用于多重来源中四种人畜共患肠道寄生虫同步检测的集成式PCR分子检测系统

摘要

本文介绍一种基于聚合酶链式反应（PCR）的综合分子检测系统，用于同时检测来自多种来源的四种人畜共患肠道寄生虫。

摘要

传染病是影响人类健康、经济发展和社会稳定的重要因素。其中，人畜共患肠道寄生虫病作为新发和再发传染病，日益成为全球关注的焦点，尤其是隐孢子虫（Cryptosporidium）、毕氏肠微孢子虫（Enterocytozoon bieneusi）、芽囊原虫（Blastocystis）和贾第虫（Giardia）。目前针对上述寄生虫的流行病学研究较少，且存在检测目标单一、检出率低、漏检率高等问题。本研究旨在建立一种基于多重PCR检测技术的集成化分子检测体系，用于对来自野生小鼠、伴侣动物以及家畜（牛和羊）样本中的上述四种人畜共患肠道寄生虫进行同步检测，从而为多种场景下的常规寄生虫检测提供高效的技术支持，尤其适用于动物-环境交界面及地方监测机构的本地化 surveillance。

本研究以检测95只野生小鼠以及30只猫和狗（其中猫25只，狗5只）粪便中的Enterocytozoon bieneusi为主要实验内容，当使用两对引物扩增ITS基因时，每项PCR检测的阳性结果完全一致（5.26%），但联合使用两组聚合酶链式反应（PCR）检测后，Enterocytozoon bieneusi的阳性率更高（6.32%）。对于Giardia，使用β-微管蛋白（BG）基因检测出9个阳性样本，而使用谷氨酸脱氢酶（GDH）基因和磷酸丙糖异构酶（TPI）基因均未检测到阳性样本。 上述结果表明，与单一PCR检测相比，联合使用针对多个靶基因片段的PCR检测可提高指定病原体的检出能力。靶序列均通过Sanger测序予以确认。该系统旨在加强并促进对多种来源的人畜共患肠道寄生虫感染状况、分布特征及系统发育演化的监测，为早期精准、灵敏的预警提供依据，旨在构建实现人类-动物-环境健康交汇界面“同一健康”（One Health）目标的技术桥梁。

引言

Cryptosporidium、Enterocytozoon bieneusi、Blastocystis 和 Giardia 是常见且易被忽视的原虫病原体，具有全球性分布。近年来，由于围垦及侵入自然疫源地生态位等因素，伴侣动物（猫、狗）饲养的普及，以及畜禽养殖业的发展，啮齿类动物、伴侣动物和家畜（牛、羊）中多源性人畜共患肠道寄生虫病的流行日益成为城乡地区新发、暴发和再发传染病的关注重点，严重威胁人类健康和全球公共卫生安全^1,2,3,4。

这些寄生虫具有复杂的属内物种多样性以及广泛的宿主适应性。它们不仅可感染啮齿类动物、伴侣动物、家畜反刍动物、家禽和鸟类，还可感染人畜共患种类，导致人类出现腹痛、腹泻和呕吐等临床症状。儿童、老年人、孕妇以及免疫功能低下人群尤其易感，且可通过水、食物和空气传播，构成重大的人畜共患公共卫生风险^3,5,6。

目前，上述四种寄生虫的鉴定主要依赖形态学方法，但由于属内形态相似性以及主观因素的影响，容易导致误判，尤其是在区分物种和基因型方面。分子生物学技术已广泛应用于这些寄生虫的物种、属和基因型鉴定。Blastocystis 和 Cryptosporidium 的检测主要集中在小亚基核糖体核糖核酸（SSU rRNA）基因^3,7,8；Enterocytozoon bieneusi 则以内部转录间隔区（ITS）基因为主^4,9；而 Giardia 的检测则常用β-衣壳蛋白（BG）、谷氨酸脱氢酶（GDH）和磷酸丙糖异构酶（TPI）基因^10,11。尽管巢式常规聚合酶链式反应（PCR）显著提高了这四种寄生虫的鉴定与分型能力，但在检出漏诊病例以及识别具有显著遗传特征的新物种或准种方面仍显不足。这常常影响人类、动物及其他宿主中相关疾病的流行病学调查、传播追踪和防控效率，对人类、动物及环境的公共卫生安全构成重大挑战。

由于这四种寄生虫在症状、传播途径和宿主范围方面具有相似性，目前尚无能够高效检测、避免漏检，并准确识别具有显著遗传差异的新物种或准种的综合性分子检测系统。本研究通过文献回顾，建立了基于PCR高通量测序技术的成熟综合性分子检测系统，可实现对多源样本（野生小鼠、伴侣动物、牛和羊）中四种人畜共患肠道寄生虫的同步检测。结合生物信息学分析，该系统被应用于多源人畜共患肠道寄生虫的鉴定，感染分布与系统发育进化等流行病学因素的监测，以及人畜感染和环境污染的早期预警。

