方法文章

利用双光子成像技术观察电针刺激期间体感皮层神经元的时空动态 体内 成像

DOI：

10.3791/69340

⸱

2026年1月16日

 ,  ,  , 
1Traditional Chinese Medicine, School of Medicine, Acupuncture Research Institute, Jianghan University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案结合 Thy1-GCaMP6f 转基因小鼠的颅窗技术、标准化电针刺激和双光子成像，以在刺激期间可视化毫秒级皮层神经元群动态，揭示特定皮层层次的可塑性变化。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案建立了一个综合性的实验框架，用于研究电针（EA）刺激期间皮层环路的动力学特性。该方法整合了三个关键部分：在Thy1-GCaMP6f转基因小鼠中植入慢性颅窗、在ST36穴位使用2/100 Hz双相脉冲进行标准化电针刺激，以及高分辨率双光子钙成像。这一整合方法能够以毫秒级的时间精度实时可视化初级躯体感觉（S1）皮层中神经元群体的活动，捕捉以往难以观测到的神经网络水平对神经调节反应的细节。该技术成功揭示了具有皮层分层特异性的激活模式及纵向可塑性变化，为理解电针效应背后的皮层机制提供了关键见解。通过克服传统功能性磁共振成像（fMRI）和电生理技术固有的时空分辨率限制，这一高分辨率平台为动态神经环路的解析提供了前所未有的分析能力。本方案结构严谨、结果可重复，对于优化靶向神经调节治疗策略以及深入理解外周刺激引发的环路水平可塑性具有重要意义。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

电针是传统针灸的一种现代改良形式，通过在特定穴位的针具上施加可控的电流，被公认为能够调节参与疼痛处理、运动控制和自主功能的神经回路。其作用机制被认为涉及由外周感觉神经（主要是Aδ和C纤维）激活所引发的复杂信号级联反应，导致神经递质（如阿片类物质、5-羟色胺、GABA）的释放，并继而在脊髓、脑干和皮层水平产生调节作用1,2。其中涉及的关键结构包括躯体感觉皮层。在负责处理触觉和伤害性信息的S1皮层中，电针可能影响局部的抑制-兴奋平衡以及长距离功能连接3,4。然而，由于前述方法学上的限制，电针刺激期间及刺激后即刻，S1皮层内不同神经元群体（如锥体神经元、中间神经元）及各皮层层次的激活/抑制精确时间序列仍基本未被阐明5,6。理解这些实时动态对于优化电针参数并预测治疗效果至关重要。

研究电针（EA）对皮层环路神经调节作用的传统方法，如行为学研究和死后分析，虽能提供有价值的见解，却无法以高时空分辨率捕捉实时神经活动7,8。为克服这些局限，活体（in vivo）双光子钙成像技术成为一种强有力的替代手段，可在刺激过程中直接可视化神经元群体动态8,9。该技术在慢性纵向研究中具有无可比拟的优势，使研究者能够在清醒、自由活动的动物中，以单细胞分辨率观察皮层各层中快速且分布广泛的神经活动。与虽具高时间分辨率但空间覆盖有限的急性电生理记录相比，双光子成像可在限定视野内同时监测数百至数千个神经元的大规模活动9,10。此外，相较于在全脑覆盖方面表现优异但时间尺度较慢且缺乏细胞特异性的功能性磁共振成像（fMRI），双光子钙成像能够在与突触及环路水平过程相关的时间尺度上，对特定神经元群体的活动进行精细检测11,12。因此，双光子成像技术在填补我们对周围性电针刺激如何转化为时空精确的皮层激活模式这一关键认知空白方面具有独特优势，尤其适用于初级躯体感觉皮层（S1）等脑区。作为躯体感觉信息处理的主要中枢（包括来自穴位的信号），且鉴于电针可显著调节其活动，S1是研究电针诱导皮层环路动态的理想切入点。

