基于CYP2C19基因型指导的丁苯酞治疗急性脑梗死患者的预后分析

摘要

本文描述了一项研究，旨在评估基于CYP2C19基因型指导的丁苯酞治疗在急性脑梗死中的预后价值，结果显示弱代谢者预后较差，且同型半胱氨酸（Hcy）、美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分及CYP2C19基因型是预后的独立预测因子。

摘要

基于细胞色素P450 2C19（CYP2C19）基因型探讨丁基苯酞治疗急性期脑梗死患者的预后情况。回顾性纳入我院2022年1月至2025年1月期间接受丁基苯酞治疗的急性脑梗死患者共175例。根据治疗后3个月的改良Rankin量表（mRS）评分，将患者分为预后良好组（mRS ≤2）和预后不良组（mRS ≥3）。分析CYP2C19基因型及代谢表型，比较两组间的临床资料和基因型分布，并采用逻辑回归分析识别影响预后的独立因素。中间代谢型患者比例最高（46.29%），而弱代谢型患者最少（12.00%）。与预后良好组相比，预后不良组中高血压患病率显著更高（P <0.05），血清同型半胱氨酸（Hcy）水平升高（P <0.05），以及基线美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分更高（P <0.05）。在预后不良组中，弱代谢型（CYP2C19*2/*2、*2/*3、*3/*3）占比更高，而快速代谢型（CYP2C19*1/*1）在预后良好组中更为常见（P <0.05）。在调整协变量后，逻辑回归分析确定了三个独立的预后不良预测因子：Hcy水平升高（比值比（OR）= 2.255；95% CI：1.404–3.622；P < 0.001），基线NIHSS评分较高（OR = 3.127；95% CI：1.508–6.482；P = 0.002），以及CYP2C19弱代谢型状态（OR = 4.559；95% CI：2.392–8.688；P < 0.001）。Hcy水平升高、NIHSS评分增加以及CYP2C19弱代谢型表型是丁基苯酞治疗急性脑梗死患者的重要预后影响因素。携带弱代谢型基因型的患者预后较差，提示需制定个体化治疗策略以优化临床结局。

引言

急性脑梗死占所有卒中病例的80%以上，是一种具有高死亡率、高致残率和高复发率的重要全球健康负担。作为全球第二大死亡原因，它通过长期的神经功能损害和功能依赖对社会经济造成严重影响¹。治疗干预的紧迫性体现在“时间就是大脑”"time-is-brain"这一概念中——在未经治疗的缺血过程中，每分钟约有190万个神经元死亡²。

在此临床背景下，丁基苯酞（dl-3-正丁基苯酞）已在中国成为一线神经保护剂，显示出多模式疗效，可改善脑微循环、减轻氧化应激并缓解神经元凋亡³。然而，治疗反应仍存在显著的个体间差异，12%–18%的患者临床获益有限或出现不良事件，包括肝毒性及神经系统恶化⁴。这种异质性凸显了个体化治疗策略的迫切需求。药物基因组学进展已明确细胞色素P450酶（尤其是CYP2C19）在药物代谢和疗效中的关键作用⁵。CYP2C19多态性显著影响神经活性药物的药代动力学，其对卒中预防中氯吡格雷反应性的影响已有充分证据。超过40%的亚洲人群携带功能缺失等位基因（*2、*3），表现为弱代谢表型，导致药物暴露量和临床结局发生改变。值得注意的是，尽管CYP2C19基因分型已彻底改变了抗血小板治疗⁶，但其在指导神经保护剂治疗方案中的作用尚未被探索。丁基苯酞经由CYP450同工酶介导的复杂肝脏代谢过程，但CYP2C19变异对其治疗效果的预后意义尚不明确。与需经CYP2C19介导活化的前体药物氯吡格雷不同，丁基苯酞的代谢途径及其CYP2C19在其中的处置与疗效作用尚未完全阐明。这一差异突显了本研究的创新之处：即超越抗血小板药物基因组学的既定范式，进入神经保护剂个体化治疗这一新兴领域。这一知识空白阻碍了精准医学在急性卒中治疗中的实施。因此，本研究旨在探讨CYP2C19基因多态性与接受丁基苯酞治疗的急性脑梗死患者3个月功能预后之间的关联。通过整合基因型数据与已确立的预后标志物，我们力求建立一个药物基因组学框架，以优化该人群的神经保护治疗，从而将卒中药物基因组学的应用范围扩展至抗血小板药物之外。