方案

本研究经江苏省疾病预防控制中心动物伦理委员会批准并组织实施。本研究遵循《2020年版美国兽医医学会动物安乐死指南》、中华人民共和国国家科学技术委员会第2号令（1988年）发布的《实验动物管理条例》的指导原则，以及中华人民共和国科学技术部发布的《实验动物福利伦理审查指南》中关于动物人道对待的指导原则。

1. 野生小鼠、伴侣动物及家畜（牛和羊）新鲜粪便的制备

1. 使用罐装压缩二氧化碳气源，在透明密闭的塑料箱中通过吸入二氧化碳的方式对小鼠进行麻醉，气体置换速率为每分钟容器体积的30%–70%。待小鼠完全麻醉并进入昏迷状态后，实施颈椎脱臼处死。
2. 新鲜粪便样本采集：在犬、猫、牛和羊排便后1小时内收集粪便样本，每只动物的粪便分别装入一支试管中，并避免交叉污染。
   1. 在不同野外生境中使用带释放装置的诱饵笼捕获啮齿类动物。将捕获的小鼠放入小鼠专用袋中，迅速转运至实验室。在生物安全柜内进行无菌操作，解剖小鼠以取出含有粪便的直肠部分，将其置于2 mL冻存管中，并于-80 °C保存以备后续检测。
   2. 从不同地区的宠物商店中选取犬和猫作为研究对象。立即收集其新鲜排出的粪便，放入5 mL冻存管中，标注完整的样本信息后，迅速转运至实验室并于-80 °C保存。
   3. 从畜牧养殖场（集约化或散养）中选取牛和羊作为研究对象。立即收集其新鲜排出的粪便，放入50 mL冻存管中，标注完整的样本信息后，迅速转运至实验室并于-80 °C保存。

2. 从野生小鼠、伴侣动物和家畜（牛和羊）的新鲜粪便中提取总DNA

1. 粪便预处理：
   注意：使用 QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit。
   1. 在生物安全柜内进行无菌操作，将不同来源的约 200 mg 粪便加入磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入钢珠，使用组织研磨器充分匀浆。
   2. 在 70 °C 下加热 5 分钟，并在室温（15–25 °C）下以 10,000 × g 离心 10 分钟。
   3. 将 600 µL 上清液加入含有 25 µL 蛋白酶 K 的 2 mL 离心管中，加入 600 µL Buffer AL，涡旋振荡 15 秒。
   4. 在 70 °C 下孵育 10 分钟。向裂解液中加入 600 µL 100% 无水乙醇，涡旋混匀。
2. 小心将 600 µL 裂解液加入离心柱中，以 14,000 × g 离心 1 分钟，将离心柱转移至新的 2 mL 收集管中。重复此步骤一次。
3. 小心打开离心柱，加入 500 µL Buffer AW1，最大转速离心 1 分钟，将离心柱转移至新的 2 mL 收集管中。小心打开离心柱，加入 500 µL Buffer AW2，最大转速离心 3 分钟。
4. 将离心柱放入新准备的 2 mL 收集管中，以 14,000 × g 离心 3 分钟。将离心柱转移至新标记的 1.5 mL 离心管中，直接向离心柱膜中央加入 100 µL 洗脱缓冲液。
5. 在室温（15–25 °C）下孵育 1 分钟，以 14,000 × g 离心 1 分钟以洗脱 DNA。
6. 使用超微量分光光度计测定 DNA 的浓度和纯度。提取的 DNA 可用于后续检测，或于 -20 °C 长期保存。
   注意：A260/A280 比值应在 1.8–2.0 之间，以确保提取 DNA 的完整性和纯度。

