一种基于质谱的血浆蛋白质组学综合工作流程：系统性人类疾病生物标志物发现策略

摘要

血浆蛋白质组学通过微创采样实现系统性疾病的生物标志物发现。尽管血浆的复杂性给分析带来了挑战，本研究提出了一种优化的液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）工作流程，可提高蛋白质组覆盖度，降低变异度，增强可重复性，从而实现疾病样本与对照样本之间的精确比较。

摘要

血浆是血液的无细胞成分，提供了一种微创且富含生物分子信息的来源，非常适合用于系统性疾病的 исследовании。高通量蛋白质组学技术的出现，通过实现对循环蛋白质的大规模鉴定与定量，彻底改变了血浆分析。这些进展推动了生物标志物的发现，可用于多种疾病（包括癌症和炎症性疾病）的早期诊断、预后评估及治疗靶点的确定。然而，血浆本身固有的复杂性，以及样本制备和分析方法的不一致性，历史上一直限制了蛋白质组的覆盖范围和结果的可重复性。早期依赖粗制血浆分析的方法通常存在一致性差和显著的批次效应，阻碍了在不同临床队列间开展可靠的比较研究。

为了克服这些局限性，本研究引入了一种稳健且可扩展的血浆蛋白质组学工作流程。该方案整合了多项关键的预处理步骤，包括免疫耗竭、分子量截断过滤、冻干、蛋白质定量与归一化、酶解消化以及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。这一优化策略显著提升了蛋白质组的覆盖深度并降低了变异度，从而能够更准确、可重复地分析疾病病例与健康对照之间的差异蛋白表达。该工作流程为研究人员从血浆样本中生成高质量蛋白质组数据提供了有力平台，最终有助于推动基于生物标志物的诊断技术与个体化医学的发展。

引言

血浆是血液的无细胞成分，正日益被视为与疾病研究相关的生物信息储库。血浆携带大量种类繁多的循环生物分子，包括蛋白质、代谢物、脂质以及核酸，这些成分反映了机体的生理和病理状态。血浆的这种系统性特征使其成为研究多种疾病病理生理机制的理想生物样本，应用范围涵盖癌症、代谢性疾病及炎症性疾病等。使用血浆作为样本的一大优势在于其采集方法具有最小侵入性，可在临床环境中进行多次采样，这对于观察疾病进展或治疗反应至关重要。然而，血浆具有极为复杂的蛋白质组基质，其中白蛋白和免疫球蛋白等蛋白质的含量跨度超过十个数量级，从而掩盖了低丰度蛋白的鉴定¹。

在过去的二十年中，血浆蛋白质组学通过大规模蛋白质分析技术的进步，实现了对临床相关生物标志物的鉴定，例如β-人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）和肌钙蛋白I²。这些工具以高度敏感的信息作为输入，凭借其高通量特性，可实现对血浆蛋白质的大规模分析。随着液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）平台的发展，现在仅需10–50 µL血浆样本即可分析数千种蛋白质，检测动态范围跨越多个数量级^3,4。这推动了血浆蛋白质组学在转化研究中的广泛应用，包括疾病的早期检测、预后模型的优化以及新治疗靶点的发现⁵。

该领域的一个重要里程碑是人类血浆蛋白质组计划（Human Plasma Proteome Project, HUPO-HPPP）的建立，该计划系统性地编目了血浆蛋白质，并证明了血浆蛋白质组学作为一门成熟学科的可行性⁶。随后，临床蛋白质组肿瘤分析联盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium, CPTAC）采用了严格验证的实验方案和跨实验室研究，以解决早期蛋白质组学研究中困扰已久的可重复性问题⁷。这些举措凸显了标准化的必要性，并明确了关键实验步骤，包括统一的血浆处理流程、高丰度蛋白质的去除、酶解消化以及一致的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）参数。Geyer 及其同事最近的研究表明，在采用标准化方法时，可在大量个体中可靠地生成血浆蛋白质组特征谱，为群体水平的研究和生物标志物的验证提供了基础⁸。

