通过固相表面荧光法监测蜂产品中的2,4-二氯苯氧乙酸

摘要

本研究提出了一种新的替代方法，用于检测和监测来自阿根廷中部和北部蜂产品样品中的2,4-二氯苯氧基乙酸。

摘要

蜜蜂健康对于蜂蜜生产和作物授粉至关重要。除草剂的使用可能对蜂蜜生产产生负面影响，因为蜜蜂在采集经处理植物的花蜜和花粉时可能接触到这些化学物质，从而导致蜂蜜被这些有毒残留物污染。尽管2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）的设计目的是防治阔叶杂草，但它可能进入花朵并污染蜜蜂产品，进而影响蜜蜂的健康和生存质量。因此，定期检测蜂蜜以发现除草剂残留的存在，并在必要时采取纠正措施，具有重要意义。本研究提出了一种新的替代方法，用于阿根廷中部和北部地区蜂产品样品中2,4-D的控制与监测，以替代传统技术。样品在pH = 7.0条件下，加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS），并通过蓝带滤纸过滤作为固相支持，随后采用固相荧光法进行测定。在最佳工作条件下，检测限和定量限分别为0.33 ng/L和0.90 ng/L，线性范围为0.90 × 10³ ng/L 至 1.13 × 10³ ng/L。该新方法的优势包括使用低成本仪器、环境友好型溶剂、废物产生量低，因而符合绿色化学的若干原则。

引言

蜜蜂健康对于蜂蜜生产和作物授粉至关重要。健康的蜂群依赖于全面的健康管理，包括适当的营养、卫生措施以及疾病的预防和治疗。如果以负责任的方式进行，蜂蜜生产不会对蜜蜂造成伤害，因为养蜂人仅提取总量中的一小部分蜂蜜，为蜂群保留足够的储备^1,2。

除草剂的使用可能对蜂蜜生产产生负面影响，因为蜜蜂在采集经处理植物的花蜜和花粉时可能接触到这些化学物质，从而导致蜂蜜被农药残留污染。此外，某些除草剂（如草甘膦）可直接影响蜜蜂的发育和行为，降低其觅食能力和生理发育^3,4,5,6。尽管2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）除草剂的设计目的是防治阔叶杂草，但它仍可能进入花朵并污染蜂蜜，进而影响蜜蜂健康和蜂蜜品质^7,8,9。

近年来，蜂蜜及其他蜂产品的国内外贸易呈现出显著且持续的增长，这反映在产量的增加上^10,11,12。根据联合国粮食及农业组织（FAO）的数据，全球五大蜂蜜生产国为中国、阿根廷、土耳其、美国和乌克兰¹³。养蜂业在阿根廷具有重要意义，并因近年来出现的出口市场机遇而持续增长。阿根廷的环境条件（气候、植被等）以及在生产中投入的技术，使其在全球占据了重要地位。另一方面，外源性物质的存在已成为一个令人关注的问题，需要进行监测，这与其他国家情况类似，因为这些物质不仅影响蜂蜜的市场销售，还因其毒性作用而影响消费者健康^14,15。

2,4-D 是一种广泛使用的选择性内吸性除草剂，通过模拟合成生长素的作用，导致阔叶杂草不受控制地生长并最终死亡，从而有效防治此类杂草。该除草剂应用于农业、园艺和林业，特别适用于小麦、玉米和水稻等作物田中杂草的防控，因其对禾本科植物或谷类作物无害¹⁶。2,4-D 也可用作植物生长调节剂，具有多种剂型，包括胺盐和酯类盐，以适应不同应用场景。2,4-D 的作用效果受施用剂量以及特定物种和组织类型的敏感性影响^17,18。例如，已有研究表明，2,4-D 的接触暴露可导致小鼠出现不良生殖结局及显著的遗传改变，表明其具有明显的遗传毒性¹⁹。

蜜蜂作为关键的传粉者以及研究真社会性、学习和记忆的模式生物，极易受到田间所用农用化学品直接毒害的影响²⁰。在开花期进行除草剂和杀虫剂的空中喷洒，可能导致蜜蜂大量死亡，并显著降低蜂蜜产量。即使处于亚致死剂量，农药混合物也可能使觅食蜜蜂迷失方向，损害其记忆力，并降低觅食效率。这会因减少花粉和花蜜的采集而削弱蜂群，导致营养缺乏。此外，已在蜂蜜样品中检测到2,4-D，受污染的花粉和花蜜可能在蜂巢同伴间传播²¹。

