方法文章

用于单细胞分析的组织特异性高质量原生质体分离 拟南芥

DOI：

10.3791/69330

⸱

2026年2月6日

 ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究提出了一种改进的拟南芥（Arabidopsis thaliana）根、叶、茎和花组织原生质体分离方案。该方法通过优化酶解和纯化步骤，最大限度减少细胞损伤和碎片，从而提高原生质体得率，获得适用于单细胞RNA测序等单细胞技术的高质量原生质体。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单细胞RNA测序（scRNAseq）已成为植物生物学中获取细胞类型特异性基因表达、发育动态以及组织对环境因素响应的高分辨率信息的重要工具。将scRNAseq应用于植物的一个主要技术挑战在于，如何高效且可重复地分离出具有代表性的、无细胞壁的活体单细胞，以反映植物组织的异质性。原生质体分离是一种常用方法，通过酶解去除细胞壁，从而获得单个活的植物细胞。然而，成功的原生质体分离需要精细优化，以维持细胞活性并保留细胞类型特异的转录组谱型。本文介绍了一种从多种Arabidopsis thaliana组织（包括地上部分（叶片、茎、花）和根组织）中分离高质量原生质体的稳健且可重复的实验方案。该方案考虑了不同类型组织的独特生理特性，优化了酶解条件和纯化步骤，以确保高产量并广泛代表多种细胞类型。所获得的原生质体适用于单细胞RNA测序、流式细胞术（FACS）以及瞬时基因表达分析等应用，能够从多种组织类型中生成单细胞悬液。本方法有助于探索植物细胞异质性，并提高植物研究中单细胞技术的可靠性。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单细胞RNA测序（scRNAseq）通过实现前所未有的分辨率下的基因表达分析，彻底改变了植物生物学。scRNAseq能够在细胞类型特异性的分辨率上提供有关细胞异质性、发育轨迹以及对环境刺激响应的转录组信息1,2,3。

与动物系统不同，植物细胞壁的刚性以及植物组织的结构复杂性为高效分离单细胞以进行转录组分析带来了显著障碍。在现有的方法中，通过酶解法去除细胞壁以制备原生质体的方法已被广泛采用，该方法早在60多年前即已建立4,5,6。尽管该方法应用广泛，原生质体的分离仍是一项技术要求较高的操作，需要针对不同组织进行优化，以平衡细胞得率、存活率以及转录组的稳定性。其他替代方法，例如单核RNA测序（snRNA-seq），通过分离细胞核避免了细胞壁消化的步骤7。然而，这种方法的代价是丢失了存在于细胞质中的成熟转录本信息。其他物理解离方法，如机械解离和激光辅助显微切割，虽可避免酶解细胞壁，但通常容易发生交叉污染，且可能导致细胞存活率降低和通量有限8,9,10。

近年来，已开发出多种植物细胞图谱，尤其是拟南芥（Arabidopsis）的细胞图谱，为了解各种组织的转录组景观提供了重要见解2,11,12,13,14,15,16,17,18。然而，这些图谱主要基于处于幼年期或幼苗期的植物，且大多集中于根或叶组织。这些研究中所采用的实验方案需要针对较老的拟南芥组织（如成熟叶片、花和茎）进行优化。此外，在采用细胞类型特异性测序技术（例如单细胞RNA测序或结合RNA测序的荧光激活细胞分选技术（FACS））之前，原生质体分离过程所引起的转录组变化尚未被充分评估19。

本文所述方法在以往研究基础上进行了多项关键性改进：通过优化根组织及地上组织（叶片、茎、花）的缓冲液浓度，以兼顾植物不同组织间的生理与解剖差异，并引入温和的纯化步骤，以最大限度减少细胞损伤并提高原生质体纯度。与基于细胞核的方法相比，该方法有望保留完整的全细胞转录组，从而获得细胞质中成熟mRNA分子更高分辨率的信息。重要的是，该方法可获得较高的原生质体活力、异质性以及在不同组织间可重复的浓度，浓度范围从花组织中约 9.8 × 103 个细胞/mg 到叶片中约 2.2 × 102 个细胞/mg 不等。

本方法的总体目标是提供一种稳健且可重复的原生质体分离方案，专为拟南芥（Arabidopsis thaliana）多种组织设计，以满足植物单细胞研究中对覆盖多种细胞类型的高质量起始材料的关键需求。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究中使用的试剂和设备列在材料表中。