双光子激光扫描显微镜（2PLSM）结合基因编码的钙离子指示剂（GECIs，例如GCaMP6），为神经科学领域提供了一种革命性的工具。它能够以细胞级和亚细胞级的特异性，在活体（in vivo）条件下实现对神经活动的长期、高分辨率成像13。GECIs的荧光强度与细胞内钙瞬变呈正比，可作为神经元放电的可靠代理指标14。关键的是，2PLSM采用近红外激发光，相较于传统显微镜具有更优的穿透深度（可达数百微米），从而能够观察皮层表层甚至较深层（如L2/3、L4、L5层）的神经活动。其固有的光学切片能力可最大限度减少非焦平面的荧光干扰和光损伤，因此非常适合持续数周乃至数月的纵向研究15,16,17。该技术代表了电觉（EA）研究领域的重大突破，有望从根本上改变我们对该领域的认知，能够在刺激过程中同步追踪特定皮层体积内数百至数千个单个神经元在毫秒时间尺度上的动态活动。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有实验均使用8-12周龄的转基因Thy1-GCaMP6f小鼠18。所有实验操作和动物护理程序均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》的规定，并经华中科技大学实验动物护理与使用委员会（IACUC；方案批准号：3603）批准。所有努力均致力于减少使用动物的数量及其所受的痛苦。图1展示了实验装置的示意图。

