使用选择性鼻部轻 flick 以遗忘 REM 的方法（SNiFFer）进行选择性快速眼动睡眠剥夺

摘要

我们提出了一种针对啮齿类动物快速眼动（REM）睡眠进行选择性剥夺的新型实验方案。

摘要

睡眠 broadly 分为快速眼动（REM）和非快速眼动（non-REM）阶段，已有多种睡眠剥夺技术被开发用于研究这些阶段的功能。传统方法——例如机械刺激或在 REM 睡眠期间使动物跌落——常导致快速的习惯化和非预期的应激效应，使结果解释变得困难。本文中，我们介绍一种新颖、温和且轻柔的啮齿类动物 REM 睡眠剥夺方法：SNiFFer。已知啮齿类动物对鼻部刺激高度敏感。该方法在动物进入 REM 睡眠时，使用柔软的画笔轻拂其鼻部，可靠地诱发觉醒。为实现仅在 REM 睡眠期间选择性施加该干预，我们采用了一种基于人工智能的实时脑电图（Electroencephalography, EEG）睡眠阶段分类系统。干预仅在 REM 睡眠事件期间触发，并设置了一组配对对照组，该组接受与实验组完全相同的刺激模式，但不受睡眠状态限制。我们进一步将 SNiFFer 应用于痕迹性恐惧条件反射（Trace Fear Conditioning）范式中，以检验学习后6小时内 REM 睡眠剥夺是否干扰记忆巩固。与配对对照组相比，接受 SNiFFer 处理的动物表现出 REM 睡眠事件总数和单次 REM 睡眠持续时间的显著减少，表明该方法具有高度特异性和有效性。综上所述，SNiFFer 技术为小鼠提供了一种高度选择性、微创的触觉性 REM 睡眠剥夺手段。该方法实现了对实验条件的精确控制，为探究 REM 睡眠在记忆与认知中的作用开辟了新的可能性——并带有一丝“挠痒般”的巧妙设计。

引言

快速眼动（REM）睡眠在记忆巩固等认知过程中发挥着关键作用^1,2。为了研究REM睡眠在大脑中的功能意义，通常采用REM睡眠剥夺作为实验手段。目前，广泛用于在啮齿类动物中诱导REM睡眠剥夺的方法主要有四种：旋转圆盘法¹、花盆法³、气流刺激法⁴和物理刺激技术^5,6。尽管旋转圆盘法和花盆法在消除REM睡眠方面非常有效，但它们常常给动物带来显著的应激反应，例如接触水环境或身体疲劳⁷，这可能干扰对行为和生理结果的解释。同样，气流刺激法和传统的物理刺激方法往往向身体施加广泛且非特异性的刺激，导致刺激强度的变异性以及对照组选择的局限性^4,8。

我们对跨越六十多年的快速眼动（REM）睡眠剥夺研究进行了全面的文献比较，相关内容见补充文件1和补充表1。我们纳入了主要研究脉络中的基础性历史研究以及机制、神经化学、激素和行为学研究，包括Jouvet、Rechtschaffen、Bergmann、Tufik、Andersen和Borbély等团队的工作。补充表1按时间顺序整理了关键文献，追溯了REM睡眠剥夺技术的方法学演变，并总结了其在生物学、神经化学、激素、免疫、体温调节及行为学方面的主要发现。由于本文稿的结构为方法学文章而非全面的历史综述，因此该部分内容作为补充信息提供。

为解决这些局限性，我们开发了一种新型方法，可实现对快速眼动（REM）睡眠的高度选择性剥夺。该技术旨在以精确可控的方式选择性剥夺啮齿类动物的REM睡眠。在此方法中，我们将刺激局限于动物的鼻部——这是啮齿类动物最敏感的区域之一⁹。此外，我们采用基于人工智能的实时睡眠阶段分类系统，以实现对REM睡眠事件的特异性时间检测与中断¹⁰。该AI系统参考单通道脑电图（EEG）信号最近4秒时间段的数据，评估当前小鼠的睡眠阶段。该设置还支持配对对照组的实施，从而实现时间匹配的干预。尽管该方法归类为基于物理刺激的REM睡眠剥夺技术，但与传统方法存在差异。首先，我们应用基于AI的实时睡眠阶段分析，以实现准确且一致的REM睡眠特异性干预；其次，刺激区域仅限于鼻尖部位——这是小鼠最敏感的区域之一⁶，从而显著减少刺激持续时间和强度的变异；最后，我们新设立了配对对照组，使其接受与实验组相同数量的刺激，以控制混杂因素。本方案提出了一种研究REM睡眠特有功能的方法。