本研究是首批探讨CYP2C19药物基因组学对丁苯酞单药治疗结局影响的研究之一。研究结果揭示了弱代谢表型与较差的功能恢复之间存在显著关联，为个体化神经保护策略提供了依据。

方案

本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并获得惠州市中心人民医院机构伦理委员会的批准（批准号：2022-015）。由于本研究为回顾性设计，未注册为临床试验。鉴于分析的回顾性性质，知情同意被豁免，所有患者数据均去标识化处理。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 研究设计与患者选择

作为一项回顾性多中心研究，我们承认可能存在选择偏倚。为减轻这一偏倚，各参与中心均根据前瞻性卒中登记库采用连续入组方案来识别患者。在研究期间（2022年1月至2025年1月）所有就诊的急性脑梗死患者均被筛查其入组资格，符合纳入标准的患者被依次纳入研究。数据来自三家机构：绍兴上虞人民医院、邵逸夫医院和惠州中心人民医院。所有参与中心之间均建立了数据共享协议，以确保适当的监督和数据访问。

对于缺失数据的处理，对缺失比例小于<5%的变量采用基于链式方程的多重插补法。对于缺失数据比例大于>5%的变量，则采用完整病例分析法，并对缺失模式进行透明报告。关键变量（包括CYP2C19基因型、基线NIHSS评分和3个月mRS评分）在所有研究对象中均无缺失。通过在统计模型中对已知的预后因素（如年龄、基线卒中严重程度、血管危险因素和合并用药）进行多变量调整，以控制潜在的混杂因素。具体而言，在分析中收集了合并用药（抗血小板药物、他汀类药物、降压药）的数据并进行了调整。

1. 纳入标准
   纳入标准如下：（1）根据《中国急性缺血性脑卒中诊断和治疗指南》的影像学和临床标准确诊为急性脑梗死；（2）首次发病，发病至入院时间<72 小时；（3）入院后24小时内开始服用丁苯酞（每粒0.1 g），每次0.2 g，每日三次，空腹服用；（4）既往未接受溶栓或抗凝治疗。
2. 排除标准
   排除标准如下：（1）合并精神疾病或认知功能障碍；（2）严重肝、肾或心脏功能不全；（3）对研究药物过敏；（4）患有全身性炎症或自身免疫性疾病。根据发病3个月时的改良Rankin量表（mRS）评分，将患者分为预后良好组（mRS ≤2）和预后不良组（mRS ≥3）⁷。患者纳入流程见图1。
   ​通过住院期间直接观察用药、随访期间核对药片数量和用药日记、每两周一次的结构化电话访谈评估依从性和不良反应，以及审查门诊患者的药房续药记录，来监测患者对丁苯酞治疗的依从性。依从性低于<80%的患者被排除在分析之外（n=7）。选择3个月随访终点是基于既定的卒中结局研究标准，因为卒中后90天的mRS评分被广泛接受为主要终点指标，能够反映关键的恢复期。

2. 临床数据收集

采用电子病例报告表系统性地收集数据，涵盖五个领域：人口学特征（年龄、性别、体重指数，表1）、血管危险因素（高血压、糖尿病、吸烟史、饮酒史）、临床表现（梗死部位、基线NIHSS评分）、实验室参数以及治疗细节。血液生物标志物的检测方法如下：

1. 血脂谱（TC、TG、LDL-C、HDL-C）
   使用全自动生化分析仪进行检测，TC 的检测范围为 0–20 mmol/L，TG 为 0–10 mmol/L，LDL-C 为 0–15 mmol/L，HDL-C 为 0.5–2.0 mmol/L。
2. 血清同型半胱氨酸（Hcy）
   ​采用 ELISA 法测定（检测范围 5–50 µmol/L，变异系数 <5%）。样本采集后 2 小时内储存于 -80 °C，以避免降解。