1. 慢性颅窗植入

  1. 麻醉诱导与立体定位固定
    1. 将8至12周龄的Thy1-GCaMP6f小鼠放入诱导室，以1 L/min的流速通入4-5%（体积比）异氟烷与100%医用级氧气的混合气体，开始麻醉。
    2. 当小鼠失去翻正反射（通常在2-3分钟内），将其转移至集成于数字立体定位仪上的恒温加热垫（维持在37 °C）。
    3. 使用输送1.5-2.0%异氟烷的鼻罩维持手术麻醉状态。双眼涂抹眼用软膏（如Puralube Vet Ointment），防止角膜干燥。
    4. 小心地将无创耳杆插入外耳道，确保对称放置，避免施加过大压力导致组织损伤或鼓膜破裂19。
    5. 使用鼻夹固定上颌腭部，避免阻塞气道。
    6. 通过强捏脚趾无肢退缩反射、呼吸平稳缓慢（80-120次/分钟）确认深度麻醉。持续通过直肠探头监测核心体温，并相应调节加热垫。
    7. 皮下注射（s.c.）预先镇痛药物（如卡洛芬，5 mg/kg）及液体支持（无菌生理盐水，0.5-1 mL s.c.）。在整个准备过程中验证生理参数稳定（SpO₂ > 95%，呼吸规律）。
  2. 颅骨手术暴露
    1. 使用电动剪刀仔细剃除背部头皮毛发，随后涂抹脱毛膏以彻底去除残留毛发。用无菌生理盐水充分冲洗。
    2. 依次进行皮肤消毒：交替使用聚维酮碘（10%）和70%异丙醇棉片，各擦拭三次，最后使用葡萄糖酸氯己定（2%）溶液完成消毒。
    3. 使用无菌显微手术剪和精细镊子（Dumont #5），从眼睛后方约2 mm处开始，沿中线做矢状切口（长约15-20 mm），切开皮肤及皮下结缔组织，延伸至顶间-枕骨交界处。
    4. 使用显微止血钳或双极电凝（低功率设置）控制切口边缘的毛细血管出血。使用弯头显微牵开器或固定在周围铺巾上的5-0丝线，轻柔地将皮瓣向两侧牵拉。
    5. 完全暴露额骨、顶骨和顶间骨等整个背侧颅骨。在高倍放大镜（手术显微镜）下，使用微型刮匙（#00）仔细刮除附着于骨表面的纤维血管膜——骨膜。
    6. 采用轻柔的切向刮除动作，避免损伤颅骨或缝合线（前囟、后囟、矢状缝、冠状缝）。获得光滑无血管的骨面，这对精确开颅及后续粘合至关重要。
    7. 频繁使用无菌温热（37 °C）的0.9%生理盐水冲洗术区，以清除骨屑并保持组织湿润。
  3. S1后肢区域的立体定位靶向
    1. 使用高精度立体定位操纵臂，将精细手术标记笔或微型钻头的尖端准确定位于解剖参考点——前囟（冠状缝与矢状缝交点）。在显微镜下（10倍）确认坐标位置。
    2. 调节操纵臂，使标记点精确移动至前后方向（AP）-1.5 mm（位于前囟后方）和内外侧方向（ML）+2.0 mm（右半球），相对于中线（矢状缝）定位。
      注：该位置对应初级躯体感觉皮层（S1）的后肢代表区（S1HL）。
    3. 在暴露的顶骨表面该坐标处，轻轻刻画一个小型十字标记（<0.5 mm），确保可见但不穿透颅骨。
    4. 确认标记位置无主要表层血管穿过；若存在显著血管，可微调内外侧坐标（±0.1-0.2 mm）以避开，因为硬脑膜血管一旦破裂会导致大量出血，影响光学清晰度。
    5. 记录最终调整后的坐标。
  4. 精确开颅操作
    1. 将无菌一次性3 mm直径活检打孔器精确对准标记的S1HL坐标。施加稳定向下的压力并轻轻旋转，完全切割外层皮质骨形成环形切口。随后取出打孔器。