为了评估该方法的实用性，我们将其应用于研究REM睡眠在痕迹性恐惧记忆巩固中的作用。先前的研究报道，REM睡眠剥夺会损害依赖海马体的恐惧记忆巩固过程，包括延迟性恐惧记忆^11,12。然而，关于REM睡眠剥夺对涉及广泛分布且复杂的脑环路的记忆过程的影响，目前仍存在相互矛盾的证据^5,13。痕迹性恐惧记忆的巩固需要将足底电击（非条件刺激）、听觉线索（条件刺激）以及二者之间的痕迹间隔关联起来——这一过程已知会招募多个脑区，包括海马体、内侧前额叶皮层和杏仁核¹⁴。因此，我们在小鼠完成痕迹性恐惧条件反射后立即剥夺其REM睡眠6小时¹⁵，该时间段被认为是记忆巩固的关键窗口期¹⁶。利用该实验方案，我们评估了REM睡眠剥夺对依赖于广泛分布神经系统的协同活动的记忆痕迹巩固的影响。本文介绍了一种新颖的方法，详细描述了用于检测这些效应的实验操作流程。

方案

所有动物实验均经中国台湾筑波大学机构动物护理与使用委员会批准。本研究使用雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠（11–13 周龄，20–35 g）。本研究中使用的所有材料与仪器的完整清单见材料表。

1. 脑电图电极的手术植入¹⁷

1. 麻醉与动物准备
   1. 使用4%异氟烷与空气混合，3分钟内诱导麻醉。通过足底回缩反射消失、肌张力降低以及呼吸节律稳定来确认麻醉效果充分。
   2. 使用电动剃须刀剃除从颈背部至两眼之间区域的毛发。当小鼠出现觉醒迹象 （如胡须 运动）时，应再次进行麻醉。
2. 头部固定与颅骨暴露
   1. 将动物固定于立体定位仪中，确保鼻部与颅骨对齐。自此时刻起至整个手术结束，通过异氟烷挥发罐泵系统持续维持麻醉状态。
   2. 在双眼涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。使用脱毛膏清除残留毛发。
   3. 沿中线做头皮切口，轻柔牵拉皮肤，暴露从耳后线至眼前线的颅骨区域。用棉签清除黏膜组织。
3. 解剖标志识别与调平
   1. 识别前囟与后囟；调整立体定位臂，使这两点处于±0.05 mm范围内的水平位置。验证距前囟±3.0 mm的侧向坐标也处于水平状态（±0.05 mm）。
4. 钻孔与螺钉放置
   1. 以前囟为参考点标记以下坐标，并在这些位置钻四个引导孔。前后/内外：+1.5 mm / ±1.5 mm，–3.0 mm / ±1.7 mm。
   2. 将脑电图记录螺钉植入各孔中，并用氰基丙烯酸酯凝胶粘合剂固定。用一层薄的牙科水泥包裹并覆盖暴露的颅骨及导线。
5. 术后护理
   1. 给予0.5 mL的5%葡萄糖溶液和0.13 mL布洛芬（或等效镇痛药）。
   2. 将小鼠放回其居住笼中，该笼为圆柱形聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）笼（直径21.9 cm，高31.6 cm），置于隔热舱（45.7 × 50.8 × 85.4 cm）内。舱内环境维持在温度23.5 ± 2.0 °C、相对湿度50.0% ± 10.0%，并保持12小时光照/12小时黑暗循环（光照时段：上午9:00至晚上9:00）。
   3. 将动物置于加温的恢复笼中。在笼前等待直至小鼠苏醒。手术后，动物均单独饲养，在整个实验期间不再合笼饲养。

2. 操作与适应

1. 实验时间安排
   1. 术后24–48小时内的光照期开始操作，持续连续四天。
2. 手术操作步骤
   1. 第1天，将小鼠置于手心，每次2分钟，重复2次。将小鼠放在实验者伸展手指、掌心向上的手掌上，手掌位置略高于前臂，因为小鼠通常会自然地向较高处攀爬。允许小鼠自由活动，不要限制其行动；如果小鼠试图爬到前臂上，可轻轻握住其尾根部，将其轻柔地放回手掌。每次操作间隔超过20分钟。该操作应在光照期进行。
      注意：如果小鼠从手上跳下或咬手，仅在第1天可用布料或纸巾覆盖手部。布料可重复使用，应每两周清洗一次。
   2. 第2–4天，将小鼠置于手心，每次2分钟，重复3次。每次操作间隔及操作时间段与第1天相同。通过行为评估适应情况：未适应的小鼠通常会试图跳跃逃脱或用力咬手，而已适应的小鼠则会主动探索手掌，极少尝试逃脱，且几乎不出现用力咬合行为。
   3. 最后一次操作结束时，将小鼠连接至脑电图（EEG）记录电缆。
      注意：若垫料过多阻碍小鼠鼻部，可在操作过程中或连接电缆时手动取出部分垫料并清除。