3. CYP2C19 基因分型

1. 样本采集与DNA提取
   清晨从肘正中静脉采集空腹静脉血（5 mL）。室温静置30 min凝固后，样品在1,600 × g 在4 °C下使用高速离心机离心10分钟以分离血清。按照制造商说明书，从300 µL血清中提取基因组DNA。简言之，将样本与300 µL裂解缓冲液在56 °C孵育10分钟，随后加入100 µL无水乙醇。将混合液转移至纯化柱中，在12,000 × g 室温下孵育1分钟。加入500 µL洗涤缓冲液洗涤两次后，用50 µL预热（70 °C）的洗脱缓冲液洗脱DNA，每次洗涤均以12,000 × g 每次洗涤后孵育1分钟。使用分光光度计将最终DNA浓度调整为50–100 ng/µL，并于-20 °C保存。
2. 实时荧光定量 PCR 基因分型
   CYP2C19 基因分型检测已进行 通过 实时荧光定量PCR。20 µL反应体系包含10 µL 2× TaqMan Master Mix、1 µL引物-探针混合液、2 µL DNA模板和7 µL无核酸酶水。扩增程序设置如下：95 °C预变性30 s，随后进行40个循环，每个循环为95 °C变性5 s，60 °C退火/延伸34 s。荧光信号在退火/延伸阶段采集。
3. 基因型确认与质量控制
   基因分型结果通过第二代Hi-SNP测序（覆盖深度100×）进行验证。对于不一致的结果（n=3），采用限制性片段长度多态性分析作为备用方法：将20 µL PCR产物与1 µL HpyCH4V限制性内切酶及4 µL相应缓冲液在37 °C下孵育1小时，随后进行分离 通过 100 V 条件下进行 2% 琼脂糖凝胶电泳 45 分钟。
   实施了严格的质量控制措施。所有样本均进行双份处理，并采用盲法重复检测；每次PCR运行均包含内部对照（已知基因型）；实时PCR与Hi-SNP测序结果的一致性为100%；随机选取的样本（10%）送至独立实验室进行验证，结果一致性达100%；基因分型检出率超过99.5%，最低基因型质量评分达Q30。
4. 代谢表型分类
   ​代谢表型根据CYP2C19基因型分为以下类别：弱代谢者（*2/*2、*2/*3、*3/*3）；中间代谢者（*3/*17、*2/*17、*1/*2、*1/*3）；快代谢者（*1/*1）。该三级分类方案与地区临床实验室实践保持一致。*17等位基因的频率以及中间代谢者组内基因型的分布详见结果部分。

4. 统计学分析

统计分析使用 SPSS 25.0 版本进行。分类数据以 [n (%)] 表示，并进行比较 通过 χ² 检验（小样本采用耶茨校正）。连续变量的正态性通过Shapiro-Wilk检验进行评估；符合正态分布的数据以均值±标准差表示，采用独立样本t检验进行分析，非正态分布数据则采用Mann-Whitney U检验进行分析。
使用容差（≥0.1）和方差膨胀因子（VIF）评估多重共线性 <10). 采用逻辑回归分析（在 SPSS 中通过“分析 → 回归 → 二元 Logistic”菜单路径）识别独立预后因素，进入和剔除变量的检验水准分别设定为 P <0.05 和 P >分别为0.10。纳入模型的变量包括同型半胱氨酸水平（连续变量）、基线NIHSS评分（连续变量）、高血压（分类变量）以及CYP2C19代谢表型（分类变量，以快代谢型为参照）。采用Hosmer-Lemeshow拟合优度检验评估模型校准情况。双侧P <0.05 被认为具有统计学显著性。
效应量的计算方法如下：对于连续变量，采用 Cohen's d，使用 分析 < 比较均值独立样本t检验功能 启用额外的效应量计算；对于分类变量，phi 系数由 χ² 测试输出条件下 分析 描述性统计学交叉表 与 Phi 和 Cramer's V 选定在 统计学 选项

结果

CYP2C19 基因型与代谢表型的分布

对175例急性脑梗死患者的CYP2C19基因型和代谢表型分析显示，中间代谢型最为常见（81/175，46.29%），而弱代谢型最少见（21/175，12.00%）。基因型分布结果显示，CYP2C19 *1/*1（快代谢型）是最常见的基因型（73/175，41.71%），其次为*1/*2（中间代谢型，72/175，41.14%）。*2/*2基因型占弱代谢型的8.57%（15/175）（表2）。这些结果支持CYP2C19基因变异在该人群中较为普遍的假设，且有相当比例的患者代谢能力降低，这可能影响丁苯酞治疗的疗效。

按预后分组进行的临床特征比较分析

良好预后（mRS ≤ 2）组与不良预后（mRS ≥ 3）组之间的比较分析显示，在年龄、性别、梗死面积、BMI、饮酒史、吸烟史或血脂参数方面均无显著差异（均 P > 0.05）。然而，不良...