    2. 在立体定位臂上安装高速显微外科钻头（例如0.5-0.8 mm碳化钨钻头），并在持续0.9%生理盐水冲洗（用于冷却和清除碎屑）条件下，小心地减薄已划线区域内的颅骨。
    3. 采用短时脉冲方式，以轻柔的切向铣削动作，从边缘向中心系统性地钻磨。在放大镜下密切观察颅骨透光性变化。
    4. 一旦观察到下方硬脑膜出现轻微“泛红”（"blushing"）现象，即表明剩余骨层极薄（<50 µm），应立即停止钻孔。改用精细显微镊（Dumont #5/45）和显微剪，从中心向外呈放射状小心提起并剥离剩余的薄骨片。
    5. 保持硬脑膜完整——确保其呈透明光泽状，无撕裂或明显出血。如有轻微出血，立即用浸有0.9%生理盐水或凝血酶的无菌压缩泡沫棉片轻压止血。
    6. 用大量温热无菌人工脑脊液（aCSF）或0.9%生理盐水冲洗暴露的硬脑膜，彻底清除所有骨碎片。避免干燥17,20。
  5. 慢性颅窗植入与头固定杆安装
    1. 准备一个无菌的3 mm直径、#1厚度（约150 µm）圆形玻璃盖玻片。可选地，在其内表面涂覆一层薄硅胶弹性体，以提高光学清晰度并减少粘连。
    2. 使用精细镊子将盖玻片精确放置于开颅区域。按照制造商说明，准备一种快速固化、光固化的牙科水泥（如Metabond或Charisma）。
    3. 迅速操作（<90秒工作时间），在盖玻片周围边缘的干燥清洁颅骨表面涂布一圈薄水泥。确保水泥完全密封盖玻片边缘，但不得渗入其下方接触硬脑膜。
    4. 立即使用牙科固化灯（蓝光，450 nm）对每个象限照射20-30秒以固化水泥。随后使用较慢固化的自凝牙科丙烯酸树脂水泥（如Jet Repair Acrylic或Paladur，5 mL），分多层加固，构建一个坚固且低轮廓（<2 mm高）的水泥帽，其边缘应超出开颅区域数毫米，覆盖周围颅骨。
    5. 在水泥初始固化阶段，将一个轻质定制的不锈钢或钛合金头固定杆（例如长15-20 mm，带中央通孔）嵌入水泥帽中。
    6. 确保头固定杆平行于矢状缝，并居中位于颅窗上方，为后续在显微镜下进行头部固定提供刚性、平衡的固定点，同时不遮挡光学通路。
    7. 让水泥完全固化（≥15分钟）。确认完全止血且颅窗清晰透明21。
  6. 术后恢复与监测
    1. 水泥固化后，小心解除耳杆和鼻夹固定。停止异氟烷供应，给予100%氧气直至自主呼吸完全恢复。
    2. 术后立即皮下注射盐酸布托啡诺（0.05-0.1 mg/kg）以镇痛。将动物转移至预热（30-32 °C）、供氧并铺有清洁纸垫的恢复舱中。
    3. 持续监测直至恢复胸卧位和完全自主活动（通常30-60分钟）。术后24小时皮下注射第二剂卡洛芬（5 mg/kg）。如需，可皮下注射温热乳酸林格液（1 mL）以支持水合。
    4. 将小鼠单独饲养于标准笼具中，并提供筑巢材料，防止同笼动物破坏头部植入物。维持环境条件（22-24 °C，40-60%湿度，12:12小时明暗循环），自由获取食物和水凝胶。
    5. 术后7天内每日至少监测两次，观察疼痛/痛苦迹象（弓背姿势、毛发竖立、活动减少、体重下降>15%）、感染（脓性分泌物、肿胀、发红）、神经功能缺损或头杆松动情况。
    6. 在开始任何实验操作（成像或电生理记录）前，至少给予≥7天的恢复期，以确保急性手术炎症消退、正常行为恢复、类淋巴系统清除功能重建以及皮层基础活动稳定。每日称重以追踪恢复进程22。