血浆蛋白质组学的发展在很大程度上受到质量控制（QC）和性能指标被确认为实验设计关键组成部分的推动。传统上，消化效率、肽段鉴定率以及仪器性能的差异导致了不同研究之间的不一致，从而影响了结果的可重复性。为此，已有许多研究致力于解决这些问题。Gawor 等人提出了可量化的质量指标，用于评估样本制备和质谱性能，从而为评估蛋白质谱分析流程的稳健性提供了系统性方法⁹。Tsantilas 等人则开发了计算机化的基准测试工具，使研究人员能够在不同平台和实验室之间比较数据集，从而提高蛋白质组学数据呈现的透明度¹⁰。此外，方法学的进步，如免疫耗竭、尺寸排阻分级分离以及数据非依赖性采集（DIA），显著提升了蛋白质组覆盖度并减少了技术偏差^11,12。这些质量保证措施确保了血浆蛋白质组学数据的可重复性，并为未来的临床转化研究奠定了基础。

尽管取得了这些重要进展，血浆固有的复杂性仍然带来诸多挑战。直接分析粗制血浆通常会导致蛋白质组覆盖度不理想，因为高丰度蛋白质会掩盖低丰度分析物，而后者中许多正是最具潜力的生物标志物候选分子。此外，由于蛋白质定量的变异性、消化不完全以及纯化不充分等技术因素所引起的技术偏差，可能导致批次效应并降低队列之间的可比性¹³。这些局限性凸显了对高度优化实验流程的需求，以在蛋白质组深度、可重复性和可扩展性之间实现平衡。本研究方案通过展示一种优化的血浆蛋白质组学工作流程来满足这一需求，该流程结合了免疫耗竭、分子量截断过滤、冻干、蛋白质归一化与定量、酶解消化以及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。通过提高蛋白质组覆盖度并减少技术变异，该方法框架能够在疾病组与对照组之间实现一致的相对定量。通过引入可扩展性并兼容下游分析，该工作流程为从血浆蛋白质组学数据中提取具有临床意义的信息提供了一种实用且可重复的方法。

方案

本方案概述了一种简化的流程，旨在增强系统性炎症性疾病生物标志物发现的血浆蛋白质组学分析^14,15。本研究遵循机构伦理委员会批准的程序，并符合1975年（经2000年修订）的《赫尔辛基宣言》。所有参与者均签署了知情同意书。首先，血浆样本经过免疫耗竭处理以去除高丰度蛋白，随后通过基于分子量的过滤降低样本复杂性。接着，样本被冻干并进行定量，以确保蛋白浓度满足后续处理的要求。在完成归一化后，蛋白质经胰蛋白酶消化生成适合分析的肽段。最后，采用质谱技术检测和定量低丰度蛋白，从而实现健康状态与疾病状态之间可靠的比较分析（图1）展示了血液蛋白质组学流程。

1. 样本采集：

1. 由经过培训的采血员在无菌条件下通过肘前静脉穿刺，使用乙二胺四乙酸（EDTA）真空采血管从参与者处采集 3 mL 血液。
2. 为分离血浆，将样本在固定角转子（12 × 15 mL）中以 704 g 离心 10 分钟。将血浆样本于 -80 °C 保存，直至后续检测。

2. 免疫耗竭

注意：免疫耗竭是一种基于亲和层析的方法，用于选择性去除血清、血浆和脑脊液（CSF）等生物液体中的高丰度蛋白。离心柱中固定有特异性抗体，可靶向结合并捕获14种常见的高丰度蛋白，包括白蛋白、免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）、转铁蛋白和补体C3。这些高丰度蛋白被保留在离心柱中，而低丰度蛋白则通过并进入后续分析。该技术通过降低样本复杂性，提高潜在生物标志物的检出率，从而增强蛋白质组学分析效果。此方法在血浆蛋白质组学研究中被广泛应用，以提升检测的灵敏度和可重复性^16,17。

