）NC+CoCl₂ 组；（3）NC+CoCl₂+Mus 组；（4）NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus 组。

氯化钴（CoCl₂）是一种常用于模拟缺氧环境的试剂，可引发类似于缺氧的反应，例如抑制缺氧诱导因子的降解并使其稳定，以及促进HIF-1α蛋白的积累¹⁵。根据Osuru等¹⁷方法的改进，在NC+CoCl₂组和NC+CoCl₂+Mus组中，将施万细胞（SCs）在添加了240 µM CoCl₂的施万细胞培养基中培养8小时，培养条件为37 °C、95%空气和5% CO₂的湿化培养箱（21% O₂）。随后，在Mus处理组中，加入1.25 µg/mL Mus继续干预24小时。同时，在NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus组中，施万细胞首先接受siRNA转染处理24小时，然后继续在含240 µM CoCl₂的培养基中培养8小时，再加入1.25 µg/mL Mus干预24小时，其余条件与前述各组相同。实验流程图见图1。

细胞活力检测
根据制造商说明书，使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测SCs的细胞活力。将密度为5 × 10⁵ 个细胞/孔的培养SCs接种于96孔细胞培养板中，每孔加入100 µL完全培养基，在37 °C、5% CO₂的湿化环境中培养。当细胞融合度达到70–80%时，向每孔加入10 µL CCK-8溶液，并在37 °C孵育1小时。使用酶标仪在450 nm波长下测定96孔板的光密度（OD），并计算细胞活力。实验分为四组：NC组、NC+CoCl₂组、NC+CoCl₂+Mus组以及NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus组。实验结果以空白孔（培养基+CCK-8溶液）进行校正。细胞存活率 = [（实验组 – 空白孔）/（NC组 – 空白孔）] × 100%。

siRNA 转染
转染按照商用产品的制造商说明书进行 体外 使用浓度为 100 ng/μL 的合成 siIL-1R1 双链小干扰 RNA（AUAGUCUUGGAUUUUCUCCAA，GGAGAAAAUCCAAGACUAUGA）作为 siRNA/miRNA 转染试剂µL 培养 24 小时。转染 siIL-1R1 后，于转染 24 小时后通过 RT-qPCR 分析检测 siIL-1R1 的表达水平。¹⁸，且效率必须确保高于80%

酶联免疫吸附测定（ELISA）
收集培养后的上清液，并在分组特定条件下离心（2950 g，20 分钟，25 °C）。根据试剂盒说明书，通过 ELISA 检测细胞外 IL-1β、TNF-α、ROS 和 SOD 的水平。使用酶标仪在 450 nm 处读取最终吸光度值。

RNA 提取与定量实时 PCR（RT-qPCR）
根据制造商说明书，使用 TRizol 试剂从培养的细胞中提取总 RNA。在 PCR 仪上，针对目的基因（IL-1β、TNF-α、S-100b、IL-1R1）使用 SYBR qPCR 混合液进行扩增，反应体系为 20 µL，共 40 个循环。以 β-actin 作为数据归一化参照，并通过熔解曲线分析验证 PCR 的特异性。采用 2^−ΔΔCt 法对五个独立样本（每个样本设三个复孔）的相对表达量进行定量。引物序列见表 1。

蛋白质印迹（Western blot）
处理后，收集各实验组施万细胞（SCs）并培养24小时。使用全蛋白提取试剂盒提取总蛋白。将蛋白裂解液与SDS-PAGE上样缓冲液混合，在98 °C变性5分钟，随后在10–12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离（每泳道20 µg蛋白）。通过电转移将分离的蛋白转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂奶粉在室温下封闭膜60分钟，然后在4 °C下与以下一抗共同孵育过夜，每6 mL抗体溶液中加入相应抗体：抗HIF-1α抗体（1:1000）、抗GAPDH抗体（1:1000）、抗IL-1R1抗体（1:1000）、抗C-JUN抗体（1:1000）、抗GDNF抗体（1:1000）、抗IRAK1抗体（1:1000）、抗IKK抗体（1:1000）、抗p65抗体（1:800）、抗p50抗体（1:900）、抗IκB-α抗体（1:900）以及抗β-actin抗体（1:1000）。洗涤后，在25 °C下用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育60分钟。使用Image Studio Digits Ver 4.0检测蛋白信号，采用ImageJ软件对条带强度进行定量，并以β-actin和GAPDH的表达水平作为归一化对照。所有实验独立重复三次。

免疫荧光
参照 Zhao 等人的方法¹⁹检测 IL-1R1 在 SCs 中的定位。用胰蛋白酶消化收集处于对数生长期的细胞，重悬于新鲜完全培养基中，充分吹打制成均匀的单细胞悬液。将细胞接种至含有无菌盖玻片的培养板中。待细胞完全融合后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1-2次，小心取出盖玻片，用含4%多聚甲醛的PBS固定细胞10分钟，0.05% Triton X-100透膜10分钟，5%山羊血清封闭1小时。一抗孵育使用兔抗大鼠 IL-1R1 单克隆抗体。PBS洗涤后，样本在室温下与FITC标记的山羊抗兔IgG二抗孵育2小时。加入水溶性封片剂封片。使用荧光显微镜观察并定量免疫标记的细胞，激发波长为492 nm，发射波长为520 nm。

超微结构分析
参照 Zhao 等人的方案¹⁹，将施万细胞（SCs）用 2.5% 戊二醛固定，随后在 1% 四氧化锇中于 4°C 下后固定过夜。样品经乙醇/丙酮梯度脱水。超薄切片（80 nm）经醋酸铀和柠檬酸铅染色后，使用透射电子显微镜进行超微结构观察。