2. 电针刺激

  1. ST36 穴位的精确定位
    1. 根据小鼠后肢已确立的解剖标志，定位 ST36（"Zusanli"）穴位。在进针前，触诊胫骨近端前侧，确定胫骨结节——即位于膝关节远端、髌韧带附着处的一个明显骨性突起。
    2. 使用精细卡尺或无菌标记笔，从胫骨结节中心向侧方（腓骨方向）测量 2 mm，向尾侧（后方）测量 2 mm。该位置对应胫骨前肌肌腹，浅位于腓深神经分支之上，且位于胫前动脉分叉点近端。
    3. 必要时可通过透光法确认该部位无主要浅表血管。
      注意：准确性至关重要，因为微小偏差（>0.5 mm）可能显著改变所刺激的神经结构以及初级体感皮层（S1）中的后续皮层反应。解剖标志的识别应由经过培训的人员一致执行，以尽量减少操作者间的差异23,24。
      注意：确保针体稳定的措施包括：(i) 进针并固定后，给予小鼠一段适应期，使其适应并减少初始挣扎；(ii) 电针刺激仪产生的振动频率（如 2 Hz）本身振幅较低，且所用细针（如 Φ0.16 mm）具有足够的刚性，可有效抵抗这种微弱振动；(iii) 实验过程中，操作者持续监测针尖位置。若观察到动物活动导致针体明显移位，则相关试验数据将被剔除。
  2. 无菌进针技术
    1. 皮肤消毒后（交替使用 70% 乙醇和氯己定擦拭），将一根无菌一次性不锈钢针灸针（标称直径：0.18 mm，相当于 36 号针；长度：13 mm）垂直刺入已标记的 ST36 穴位皮肤。
    2. 以平稳动作配合轻柔旋转，将针体依次穿过皮肤、皮下组织，进入下方的胫骨前肌，以最大程度减少组织损伤。
      注意：目标进针深度为皮肤表面下 3 mm。此深度可有效激活Ⅱ/Ⅲ类肌梭传入纤维（Aδ 纤维）以及可能的躯体小直径纤维，同时避免接触下方胫骨或深层神经血管束。
    3. 使用小型无菌粘性敷料或定制夹具牢固固定针柄，防止在后续电刺激或轻微肢体活动过程中针体脱落。
    4. 进针时若观察到轻微、短暂的局部肌肉颤动，可作为针体正确进入肌肉组织的生理学指标，用于验证针体位置的稳定性。
    5. 全程严格遵守无菌操作规范，以预防感染，尤其在慢性刺激范式中尤为重要23。
  3. 电针刺激参数设置与实施
    1. 将已插入针具的绝缘针柄连接至可编程电针刺激仪（如 HANS 穴位神经刺激仪，型号 LH202）的阳极（+）输出通道。
    2. 将参考阴极（-）电极（通常为涂有导电凝胶的小型不锈钢板或夹式电极）置于同侧后足（如足跟附近的跖面）。
    3. 确保两电极接触良好且阻抗较低（<5 kΩ）。设置刺激仪输出双相方波脉冲（正负相平衡），以最小化电极极化和组织损伤。
    4. 设定刺激模式为疏密波模式：交替输出 2 Hz（低频）持续 3 秒，随后 100 Hz（高频）持续 3 秒。
      注意：这种复合频率模式（常记为 2/100 Hz）经实证表明，相较于单一频率，能更有效地促进中枢神经系统内源性阿片肽（如 β-内啡肽、脑啡肽）和单胺类神经递质（如 5-羟色胺、去甲肾上腺素）的释放。
    5. 从 0.1 mA 开始逐步调节电流强度，直至肉眼观察到轻微、有节律的足部抽动（脚趾或踝关节屈曲）——在轻度麻醉的成年小鼠中通常在 1.0 mA 左右达到。该抽动阈值表明已充分募集运动传出纤维及相关的粗直径传入纤维（Aβ 纤维），证实了生理激活的有效性，同时不会引起痛苦或剧烈挣扎。在整个 20 分钟刺激过程中维持此校准后的电流强度25,26。
  4. 关键操作对照与生理监测
    1. 刺激伪影的消除
      1. 将电针导线与成像设备/前置放大器在物理上分离。
      2. 实施可靠接地：将刺激仪的接地端连接至专用大地接地点，并确保显微镜支架和动物加热垫共用同一接地点。
      3. 若条件允许，将刺激脉冲与显微镜的消隐信号进行时间同步，或采用事后信号处理方法从钙信号轨迹中去除残余电伪影。
    2. 生理稳定性
      1. 在整个 20 分钟电针刺激期间，持续监测核心体温（通过反馈控制加热垫维持在 37.0 ± 0.5 °C）、呼吸频率（80–120 次/分钟）和血氧饱和度 SpO₂（>95%）。
      2. 维持轻度异氟烷麻醉（1.0–1.5%），以确保在联合成像与刺激过程中动物不动。持续观察诱发的足部抽动；若抽动减弱或消失，应检查针体接触状态和阻抗，并轻微调整电流强度（≤0.1 mA 增量），以维持一致且轻微的运动激活。
      3. 一旦出现痛苦迹象（如呼吸急促、剧烈挣扎），应立即停止刺激。
    3. 可重复性
      1. 在所有动物和实验中使用相同类型的针具、进针深度、刺激仪型号以及校准方法（以足部抽动阈值为准）。记录每位受试动物最终使用的刺激强度。
      2. 刺激结束后，至少留出 5 分钟恢复期，方可终止麻醉或进行其他操作27,28。