讨论

急性脑梗死是由脑血管供血不足引起的一种综合征，属于重要的神经科急症^8,9,10。丁基苯酞已成为该病的主要治疗药物。研究表明，其治疗机制涉及抑制细胞内自由基的产生、增强抗氧化酶活性以及维持线粒体完整性，从而共同改善缺血缺氧条件下神经组织的能量代谢¹¹。尽管该药在改善神经功能缺损方面具有疗效，但临床观察发现其存在不良反应，包括血清转氨酶水平升高、腹部不适，以及极少数情况下神经功能损害加重，这些可能对患者的预后产生不利影响¹²。因此，准确的预后评估对于指导临床医生及时采取干预措施、降低死亡率和致残率、改善长期预后至关重要。

本研究发现，血清同型半胱氨酸（Hcy）水平和基线美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分是急性脑梗死预后的重要预测因素。从病理生理学角度看，急性脑梗死由脑动脉狭窄、闭塞或血栓事件引发。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2× TaqMan 主混合液	Thermo Fisher Scientific	4371355	用于 CYP2C19 基因分型的实时 PCR 反应
琼脂糖	N/A	N/A	用于制备 2% 琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶电泳
丁苯酞胶囊	NBP Pharmaceutical Co., Ltd.	H20050299	每粒 0.1 g；空腹服用，每次 0.2 g，每日三次
DNA 提取试剂盒	天根生化科技	DP304	用于从血清样本中提取基因组 DNA；包含裂解缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液
电子病例报告表（e-CRF）	N/A	N/A	覆盖五个临床数据领域的系统性临床数据收集工具
同型半胱氨酸（Hcy）ELISA 试剂盒	上海酶联生物	N/A	检测范围为 5–50 μmol/L；变异系数 <5%；用于血清 Hcy 测定
洗脱缓冲液	天根生化科技	N/A	预热至 70°C；DP304 DNA 提取试剂盒组分，用于 DNA 洗脱
Eppendorf 5425R 冷冻高速离心机	Eppendorf	5425R	用于血清分离及基因组 DNA 纯化的离心步骤
Hi-SNP 测序平台/分析系统	BGI 基因组学	N/A	第二代测序技术；用于 CYP2C19 基因型确认，测序深度达 100×
HpyCH4V 限制性内切酶	New England Biolabs	N/A	用于对不一致的基因分型结果进行限制性片段长度多态性分析
裂解缓冲液	天根生化科技	N/A	DP304 DNA 提取试剂盒组分；与样本在 56°C 下孵育 10 分钟
NanoDrop 分光光度计	Thermo Fisher Scientific	N/A	用于将最终基因组 DNA 浓度调整至 50–100 ng/μL
无核酸酶水	N/A	N/A	用于配制 CYP2C19 基因分型实时 PCR 反应体系
引物-探针混合液（CYP2C19*2）	Thermo Fisher Scientific	C__25986767_30	特异性用于实时 PCR 中 CYP2C19*2 基因分型
引物-探针混合液（CYP2C19*3）	Thermo Fisher Scientific	C__27861809_10	特异性用于实时 PCR 中 CYP2C19*3 基因分型
Roche LightCycler 480 II 系统	Roche 诊断公司	LightCycler 480 II	用于 CYP2C19 基因分型的实时 PCR 系统
Roche/Hitachi 7600 分析仪	Roche 诊断公司/日立	7600	用于血脂谱（TC、TG、LDL-C、HDL-C）测定；脂质检测范围在研究中已明确说明
SPSS	IBM Corp.	25	统计分析软件；用于本研究所有数据分析（χ² 检验、t 检验、逻辑回归等）
洗涤缓冲液	天根生化科技	N/A	DP304 DNA 提取试剂盒组分；DNA 纯化过程中使用 500 μL 进行两次洗涤