3. 基线脑电图记录

1. 从术后第5天和第6天开始。每天从11:00至17:00记录连续脑电图。若垫料阻碍对小鼠鼻部的接触，应逐步移除多余垫料，以确保鼻部接触通畅，同时尽量减少对动物的干扰，以便后续操作。

4. 恐惧条件反射^18,19

1. 于术后第7天（或第8天）上午10:00至11:00之间开始。作为准备，将70%乙醇喷洒入条件化室（30 x 25 x 24 cm），该室由透明丙烯酸壁和不锈钢网格地板（直径2.0 mm的金属杆，间距6.0 mm）构成。
2. 训练方案（总时长1,100 s）
   1. 在180 s、400 s、620 s、840 s和1060 s时给予5次听觉刺激（20 s上升音，5–20 kHz，1.25 Hz，持续0.8 s）。在218 s、438 s、658 s、878 s和1098 s时，将每次声音刺激与足底电刺激（1.0 mA，2 s）配对给予。

5. 快速眼动睡眠剥夺

1. 快速眼动睡眠剥夺组（RSD组）
   1. 在恐惧条件反射训练结束后立即（ZT2-ZT8），通过启动基于人工智能的睡眠阶段分类系统，实时监测脑电图（EEG），以实现对快速眼动睡眠（REM睡眠）的实时检测。一旦检测到REM睡眠，即用柔软的画笔轻轻搔动动物鼻部，直至其重新觉醒，刺激开始至觉醒的平均潜伏期为0.89 ± 0.063 s（均值 ± 标准误）。
   2. 实验过程中，觉醒定义为对触觉刺激的行为反应，具体表现为刺激后出现胡须运动。记录每次搔动的时间戳，用于后续分析。
      注意：搔动操作不采用固定的移动方向（例如来回、向上或环形），但需保持轻柔且一致的触觉刺激，仅限于鼻尖区域。若鼻部被遮挡，可将刺激直接施加于通常暴露在外的动须（胡须）区域。若小鼠背向画笔，可按需旋转笼子，以确保鼻区无障碍接触。当使用顶部开放的笼子时，也可从上方进行刺激，以确保持续接触鼻部或动须区域。
2. 配对对照组（Yoked组）
   1. 将每只配对小鼠与一只经历REM睡眠剥夺的小鼠配对。在与其配对小鼠发生REM睡眠事件的同时，对配对小鼠实施同步的鼻部搔动刺激，确保刺激的起始时间和持续时间一致。每只小鼠在整个REM睡眠剥夺实验期间使用同一支专用画笔。每次使用后，用弱酸性水喷洒画笔，并用纸巾擦拭。两次使用之间至少间隔24小时，以确保清洁后的画笔完全干燥。

6. 记忆回忆测试

1. 情境回忆测试（测试 A）
   1. 在睡眠剥夺后 24 小时（±3 小时）开始。将小鼠放回原始的条件化箱（带有 70% 乙醇气味），记录 5 分钟的僵直行为。
2. 声音提示回忆测试（测试 B）
   1. 在测试 A 结束后 3 小时进行该实验。
   2. 环境准备：在环境 B 中喷洒水雾（环境 B 为一个高 30 cm 的三棱柱结构，由三面墙组成，边长分别为 31 cm、24 cm 和 24 cm；其中两面墙覆盖白色纸张，第三面为透明亚克力材质，其后可见一个蓝色矩形。该结构具有塑料底面和透明亚克力顶盖）。
   3. 记录 6 分钟的僵直行为，并在第 180 秒时给予一次持续 180 秒的听觉刺激，该刺激与训练期间使用的完全相同。