1. 缓冲液的配制

  1. 根据表1在15 mL离心管中配制相应的原生质体分离缓冲液17,18：根组织使用根原生质体分离缓冲液，地上部分组织（花、茎、叶）使用花/茎/叶原生质体分离缓冲液。
    注意：五株收获的开花期Arabidopsis thaliana植株（第11-12阶段，花蕾未开放）所需原生质体分离缓冲液的大致用量为：根（约375 mg）：7 mL，叶（约930 mg）：5 mL，茎（约215 mg）：3 mL，花（约10 mg）：2 mL。
  2. 使用根/叶原生质体分离缓冲液前，新鲜加入2%（w/v）纤维素酶RS和1%（w/v）离析酶R10。将缓冲液置于旋转仪上充分混匀，直至粉末完全溶解（约10分钟，25 °C）。操作时避免产生气泡，并确保缓冲液中无未溶解的粉末团块。

2. 组织消化

  1. 使用前，将相应的原生质体分离缓冲液通过 0.2 µm 滤膜过滤。对于叶片和根组织，使用标准尺寸的培养皿（100 mm × 15 mm）；对于花等少量组织，则使用小型培养皿（30 mm × 15 mm）。在转移组织前，向培养皿中加入数滴原生质体分离缓冲液。
  2. 将相应组织转移至培养皿中，用剃须刀片以垂直方向尽可能精细且快速地切碎组织（图 1A）。
    注意：每次处理样品时，务必使用不同的刀片和镊子，以避免交叉污染。操作剃须刀片时应佩戴防护手套。
  3. 将剩余的原生质体分离缓冲液加入相应的培养皿中，完全浸没切碎的组织，并在 25 °C 下孵育 1 小时。地上部分组织置于实验台静置（不摇动），而根组织则转移至旋转摇床平台（60 rpm）上进行处理。

3. 过滤

  1. 孵育后的根部样品：
    1. 使用巴斯德移液管，将培养皿中的原生质体转移至置于预冷的50 mL离心管上方的40 µm细胞滤筛中。
    2. 为收集残留的原生质体，向同一培养皿中加入与之前等体积的W5溶液（2 mM MES pH 5.7，154 mM NaCl，125 mM CaCl2，5 mM KCl），以收集附着在培养皿底部的原生质体。将重悬于W5溶液中的原生质体转移至同样置于预冷的50 mL离心管上方的40 µm细胞滤筛中。
    3. 再用一个新的40 µm细胞滤筛，将样品第二次过滤至另一个预冷的50 mL离心管中。此后，所有样品均需置于冰上，并在操作原生质体时格外轻柔。
  2. 孵育后的地上部分样品：
    1. 使用巴斯德移液管，将培养皿中的原生质体转移至置于预冷的50 mL离心管上方的70 µm细胞滤筛中。
    2. 为收集残留的原生质体，向同一培养皿中加入与之前等体积的W5溶液（2 mM MES pH 5.7，154 mM NaCl，125 mM CaCl2，5 mM KCl），以收集附着在培养皿底部的原生质体。将重悬于W5溶液中的原生质体转移至同样置于预冷的50 mL离心管上方的70 µm细胞滤筛中。此后，所有样品均需置于冰上，并在操作原生质体时格外轻柔。

4. 洗涤与Ficoll纯化

  1. 将离心机预冷至 4 °C，以 500 × g 离心 5 分钟收集（沉淀）原生质体，离心机刹车设置为零。
  2. 离心后的根样品：
    1. 弃去上清液，注意不要扰动原生质体沉淀。
    2. 用预冷（4 °C）的 600–700 µL 根重悬缓冲液（等体积的根原生质体分离缓冲液（不含酶）与 W5 溶液混合），使用巴斯德移液管或剪去尖端的 1 mL Gilson 移液器轻柔地重悬原生质体，避免剪切损伤。
    3. 将悬液转移至预冷（4 °C）的 1.5 mL 离心管中。
  3. 离心后的地上部分样品：
    1. 弃去上清液，注意不要扰动沉淀。
    2. 用预冷（4 °C）的 600–700 µL 花/茎/叶重悬缓冲液（等体积的花/茎/叶原生质体分离缓冲液（不含酶）与 W5 溶液混合），使用巴斯德移液管或剪去尖端的 1 mL Gilson 移液器轻柔地重悬沉淀，避免剪切损伤。
    3. 将悬液转移至预冷（4 °C）的 1.5 mL 离心管中。
    4. 在 1.5 mL 离心管中配制 300 µL 的 13.3 %（w/v）Ficoll PM 400 溶液。混匀后置于冰上保存。
    5. 将重悬后的原生质体样品（600–700 µL）缓慢地加至已准备好的 Ficoll 溶液上层，注意不要接触或混合 Ficoll 层。
    6. 在 4 °C 下以 700 × g 离心 5 分钟，离心机刹车设置为零。
    7. 收集位于中间层（界面）以及上层（第一层）的原生质体（图 1B）。注意避免收集含有 Ficoll 和分离碎片的下层第三层。收集后于 4 °C 保存，待后续使用。