3. 针对小亚基核糖体RNA（SSU rRNA）的隐孢子虫（Cryptosporidium）和毕氏肠微孢子虫（Blastocystis）巢式常规PCR检测

注意：此步骤使用了 Dream Taq Green PCR Mix。

1. 在冰上配制PCR反应体系：加入25 µL的2× Taq缓冲液、上下游引物各2 µL、16 µL的ddH₂O以及5 µL模板DNA，总体积为50 µL。
2. 针对Cryptosporidium，执行步骤3.2.1–3.2.2。
   1. 使用F1R1¹和F-1R1-1^8,11作为第一轮扩增引物。设定反应程序：94 °C预变性5 min；进行30个循环，每个循环包括94 °C变性40 s、55 °C退火40 s、72 °C延伸90 s；最后在72 °C终延伸7 min。
   2. 使用F2R2¹和F-1R2-1^8,11作为第二轮扩增引物，反应程序如下：94 °C预变性5 min；进行30个循环，每个循环包括94 °C变性40 s、55 °C退火40 s、72 °C延伸1 min；最后在72 °C终延伸7 min。
3. 针对Blastocystis，执行步骤3.3.1–3.3.4。
   1. 使用F1R1³和F1-1R-1^3,12 作为第一轮扩增引物。F1R1的反应程序设定如下：94 °C预变性5 min；进行30个循环，每个循环包括94 °C变性40 s、60 °C退火40 s、72 °C延伸100 s；最后在72 °C终延伸7 min。
   2. F1-1R-1的反应程序设定如下：94 °C预变性5 min；进行30个循环，每个循环包括94 °C变性40 s、55 °C退火40 s、72 °C延伸1 min；最后在72 °C终延伸7 min。
   3. 使用F2R2³和F2-1R-1^3,12作为第二轮扩增引物。F2R2的反应程序设定如下：94 °C预变性5 min；进行30个循环，每个循环包括94 °C变性40 s、60 °C退火40 s、72 °C延伸1 min；最后在72 °C终延伸7 min。
   4. F2-1R-1的反应程序设定如下：94 °C预变性5 min；进行30个循环，每个循环包括94 °C变性40 s、55 °C退火40 s、72 °C延伸50 s；最后在72 °C终延伸7 min。
      ​注：引物序列见表1^1,3,8,11,12。

病原体	预期产物大小 (bp)	引物序列 (5′-3′)			参考文献
Cryptosporidium	830	F1: CCATTTCCTTCGAAACAGGA			1
		R1: TTCTAGAGCTAATACATGCG
		F2: AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA
		R2: GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG
	607	F-1: GACATATCATTCAAGTTTCTGACC			8,11
		R1-1: CTGAAGGAGTAAGGAACAACC
		R2-1: TCTAAGAATTTCACCTCTGACTG
Blastocystis	600	F1: GGGATCCTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC			3
		R1: GGAAGC TTATCTGGTTGATCCTGCCAGTA
		F2: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT
		R2: GAGCTTTTTAACTGCAACAACG
	460	F1-1: TGCTTTCGCACTTGTTCATC			3,12
		F2-1: GATTTATTGTCACTACCTCC
		R-1: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT

表1：Cryptosporidium 和 Blastocystis 的SSU rRNA引物序列。

4. 通过巢式常规PCR检测Enterocytozoon bieneusi的ITS基因以及Giardia的BG、GDH和TPI基因

注意：此步骤使用了 Dream Taq Green PCR Mix。

1. 在冰上使用PCR混合液配制PCR反应体系：25 µL的2× Taq缓冲液，上下游引物各2 µL，16 µL的ddH₂O，以及5 µL模板，总体积为50 µL。
2. 针对Enterocytozoon bieneusi，执行步骤4.2.1–4.2.2。
   1. 使用F1R1⁹和F1-1R1-1²作为第一轮反应引物。反应程序设置如下：94 °C预变性5分钟，进行30个循环，每个循环包括94 °C变性40秒、55 °C退火40秒、72 °C延伸50秒，最后在72 °C终延伸7分钟。
   2. 使用F2R2⁹和F2-1R2-1²作为第二轮引物，反应程序如下：94 °C预变性5分钟，进行30个循环，每个循环包括94 °C变性40秒、55 °C退火40秒、72 °C延伸50秒，最后在72 °C终延伸7分钟。
3. 针对Giardia，执行步骤4.3.1–4.3.3。
   1. 使用BG-F1R1、GDH-F1R1和TPI-F1R1^2,10作为三个目标基因的第一轮反应引物。第一轮反应程序统一设置如下：94 °C预变性5分钟，进行30个循环，每个循环包括94 °C变性40秒、50 °C退火40秒、72 °C延伸1分钟，最后在72 °C终延伸7分钟。
   2. BG-F2R2^2,10和TPI-F2R2^2,10的第二轮反应程序设置如下：94 °C预变性5分钟，进行30个循环，每个循环包括94 °C变性40秒、55 °C退火40秒、72 °C延伸50秒，最后在72 °C终延伸7分钟。
   3. GDH-F2R2^2,10的第二轮反应程序设置如下：94 °C预变性5分钟，进行30个循环，每个循环包括94 °C变性40秒、60 °C退火40秒、72 °C延伸50秒，最后在72 °C终延伸7分钟。
      ​注：引物序列见表2^2,9,10。