7. 数据分析

1. 睡眠阶段评分（图1C-G）¹⁷
   1. 针对每个清醒/NREM/REM阶段，基于人工专家评分数据计算总时长、发作次数、平均发作持续时间以及睡眠转换次数。各阶段判断标准如下：
      清醒：低振幅、高频率（β/γ）
      NREM：高振幅、低频率（δ）
      REM：低振幅、以theta波为主
2. 剥夺质量评估（图1B）
   1. 通过将每次搔痒刺激的时间戳与经人工专家标注的脑电图（EEG）数据进行比对，评估刺激施加时所处的睡眠阶段。
3. 僵直行为分析（图1H，J-K）
   1. 使用FreezeFrame4（Actimetrics）量化恐惧条件化及回忆测试期间的静止不动行为（排除呼吸运动）。
      1. 启动FreezeFrame 4软件并选择Recorder模式。从文件菜单（左上角）指定用于保存录制文件的目标文件夹。在左侧面板的四个白色输入框中，输入对应每只小鼠的唯一标识符，确保其与屏幕右侧的四个文件显示窗口一一对应。
      2. 点击界面底部的Protocol面板，根据实验设计设定录制参数，包括总录制时长、听觉提示和足底电击的时间点。
      3. 点击屏幕中央的Reference以获取背景参考图像。将小鼠放入条件化箱后，点击Start开始录制。
4. 辨别指数分析（图1L）
   1. 按以下公式计算辨别指数：
      （测试A中5分钟平均僵直时间 - 测试B中前3分钟平均僵直时间）/ max（测试A中5分钟平均僵直时间，测试B中前3分钟平均僵直时间）。
5. 电击反应性指数分析（图1I）
   1. 手动追踪动物在恐惧条件化过程中电击起始点前后2秒内的二维运动轨迹。按以下公式计算电击反应性指数：
      ​（电击期间运动量 - 电击前运动量）/（电击期间运动量 + 电击前运动量）

结果

脑电图电极的手术植入
小鼠在手术过程中应处于完全麻醉状态。如果出现麻醉失败的迹象（例如挣扎），应将其退出实验程序。同样，如果出血持续超过10秒，可能会对小鼠大脑造成严重损伤，建议将其排除在实验之外。手术后，大多数小鼠通常在1小时内苏醒，其步态和眼球运动应恢复至与术前相似的正常状态。

操作与适应
如果小鼠在操作过程中表现出癫痫或疼痛的迹象，应将其从实验中移除。在适应过程中，小鼠被握住时通常会变得不那么僵硬。这一适应过程通常在第2次^nd 天或第3天开始^rd 天。连接脑电图（EEG）电缆时，用柔软的布轻轻覆盖小鼠的眼睛，以保持其安静并减少活动（补充图1如果事先进行了适当的处理，小鼠在你调整其头部固定针以连接线缆时，通常会保持静止。

基线脑电图记录
每只小鼠在6小时记录期间的快速眼动睡眠（REM）总时长应超过15分钟。至少一侧记录的脑...

讨论

本方案可实现对小鼠进行选择性快速眼动（REM）睡眠剥夺，同时设置配对对照小鼠。与传统的平台法（flowerpot）和旋转圆盘法等方法不同，该系统能够建立精细匹配的对照组，使动物在相同的昼夜节律时间接受完全相同的刺激。此外，该方法最大限度地减少了刺激部位的变异性，克服了传统轻柔干预和气流刺激方法中常见的局限性。因此，该技术可能有助于更精确地分离出REM睡眠的功能。

本方案中的一个关键步骤是在快速眼动（REM）睡眠剥夺期间对鼻部进行精确且轻柔的刺激。若对其他身体部位施加刺激，则可能引入刺激效应的变异性。此外，非特异性或过度的刺激可能诱发急性应激反应，从而影响后续行为学评估结果的可靠性。

另一个需要考虑的因素是所使用的垫料量。过多的垫料可能会遮挡实验动物的鼻部，从而干扰刺激的递送。如果发现小鼠的鼻部似乎被遮挡，应在适应期和基线记录期间逐步减少垫料的用量。最后，如图1C、G所示，一些小鼠表现出相对较高或较低的快速眼动（REM）睡眠量。这种个体...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5%葡萄糖	Otsukba	35061410
6针插头	Hirose	172-0989
粘附剂	小西	16351
麻醉机	Shinano Seisakusho	SN-487-0T
压接外壳	Hirose	688-9095
压接插孔	Hirose	688-8982
Freezeflame4	Med Associates	RRID:SCR_014429	版本 4.104
GraphPad Prism	GraphPad	RRID:SCR_002798	版本 10.5.0
布洛芬	东京化学工业	I0415
异氟烷	Viatris	901036504
Loctite454	亨克尔	UFI:  MAK2-7WRP-G202-F235
小鼠（C57BL/6J）	杰克逊实验室	RRID: IMSR_JAX:000664	恐惧条件反射实验时 11.0 - 13.0 周龄
画笔	Namurataiseidou	4943668000448	SDflat 编号8，尖端长度：8.2 mm；宽度：18.8 mm
液体培养基	Shofu	21400BZZ00451000	250 mL
普维尼粉	Shofu	21400BZZ00451000	250 g
SleepSignRecorder	KISSEI COMTEC	RRID:SCR_018200	版本 1.2.10
不锈钢螺钉	山崎	N/A	φ1.0 × 2.0
标准立体定位仪	ALA Scientific	68038
葵花籽油	Sigma-Aldrich	S5007-250ML
白色凡士林	泰阳制药	K09-TS