5. 计数与质量检测

  1. 取10 µL原生质体溶液，使用Neubauer血细胞计数板对分离得到的原生质体数量进行计数。
    可选：可加入1% (w/v)伊文思蓝染料以评估原生质体的活力（图1C）。
  2. 使用预冷（4 °C）的重悬缓冲液将原生质体溶液稀释至所需浓度（单位：个/mL），缓冲液根据组织类型分别参照步骤4.2.2（根组织）和步骤4.3.2（地上部分组织）进行配制。
  3. 尽快开展后续实验，例如单细胞RNA测序和/或流式细胞分选（FACS）15,19。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

针对地上部分和根组织所采用的原生质体分离方案，能够高效消化细胞壁，并从所有Arabidopsis thaliana组织中释放出完整的单细胞。在所测试的组织类型（包括花、茎、叶和根）中，酶解过程均产生了分散良好的原生质体，未消化的细胞团数量极少（图2A-D）。伊凡斯蓝染色检测证实，呈现球形形态且质膜边界光滑的原生质体为活细胞（图1C）。对每种组织类型的球形原生质体进行了计数：花中平均含有97,875 ± 7,531个（9,788个细胞/mg，n = 3），茎中为119,025 ± 22,508个（550个细胞/mg，n = 4），叶中为210,483 ± 15,572个（225个细胞/mg，n = 3），根中为225,363 ± 52,561个（599个细胞/mg，n = 4）。

原生质体悬浮液显示出细胞大小分布广泛，并含有绿色或浅色质体，反映了每种收获组织的细胞组成具有异质性（图3A-D）。为验证这一点，利用转基因韧皮部伴胞特异性YFP报告基因品系进行了原生质体分离实验，结果悬浮液中包含具有YFP信号的存活小型原生质体，代表了伴胞来源的细胞（图3E）。这表明所采用的原生质体分离方案适用于分离细胞壁较坚硬、难以获取的维管组织细胞。

通过本研究所提供的优化方法，可以从成年植物的不同组织中分离出大量具有活性的原生质体，并且杂质极少。为了提高地上部分样品的纯化效果，我们引入了菲可（Ficoll）垫层清洗步骤，以去除消化样品中释放的细胞器和其他细胞碎片，同时保持转录组的质量（图4）。

在由原生质体生成的单细胞RNA测序（scRNAseq）cDNA文库中，通过特异性的cDNA PCR检测方法检测到了高表达的持家基因转录本（如ACTIN2）以及低丰度或低表达的转录本，例如仅在形成层和分生组织细胞中特异性表达的同源异型域转录因子KNAT1，以及伴胞标记基因SUC2和PARCL115（图5）。这表明所获得的原生质体群体具有广泛的细胞类型代表性及细胞异质性，该结论进一步通过分析该方法产生的scRNAseq数据得到了验证15。

原生质体分离步骤示意图：缓冲液配制、组织消化、过滤、纯化、质控。
图1：原生质体分离步骤的工作流程。 共包括六个主要步骤：（1）缓冲液配制，（2）组织消化，（3）过滤，（4）洗涤与Ficoll纯化，（5）计数与质量控制，以及（6）后续下游实验的开展。请点击此处查看该图的放大版本。

植物组织研磨过程；培养皿、刀片、离心管、显微镜观察。
图 2：原生质体分离步骤示意图。（A）叶片样品切碎阶段的代表性图像（步骤 2.1）。上方图像显示在标准尺寸的培养皿中含有少量缓冲液的收获组织及用于切碎的剃须刀片。左下方图像表示用刀片垂直切割数次后的组织（见箭头）。右下方图像表示已完成切碎、准备进入下一步的样品。（B）在 1.5 mL 离心管中离心后 Ficoll 垫层的图像（步骤 4.3.7）。白色箭头指示中间层，其中含有原生质体。（C）经伊文思蓝染料染色孵育后的叶片原生质体显微图像。比例尺：250 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

植物组织显微图像；花、茎、叶、根原生质体；细胞细节分析。
图3：原生质体制备的显微图像。展示了来自不同组织类型的原生质体图像。（A）花，（B）茎，（C）叶，（D）根。比例尺：250 µm。（E）韧皮部伴胞特异性YFP报告基因品系的共聚焦显微镜图像。 第一幅图像（左）显示YFP报告基因在叶片维管组织中的表达（绿色）。第二幅图像（右）显示表达YFP报告基因的细胞所分离出的原生质体（绿色信号）。紫色/蓝色信号代表叶绿体的自发荧光。比例尺：10 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