定期检测蜂蜜中是否含有除草剂残留物非常重要，必要时应采取纠正措施。对于食品污染物（如本研究中的2,4-D）的检测与定量，最常用的仪器分析方法是色谱法，包括高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）和气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）^{22,23,24,25,26}。然而，研究人员 periodically 提出了针对2,4-D的新监测方法，相较于传统定量方法具有一些优势^27,28,29，例如：使用成本更低的仪器、操作更简便、溶剂用量更少、适用于更复杂的样品等。

固相荧光是一种多功能技术，通过将分子荧光与固相萃取方法相结合，进一步提高了荧光仪器本身已具备的高灵敏度。此外，该技术还能通过降低或消除基质效应，改善线性范围和选择性^30,31。

本研究提出了一种用于监测和定量2,4-D的新分析方法，并将其应用于阿根廷中部和北部的蜂蜜及其他蜜蜂样品。样品中含有未知量的2,4-D。已知的是加标水平的浓度，即样品本身所含浓度加上我们额外添加的2,4-D浓度。后一数值是已知的，可用于计算回收率。该新方法基于使用固相荧光直接测定分析物，具有仪器成本低、运行费用少和环境友好性更高等多项优势。

方案

本文稿不包含任何由作者进行的涉及人类参与者或动物的研究。

所用仪器
采用配备150 W氙灯的基于计算机的荧光分光光度计进行荧光光谱测定。使用样品池进行固相表面荧光（SSF）测量。2,4-D定量分析所用参数如下：λ_em = 580 nm，激发波长λ_ext = 555 nm（狭缝宽度3-3），使用固体样品池。

采样与样品处理
本研究针对2025年生产的蜂蜜样品，于阿根廷中北部的圣路易斯省、圣胡安省、胡胡伊省和萨尔塔省开展。所分析的样品包括：四种多花蜂蜜、两种蜂胶蜂蜜、纯蜂蜜糖果，以及由蜂蜜、古柯和蜂胶混合制成的糖果，均购自上述地区的养蜂人。所研究的蜂蜜均为新鲜样品，在蜂巢中提取时间距生产不足一周，以避免2,4-D可能通过不同机制发生降解。所有样品均采集于新的无菌容器中，并立即转运至实验室。样品在避光条件下于4–8 °C保存直至分析。固体焦糖样品使用研钵和研杵均质化后，将其成分溶于5 mL超纯水中，并从中取0.5 µL溶液用于分析。

方法
取0.5 µL或1 µL的2,4-D（浓度分别为1.23 ng/L和3.49 ng/L）、100 µL样品、250 µL十二烷基硫酸钠（SDS，1 × 10^-4 mol/L）以及100 µL磷酸盐缓冲液（1 × 10^-4 mol/L，pH = 7），用双蒸水定容至3 mL。将混合液通过固相载体（滤纸；详见材料表）进行过滤。固相载体于室温下干燥后，使用固体样品池在激发波长λ_ext = 555 nm（狭缝宽度3-3）、发射波长λ_em = 580 nm条件下测定固相表面荧光（SSF）。

上述描述了所开发方法的通用流程，其中每个参数均已在结果部分所示的研究中进行了考察和优化。

pH值和缓冲液的影响
通过使用盐酸或氢氧化钠将体系调节至目标pH值（测试范围为pH 5–7）进行pH优化。随后，在确定获得适宜分析信号的最适pH范围后，选择所用的缓冲液。

测试的缓冲液包括磷酸盐、Tris 和硼砂，均配制为 1 × 10^-4 mol/L 的浓度。通过调节其体积以获得最佳荧光强度信号。结果显示，仅磷酸盐缓冲液可增强荧光强度，并列出了其相应的最佳浓度。本实验中选用的缓冲液为磷酸盐，pH = 7。

表面活性剂浓度
在分子荧光分析中使用不同的表面活性剂具有多种优势，可提高待测分析物的检测性能。胶束介质可用于减少分析物与样品基质组分之间的分子间相互作用。此外，荧光溶质的光物理性质在胶束介质中可能发生改变，从而提高荧光检测的灵敏度。本研究考察了不同表面活性剂（SDS 和 HTAB）对采用固相表面荧光法（SSF）定量检测2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）的影响。结果表明，阴离子表面活性剂 SDS 在浓度为 8.3 × 10⁻⁶ mol/L 时，可增强目标除草剂的荧光强度。

固体载体
鉴于平面构型在激发荧光态下具有能量优势，因此探索了除草剂在固体载体上的保留情况。将体系通过多种类型的膜进行过滤，包括尼龙膜、醋酸纤维素膜、混合酯膜以及蓝带滤纸。滤液收集于各自洁净的容器中，膜在室温下干燥。随后将膜置于固体样品池中，记录固相荧光（SSF）。在滤纸上观察到充分且具有选择性的保留，因此选择该载体用于固相荧光测定。同时采用分子荧光法分析滤液，未检测到2,4-D配合物，表明除草剂已保留在滤纸上。