3. 电针期间的双光子成像

  1. 动物准备、头部固定与生理维持
    1. 术后恢复至少7天后，使用植入的头部固定杆，将Thy1-GCaMP6f小鼠固定于定制设计的减振固定装置中，该装置安装在电动XY平台上。
    2. 将动物舒适地置于低摩擦、气浮式圆柱形跑步机上，允许后肢自由活动。通过鼻罩持续输送0.5–0.8%异氟烷（溶于100% O₂）以维持轻度外科麻醉。此较低浓度的异氟烷可最大限度减少神经活动抑制，同时确保动物静止，以满足高分辨率成像需求。
    3. 持续监测并记录核心体温（通过反馈控制加热垫维持在37.0 ± 0.2 °C）、呼吸频率（100–140次/分钟）和外周血氧饱和度（SpO₂ > 95%）。
    4. 涂抹眼用凝胶，防止长时间成像过程中角膜干燥。确保与S1HL颅窗同侧的后肢可接触，以便在ST36穴位插入电针（EA）针头。
    5. 头部固定后，给予15–20分钟生理稳定期，再开始成像29。
  2. 光学定位与II/III层成像优化
    1. 精确定位焦平面，以获取高质量的神经元信号。按以下验证流程操作。
      1. 将激光功率调至较低水平（通常为成像功率的10–20%，例如5–10 mW），以避免在定位焦平面过程中造成不必要的光漂白和光损伤。
      2. 使用双光子显微镜的Z轴驱动装置，以微米级步长缓慢移动物镜。从颅窗表面开始，逐步深入脑组织。
      3. 在实时预览模式下，根据步骤3.2.1.4和3.2.1.5所述的视觉指标识别焦平面。
      4. 对于神经元胞体层的正确焦平面：图像应显示清晰、明亮、点状结构（神经元胞体），呈圆形或椭圆形，背景对比度良好。确保细胞边界清晰，并呈现明显的"盐-胡椒"外观。
      5. 对于错误的焦平面：若图像模糊或均匀，缺乏明确定义的点状结构，则表明焦点位于无胞体区域。若可见大而暗、无结构的血管阴影，则识别为血管层。
    2. 荧光基线的验证
      1. 在施加任何实验刺激前，确认健康且稳定的荧光基线，以确保后续钙信号（ΔF/F）的合理解释。执行步骤3.2.2.2–3.2.2.4。
      2. 将激光功率调整至正式成像水平（例如30–50 mW）。
      3. 以快速、低分辨率预览模式采集数秒图像。
      4. 观察实时显示的平均荧光强度（或直接监控图像亮度）。在进入实验数据采集前，确认信号稳定，无快速光漂白迹象。
    3. 将成像视野中心对准颅窗区域。
      1. 在物镜与盖玻片之间涂抹超声耦合凝胶或蒸馏水以实现浸没耦合。使用红外Dodt梯度反差或落射荧光照明，识别表面血管结构，并调整视野（FOV），避开直径大于>20 µm的大血管。
      2. 切换至双光子激发模式，使用可调谐飞秒脉冲Ti:Sapphire激光器。将激发波长设为920 nm——此波长最适于激发GCaMP6f（峰值约920 nm），同时相比更短波长可减少绿色自发荧光和光损伤。
      3. 逐步增加激光功率（通常在样品处测得为20–50 mW），同时透过透明硬脑膜聚焦至皮层表面（软脑膜）。使用压电纳米聚焦装置调节物镜Z轴位置，达到软脑膜下200 ± 10 µm深度，对应皮层II/III层。
      4. 通过特征性神经元密度和形态确认深度：密集分布的小至中等大小锥体神经元胞体（直径10–15 µm），可见顶树突。
      5. 优化激光功率和光电倍增管（PMT）增益设置，以获得强基线GCaMP6f荧光（F0），避免信号饱和（像素强度约为探测器最大值的50–70%），并尽量降低背景噪声30,31。
        注：成像期间，920 nm激发光在物镜处的平均功率精确维持在30–50 mW。该功率水平通过在经历相同手术处理的动物组织上进行的预实验验证，确保在长达25分钟的扫描时间内有效获取信号，同时最小化光损伤和荧光光漂白。
  3. 高速钙成像采集方案
    1. 配置共振扫描镜以实现高速帧采集：
      帧尺寸：512 × 512像素（典型视野：约450 × 450 µm，像素大小约0.88 µm）
      帧率：7帧/秒（fps），通过双向扫描实现（约14 kHz行频）。该速率可充分采样GCaMP6f的衰减动力学（τ~500 ms），同时平衡信噪比（SNR）并最小化光漂白。
      ​像素驻留时间：约0.8 µs（在7 Hz下优化SNR）。
    2. 使用采集软件（如ScanImage、Prairie View）启动连续时间序列采集。在电针刺激开始前记录5分钟基线期，以建立刺激前神经活动动态（F₀）。
    3. 在精确时间t = 5分钟时，开始在ST36穴位施加电针刺激，同时成像持续不间断。在整个20分钟电针刺激期间连续采集数据。总扫描时长 = 25分钟（1500秒，约10,500帧）。
    4. 将数据保存为多页TIFF堆栈或专有二进制格式，并通过TTL输入通道将时间戳与电针触发脉冲同步嵌入。
    5. 实时监测激光功率稳定性与焦点漂移（<2 µm）；仅当发生显著漂移（例如>5 µm）时短暂暂停并重新对焦，并记录该时间点32,33。
  4. 严格的运动校正与空间配准
    1. 采集完成后，使用MATLAB中的NoRMCorre（非刚性运动校正）处理原始成像堆栈，以消除残余微小运动（如呼吸、脉搏）引起的空间伪影。
    2. 首先，将堆栈分割为重叠的空间区块（例如64 × 64像素，50%重叠）。对每个区块，通过平均基线期的高信噪比帧计算参考模板。
    3. 基于傅里叶的互相关方法，计算每帧相对于模板的X-Y平移偏移量，并通过亚像素插值进行校正。
    4. 随后处理非刚性形变：使用分段仿射变换（平移+剪切）对区块内的局部畸变建模。迭代更新模板以提高配准精度。关键参数：
      max_shift：20像素（平移限制）
      max_dev：3像素（最大非刚性偏差）
      ​bin_width：50帧（模板更新的时间分箱）
    5. 通过检查帧间相关性曲线图（校正后应稳定接近1.0）和生成平均图像投影差异图（校正前后对比）来可视化校正效果。保存运动校正后的堆栈用于下游分析。此步骤对钙瞬变的像素级分析至关重要，尤其是在电针诱导的细微肢体运动期间。