病原体	预期产物大小 (bp)	引物序列 (5′-3′)			参考文献
Enterocytozoon bieneusi	390	F1: GGTCATAGGGATGAAGAG			9
		R1: TTCGAGTTCTTTCGCGCTC
		F2: GCTCTGAATATCTATGGCT
		R2: ATCGCCGACGGATCCAAGTG
	390	F1-1: GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT			2
		R1-1: TATGCTTAAGTCCAGGGAG
		F2-1: AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG
		R2-1: AGTGATCCTGTATTAGGGATATT
Giardia	511	BG-F1: AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC			2,10
		BG-R1: GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC
		BG-F2: GAACGAACGAGATCGAGGTCCG
		BG-R2: CTCGACGAGCTTCGTGTT
	530	GDH-F1: TTCCGTRTYCAGTACAACTC			2,10
		GDH-R1: ACCTCGTTCTGRGTGGCGCA
		GDH-F2: ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT
		GDH-R2: GTGGCGCARGGCATGATGCA
	530	TPI-F1: AAATIATGCCTGCTCGTCG			2,10
		TPI-R1: CAAACCTTITCCGCAAACC
		TPI-F2: CCCTTCATCGGIGGTAACTT
		TPI-R2: GTGGCCACCACICCCGTGCC

表2：Enterocytozoon bieneusi ITS基因以及Giardia BG、GDH和TPI基因的引物序列。

结果

小鼠 隐孢子虫、芽囊原虫 SSU rRNA 基因、微孢子虫 Enterocytozoon bieneusi ITS 基因以及贾第虫 BG 基因的 PCR 检测结果
共采集95份小鼠直肠粪便样本，使用两对引物对Enterocytozoon bieneusi的ITS基因进行检测，每种方法分别检出5份阳性样本，合计共6份阳性样本。在图1中，第1–6泳道和第7–12泳道分别加载了使用不同引物组进行两轮PCR所得的扩增产物。每种PCR方法各自漏检了一份阳性样本。对于Enterocytozoon bieneusi，两种单独PCR检测的阳性率均为5.21%（5/95），低于联合...

讨论

Cryptosporidium、Enterocytozoon bieneusi、Blastocystis 和 Giardia 是常见的人畜共患肠道寄生虫；其中前两种被美国国立卫生研究院（NIH）归类为B类生物病原体，这四种寄生虫均被世界卫生组织（WHO）列为全球24种最重要食源性寄生虫之列。它们可能感染人类和动物，并污染环境，导致疾病暴发，严重影响公共卫生安全¹³。目前，感染性寄生虫的鉴定主要依赖技术人员进行形态学分析，该方法具有主观性强、速度慢、效率低等缺点。因此，迫切需要整合现有检测技术，建立基于PCR高通量测序技术的高效一体化分子检测体系，以实现对多种来源样本中上述四种人畜共患肠道寄生虫及其他寄生虫的同步检测。

近年来，分子生物学技术已成功应用于SARS-CoV-2等公共卫生疫情中传染病病原体的快速鉴定，在疫情防控中发挥了决定性作用。目前，对四种肠道寄生虫的分子检测主要集中在18S rRNA基因区域，该区域适用于属水平以及种内和种间的鉴定

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	青歌科技	TSJ001
Qiaquick凝胶提取套件	Qiagen	28704	DNA凝胶提取套件
100碱基对加DNA阶梯	TransGen 生物	BM311	DNA阶梯
4S绿色加核酸染色	BBI	A616696-0500	DNA染色
10次以上;TBE缓冲器	太阳生物	T1051	电泳缓冲液
量子比特4.0	热	https://www.thermofisher.com/in/en/home /工业/光谱-元素 -同位素分析/分子光谱/ fluorometers/qubit/models/qubit-4.html？ ef_id=：G：s&;s_kwcid=AL！3652！10！77515 785702067!!!!77516061528018!!380468 453！1240249321530142&cid=bid_pca_ aqb_r01_co_cp1359_pjt0000_bid 00000_0se_bng_bt_pur_con	荧光定量仪器
迷你空间1000	塔农	http://en.biotanon.com/PRODUCT/ PRODUCTLIST？ID=3040& 类型=细节	凝集成像仪
快速DNA粪便提取迷你套装	奇根	51604	核酸提取套件
ProFlex 底座	热	https://www.thermofisher.com/ 在/en/home/life-science/pcr/ 热循环器-实时- 仪器/热循环器 /proflex-pcr-system.html	PCR
Dream Taq Green PCR 混合液	热	K1082	PCR扩增