回收率研究
向所研究的每份样品的适当体积中加入2,4-D（蜂蜜样品使用0.5 µL，其他样品使用1 µL），逐步增加其浓度至1.23 ng/L和3.49 ng/L。采用该方法测定分析物浓度，结果为六次重复实验的平均值（n = 6）。

精密度研究
通过重复检测含有 1.23 ng/L 和 3.49 ng/L 2,4-D 的样品（n = 6），并采用该方法测定分析含量，以评估方法的重复性和日内精密度。此外，对相同体系在7天内评估了日间精密度的重现性。

干扰研究
向含有 3.49 ng/L 2,4-D 的测试溶液中加入不同量的常见离子，并应用该方法。以下为测试的潜在干扰物质：

干扰物/2,4-D 摩尔比浓度 = 1000:1:00，对应 Na⁺、K⁺、Cl^-、Fe³⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Sb³⁺、Mn²⁺、As³⁺、CO₃^2-、SO₄^2-、Ca²⁺、Mg²⁺、NO^3-、Ni²⁺、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、2,4,5-T、磺甲基嘧啶、草甘膦和莠去津。

Zn²⁺、Co²⁺、Al³⁺、氯磺隆、苄嘧磺隆甲酯和三唑磺隆的干扰物/2,4-D 摩尔比浓度为 500:1:00。

分析质量参数的计算
分析质量参数包括检出限（LOD）和定量限（LOQ）。其计算步骤如下：通过测定15个空白样品（不含待测物的样品）的响应值，获得一组背景噪声数据，并计算该噪声的标准偏差。该标准偏差被接受为LOD值。检出限依据空白样品标准偏差的3.3倍确定（N = 15）；定量限依据空白样品标准偏差的10倍确定（N = 15）。

结果

以下结果展示了如何逐步研究影响整个实验流程的各个变量、优化过程以及最终达到的最佳工作条件。

2,4-D 光谱表征
通过紫外-可见光谱法和分子荧光法对 2,4-D 进行表征，在 λ_em = 580 nm 处观察到荧光强度最大值，激发波长 λ_ext = 555 nm（狭缝宽度 3-3；图 1）。随着浓度升高，荧光信号增强，表现出明显的增敏效应，从而实现对 2,4-D 的直接定量（图 2）。需要特别强调的是，直接分析物定量具有多项优势，相较于间接方法——即通过检测分析物对另一种荧光物质荧光信号的改变来进行测定——直接定量具有操作和计算简便、分析结果可靠且方法稳健等优点。在本研究中，荧光信号与 2,4-D 的浓度直接相关，这有助于简化运算过程并降低操作复杂性。

讨论

由于需要满足不断增长的人口对食物的需求，阿根廷及世界其他地区除草剂的使用强度已呈指数级增长。如果对这些产品的使用进行适当、合理和定期的监测，则不会影响其预期效益，也不会对整体环境产生负面影响。2,4-D 在全球范围内被广泛使用，许多研究表明，这种除草剂可诱导非靶标生物发生改变。因此，持续评估除草剂对蜜蜂等不同生态系统和生物可能带来的风险至关重要^{35,36,37,38,39,40}。

Almer-Jones 于1964年进行的研究³⁸表明，在采用空中喷洒2,4-D控制豚草后，该地区数百个蜂群出现成年蜜蜂严重死亡，导致蜂蜜产量下降。随后的一项实验研究...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,4-二氯苯氧乙酸	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	49083
乙酸/乙酸盐	Mallinckrodt Chemical Works
Blue Ribbon 滤纸	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	WHA1001929	2-5 μm 孔径，12.5 cm 直径
醋酸纤维素膜	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA		0.45 μm 孔径，47 mm
十六烷基三甲基溴化铵（HTAB）	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	H5882
盐酸	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	1.09063
Immobilon (+) 膜	Millipore, Sao Paulo, Brazil	HATF04700	0.45 μm 孔径，47 mm
混合酯膜	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA		0.45 μm 孔径，47 mm
尼龙膜	Millipore, Sao Paulo, Brazil	Z290793	0.45 μm 孔径，47 mm 直径
pH 计（Orion Expandable Ion Analyzer）	Orion Research, Cambridge, MA, USA	型号 EA 94。
磷酸二氢钾	Biopack, Buenos Aires, Argentina	2000168900
邻苯二甲酸氢钾	Merk &Co., Inc
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	11667289001
氢氧化钠	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	S2770
四硼酸钠	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	221732
荧光分光光度计	Shimadzu	RF-5301	配备 150 W 氙灯和 1.00 cm 石英比色皿
三（羟甲基）氨基甲烷	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	77-86-1