4. 时空动态分析

使用 Python 中的 Suite2p 流程（v0.12.3）对运动校正后的成像图像序列进行自动神经元分割和信号提取。主要处理步骤包括：

  1. 空间足迹识别
    1. 应用约束性非负矩阵分解（CNMF）将图像序列分解为空间成分。
    2. 使用基于相关性的方法初始化感兴趣区域（ROIs）：合并具有空间互相关的像素 > 0.7 和局部信噪比 > 4 划分为候选感兴趣区域（ROIs）。根据大小（8-15 µm 直径）和圆形度（紧凑性阈值）将体细胞ROIs与树突/轴突区分开 >0.6).
  2. 神经纤维网污染校正
    1. 为每个 ROI 定义一个同心神经毡环状区域（内半径：1.5× ROI 半径，外半径：2.5× ROI 半径）。
    2. 计算神经毡系数（r_神经毡通过最小二乘回归：
      F_corrected(t) = F_raw(t) - 0.7 × F_neuropil(t)
      （针对 Thy1-GCaMP6f 小鼠经实验验证的经验系数）。
  3. 信号解卷积
    1. 使用OASIS（基于ℓ₁正则化的反卷积）结合AR(2)噪声模型推断尖峰活动，以估计脉冲发放概率 S(t) 来自 ΔF/F 荧光变化轨迹：
      ΔF/F(t) = k ⋅ S(t) + b + ε
      其中“k”为钙瞬变核函数 ε 是高斯噪声。
  4. 质量控制
    1. 排除具有以下特征的 ROI SNR <3, 空间重叠 >30%，或 神经毡相关性 >0.3通过 Suite2p 图形用户界面进行视觉验证34.
      具体的操作步骤和界面元素如下所示 补充文件 1上述生成的运动校正TIFF文件被直接输入到Suite2p分析流程中。尽管Suite2p的集成环境包含其自身的刚性运动校正模块，但由于此前已应用了更为精确的非刚性校正，因此禁用了该冗余的内部校正步骤。自动提取的神经元感兴趣区域（ROI）可在此处找到 补充文件 2.

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结果

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S1 皮层的结构表征及基础神经活动
我们首先为成像实验建立了高保真的结构与功能基线。组织形态学分析揭示了未使用盖玻片（图 2A）与使用盖玻片（图 2B）的颅窗制备之间存在可辨别的结构差异。尽管盖玻片的应用引入了轻微的压缩伪影（箭头，图 2B），但它有效维持了感兴趣区域（ROI）的整体结构完整性，这对于稳定的慢性成像至关重要。随后对皮层柱进行的双光子 z 轴投影显示，从第 2/3 层（L2/3）延伸至第 5 层（L5）存在密集的高度分支的顶树突网络（虚线，图 2C-E）。树突棘的清晰可分辨性（插图，图 2C）进一步证实了高分辨率成像质量，为可靠的钙功能成像奠定了基础。在超过 90% 的 S1 神经元中观察到钙指示剂 GCaMP6s（绿色...

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讨论

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为了弥合在实时观察电针（EA）皮层效应方面的关键空白，我们提出了一项综合性的整合方案，该方案结合了用于光学观测的慢性颅窗植入、标准化的电针刺激，以及针对初级躯体感觉（S1）皮层的纵向双光子钙成像技术。

该整合方案在研究电针（EA）皮层效应方面相较于传统方法具有多项显著优势。首先，该方案提供了前所未有的时空分辨率，能够在电针刺激期间，同时捕捉S1网络中数百个神经元毫秒级的神经活动动态36。结合适当的标记方法，可揭示激活的精确时间序列、活动波的空间传播范围，以及不同神经元亚型之间的反应异质性。其次，慢性颅窗技术实现了纵向成像，使研究人员能够追踪S1区皮层表征和环路动态在多次电针干预后的演变过程37，从而可能揭示累积性镇痛或运动功能恢复等治疗效应背后的机制。第三，借助基因编码的钙指示剂（GECIs）和基因靶向技术所实现的细胞特异性，可深入探究不同神经元群体（如兴奋性锥体细胞与特定中间神经元亚型，包括PV+、SOM+或VIP+神经元）在电针干预下的差异性调控机制

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作得到中国国家自然科学基金（编号：82405550）的资助。我们感谢张实验室成员提供的有益讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
卡洛芬MCEN/A5 mg/kg 用于镇痛
数字立体定位仪RWDKopf Model 1900
电针刺激器HANS LH202 (2/100 Hz 双相脉冲)N/AHANS LH202 (2/100 Hz 双相脉冲)
异氟烷RWDR510-22-10医用级，以100%氧气为载体
微型钻孔系统RWD0.5 mm 碳化钨钻头，生理盐水冷却
聚维酮碘MCEHY-B223410% 溶液
ScanImageScanImagehttps://scanimage.org/
无菌生理盐水BeyuntianST341-500ml0.9% NaCl
手术显微镜Zeisshttps://www.zeiss.com/meditec/en/products/surgical-microscopes.html10-40× 放大倍数
Thy1-GCaMP6f 转基因小鼠Cygen55239788–12 周龄，雄性/雌性
双光子显微镜Nikon A1MPNikon A1MP钛宝石激光器（920 nm 激发）

参考文献

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