密度分离分析中Ficoll纯化前后细胞样品的显微镜图像。
图4：叶片原生质体在Ficoll垫清洗前（A）和清洗后（B）的显微镜图像。比例尺：250 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

通过RT-PCR进行基因表达分析；示意图；SUC2、PARCL1、KNAT1、ACT2在不同植物组织中的表达。
图5：单细胞RNA测序文库的质量控制PCR结果。 根组织和地上部分组织单细胞RNA测序文库的质量控制PCR代表性凝胶图像。检测的基因为SUC2、PARCL、KNAT1、ACT2（分别对应A至D），每种组织的样本从左至右依次为：花、茎、叶、根。cDNA（+）作为阳性对照，水作为阴性对照。请点击此处查看该图的高清版本。

根原生质体分离缓冲液花/茎/叶原生质体分离缓冲液
600 mM 甘露醇400 mM 甘露醇
2 mM MgCl2-
0.1% BSA0.1% BSA
2 mM CaCl210 mM CaCl2
2 mM MES pH 5.720 mM MES pH 5.7
10 mM KCl20 mM KCl
必要时用 1M Tris 碱调节 pH 至 5.5必要时用 1M Tris 碱调节 pH 至 5.5

表1：原生质体分离缓冲液的成分。 提供了用于根部及地上部分（花、茎、叶）组织的原生质体分离缓冲液配方。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本优化方案针对不同拟南芥组织原生质体的分离，专为单细胞RNA测序（scRNAseq）应用设计，可分析细胞质和细胞核中存在的全转录组。通过针对不同组织对缓冲液进行特异性优化，并增加消化与纯化步骤，实现了在多种组织中稳定且可重复的高产量。具体而言，花组织原生质体平均每样本获得约98,000个细胞（约每毫克组织9,788个细胞），茎组织原生质体约119,000个细胞（约每毫克组织550个细胞），叶组织原生质体约210,500个细胞（约每毫克组织225个细胞），根组织原生质体约225,000个细胞（约每毫克组织599个细胞），反映了这些组织在结构与生理上的多样性。

本方案中的一个关键优化是采用基于Ficoll的垫层，而非更常用的基于蔗糖的梯度或垫层进行纯化。与可被细胞摄取并对转录组产生显著影响的蔗糖不同13,20,21，Ficoll具有渗透惰性且不能透过膜，从而在RNA分离过程中保持其完整性22。该步骤还可减少悬浮液中来自破裂细胞的游离细胞器（如叶绿体）和细胞碎片。此类碎片可能堵塞微流控装置的通道，干扰液滴形成，或导致生成的液滴中包含多个细胞，从而引起环境RNA污染。上述所有因素均可能导致单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析中出现错误结论或偏差。

已有研究表明，原生质体分离会改变植物细胞的转录组2,15,16,19。本实验方案中减少这一技术假象的关键策略是在酶解后将原生质体保持在4 °C（冰上），以减缓代谢和转录活性，从而降低与原生质体分离相关的转录变化。此外，保持各重复组之间组织采样的时间一致，并与研究目标相匹配至关重要，因为采样时间的差异已被证明会影响原生质体诱导基因以及在单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集中检测到的受昼夜节律调控的转录本15。

该方法除了能够产生碎片最少的单细胞外，另一个非常重要的方面是保持组织的异质性，以尽可能代表所有细胞类型。原生质体悬浮液的多样性通过检测到不同形态的原生质体得以证实，包括大小各异的细胞以及在获得的细胞群体中存在细胞类型特异性报告基因系的信号（图2）。此外，通过PCR检测单细胞RNA测序（scRNA-seq）cDNA文库中稀有且细胞类型特异性的转录本以及持家基因转录本，对原生质体群体进行了进一步评估（图4）。这些转录本包括茎尖分生组织的稀有标记基因以及伴胞的标记基因15。这些转录本的成功捕获证实，本方法能够以高完整性分离出多种细胞类型，使其成为推动植物单细胞研究的有力工具。除scRNA-seq外，该方法还可用于流式细胞术、瞬时基因表达分析以及植物再生实验。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文所属项目已获得欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议编号：810131）下的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
纤维素酶 RS Duchefa BiochemieC8003
离心机 5810R 型号Eppendorf5810000010
Ficoll PM 400 Sigma-Aldrich26873-85-8
果胶酶 R10Duchefa BiochemieM8002
微量离心机 5417R 型号Eppendorf已停产
Puradisc 30 无菌注射器滤器，0.2 µmCytiva10462200在实验方案中简称为 0.2 µm 滤器
无菌细胞筛，40 µm 尼龙网 Fisherbrand22363547
无菌细胞筛，70 µm 尼龙网 Fisherbrand22363548

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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RNA

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