有害化学试剂的处置
含有 CoCl₂ 的培养基和溶液应收集至指定的重金属废液容器中。所有接触过上述液体的一次性材料，包括移液枪头、离心管和手套，均属于重金属危险废物，须转移至经相关主管部门批准的有资质危险废物处理公司进行妥善处置。废弃的甲醛溶液应丢弃至专用的醛类废液容器中。使用过的耗材应作为醛类废物收集，并由同一有资质的危险废物处理公司进行处理。

统计学分析
多组间比较采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），并结合 Tukey 事后检验。统计学显著性定义为 P < 0.05。数据以均值 ±± 标准差（SD）表示。

结果

木犀草素对体外雪旺细胞氧化应激损伤的保护作用in vitro
HIF-1α的表达随缺氧环境的变化而发生改变²⁰。为模拟缺氧条件，将雪旺细胞（SCs）暴露于CoCl₂中，通过Western blot检测显示HIF-1α蛋白水平升高——这是典型的缺氧标志物，证实缺氧模型构建成功（图2A）。随后对缺氧SCs进行木犀草素（Mus）干预，以评估其对细胞增殖和应激反应的影响。CCK-8实验结果显示，Mus显著促进了缺氧SCs的增殖（图2B）。为评估再生能力，采用RT-qPCR定量检测再生标志物S-100b mRNA的表达水平。缺氧显著抑制了S-100b的转录，而Mus处理可恢复S-100b的表达水平（图2C）。活性氧（ROS）和超氧化物歧化酶（SOD）被广泛认为是氧化应激现象中的关键组分

讨论

贝尔麻痹是一种特发性周围性面神经麻痹，其特征为单侧面部无力。髓鞘在神经元的有效功能中发挥多种关键作用²³。它可确保神经冲动的顺利传导，通过提供营养因子支持神经元，并参与再生过程²⁴。因此，周围神经系统中髓鞘的丧失可导致脱髓鞘性神经病变，进而引起肌肉萎缩、感觉异常、麻木和瘫痪²⁵。施万细胞（SCs）是周围神经系统的主要胶质细胞，在神经再生过程中起着关键作用²⁶。当神经受损时，施万细胞会发生重编程并转化为特化的“修复型施万细胞”。这些修复型施万细胞负责清除变性的轴突和髓鞘碎片，促进轴突发芽再生，并最终对再生的轴突进行再髓鞘化²⁷。基于这些研究，我们构建了CoCl₂诱导的施万细胞模型，以在细胞水平上模拟贝尔麻痹模型并探索面瘫的发病机制。在建立疾病模型后，我们观察到细胞氧化应激增强以及炎症细胞因子分泌增加，同时伴有IL-1R1表达上调。Mus通过抑制NF-κB信号通路，减轻了细胞损伤，并...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶消化液（不含EDTA）	Servicebio	G4002
10x TBS	Eubiotech	BF0153
10-180 KDPrestained Color Protein Marker	Eubiotech	P0069
5% 脱脂奶粉	Beyotime Biotechnology, China	P0216-300g
抗-C-JUN 抗体	Cell Signaling, USA	#9165T
抗-GAPDH 抗体	abcam, UK	ab245355
抗-GDNF 抗体	Cell Signaling, USA	#47808
抗-HIF-1α 抗体	Cell Signaling, USA	#14179
抗-IKK 抗体	Cell Signaling, USA	#2682
抗-IL-1R1 抗体	Cell Signaling, USA	#6775	用于WB
抗-IL-1R1 抗体	proteintech	84094-6-RR	用于免疫荧光
抗-IRAK1 抗体	Cell Signaling, USA	#4395
抗-IκB-α 抗体	Cell Signaling, USA	#8943
抗-p50 抗体	abcam, UK	ab305263
抗-p65 抗体	abcam, UK	ab16502
抗大鼠 IL-1R1 单克隆抗体	Beyotime Biotechnology, China	AF7212
抗-β-actin 抗体	abcam	ab179467
BCA 蛋白定量试剂盒	Eubiotech	WB2123
细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测试剂	Beyotime Biotechnology, China	C0048M
氯化钴（CoCl2）	Macklin, China	C804815
EuECL Star	Eubiotech	WB2131
胎牛血清（FBS）	Bergolin,China	PWL001
Fitc标记的山羊抗兔IgG	Servicebio	GB22303
荧光显微镜	Nikon
Hieff Trans 体外 siRNA/miRNA 转染试剂	YEASEN, China	40806ES01
辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗 HRP标记的山羊抗小鼠IgG	Servicebio, China	GB23301
IL-1β、TNF-α、ROS 和 SOD ELISA 试剂盒	BOSTER, China	BES1762K, BES0481K, BES5018K, BES2920K
麝香酮（Mus）	Aladdin, China	M141496
PBS 缓冲液	Servicebio	G4202
青霉素-链霉素溶液，100x	Procell	PB180120
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜	Millipore, USA	IPFL00010
大鼠雪旺细胞（SCs）	Procell Life Science & Technology China	CM-M111
RIPA 裂解缓冲液	Eubiotech	WB2116
雪旺细胞培养基	ScienCell, USA	1701
SDS-PAGE 上样缓冲液	Beyotime Biotechnology, China	P0015
SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，5x	Eubiotech	WB2122
si-IL-1R1	Gene Universal	RX0114371
SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒	Eubiotech	WB2118
SYBR qPCR Mix	Beyotime Biotechnology, China	D7260
总蛋白提取试剂盒	Beyotime Biotechnology, China	PP123-01
透射电子显微镜	Hitachi	HT7800
Trizol	Beyotime Biotechnology, China	R0011
Tween-20	Eubiotech	WB2114
水溶性封片剂	Absin, China	abs9240
转膜缓冲液	Eubiotech	WB2129