1. 色谱柱准备
   1. 从冰箱中取出0.45 mL离心色谱柱，置于室温下平衡。
   2. 根据处理的样本数量配制缓冲液A（用于平衡/上样/洗涤）和缓冲液B（用于洗脱）。每10 µL血浆样本需使用约5 mL缓冲液A和2 mL缓冲液B。将缓冲液倒入50 mL无菌离心管中。
   3. 标记两个无菌Luer-Lok 5 mL注射器，分别用于缓冲液A（标记为A）和缓冲液B（标记为B）。
2. 血浆样本准备
   1. 将每10 µL血浆样本用190 µL缓冲液A稀释至终体积200 µL。
      注意：在缓冲液A中加入蛋白酶抑制剂，以防止处理过程中血浆蛋白降解。
   2. 血浆样本中可能含有颗粒物，易堵塞色谱柱。为防止堵塞并提高样本澄清度，将稀释后的样本通过0.22 µm离心滤膜在4 °C、16,000 ×g条件下离心1分钟。
3. 色谱柱组装
   1. 取下色谱柱的顶部盖和底部盖，并妥善保存以备后续使用。
   2. 将Luer-Lok接头安装到离心色谱柱上。
   3. 用标记为“A”的注射器吸取4 mL缓冲液A，并将其连接至Luer-Lok接头。
   4. 缓慢将缓冲液A通过色谱柱，使树脂充分平衡并排出可能滞留的空气。
   5. 用无菌微量移液器吸除色谱柱顶部多余的缓冲液。
   6. 取下Luer-Lok接头，将离心色谱柱放入已标记为F1的螺口收集管中。
4. 样本上样与组分收集
   1. 将200 µL过滤并稀释后的血浆直接加至树脂床表面。
   2. 在4 °C、100 × g条件下离心1分钟。离心时保持色谱柱敞口或松盖，以确保液体顺畅流动。
   3. 收集穿流组分F1至已标记的收集管中。确保离心后树脂床和烧结滤片保持湿润。
   4. 让色谱柱在室温下静置5分钟。
5. 洗涤及穿流组分回收
   1. 向树脂床上加入400 µL缓冲液A，在4 °C、100 ×g条件下离心2.5分钟。将洗出液加入F1收集管中。
   2. 将色谱柱转移至另一个标记为F2的新收集管中。
   3. 再次加入400 µL缓冲液A，在4 °C、100 × g条件下离心2.5分钟。将洗出液收集至F2管中。
6. 结合蛋白的洗脱
   1. 将色谱柱从F2管中取出，并安装Luer-Lok接头。
   2. 用标记为“B”的注射器吸取2.5 mL缓冲液B，并将其连接至色谱柱。
   3. 缓慢推动缓冲液B通过色谱柱，将结合的高丰度蛋白洗脱至新的收集管中。
      注意：若需进一步分析，请保存结合组分；否则应妥善弃置。
7. 色谱柱再平衡
   1. 将含缓冲液B的注射器从色谱柱上取下，换上含5 mL缓冲液A并标记为“A”的注射器。
   2. 以每分钟0.5 mL的流速缓慢推动缓冲液A通过树脂床，使色谱柱重新平衡。
      注意：切勿让树脂床或烧结滤片干燥。储存期间应在滤片上方保留少量缓冲液。
   3. 平衡完成后，色谱柱即可用于下一个样本处理。
8. 后续应用
   1. 为最大程度回收低丰度蛋白，建议合并F1和F2穿流组分。
      ​注意：若需进行差异分析，F1和F2也可分别处理。所加缓冲液总量为1 mL，因此合并后的F1体积约为850 µL，以确保良好的回收率。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析粗制血浆、穿流液和洗脱液，以确认穿流液中已去除前14种高丰度蛋白。上样时取12.5 µL F1穿流液、粗制血浆和洗脱液，与Laemmli上样缓冲液按2:1比例混合，使总上样体积为25 µL。

3. 使用 5 kDa 离心浓缩器进行蛋白质浓度测定

注意：使用5 kDa离心浓缩管浓缩样品基于尺寸排阻和分子过滤原理，可在单个管中快速浓缩并高效回收目标生物分子。该方法通过去除溶剂实现蛋白质浓缩，或对蛋白质溶液进行缓冲液置换或脱盐。

1. 将最多4 mL的蛋白质样品加入离心浓缩管中。
2. 将离心浓缩管放入冷藏离心机中。
3. 在 5,000 离心 × g 在 10 °C 下 30 分钟，或直至达到目标体积减少量（例如，30× 浓度）达到。
4. 从离心机中取出离心浓缩管，使用微量移液器从截留室底部回收浓缩后的样品。为确保良好的回收率，预计可获得约150 µL 浓缩物来自总共 850 µL蛋白样品
   注意：离心过程中应确保膜不干燥，以维持蛋白质的完整性和回收效率。

4. 脱盐和缓冲液置换

1. 弃去浓缩器底室的滤液。
2. 向离心管中加入与截留液体积相等的 50 mM 碳酸氢铵缓冲液（pH 7.2–7.4）。（例如，若截留液为 150 µL，则加入 150 µL 缓冲液）
3. 再次在 10 °C 下以 5,000 × g 离心，直至恢复原始浓度。
4. 重复此缓冲液置换步骤三次，以去除约 99% 的小分子污染物（如盐类或尿素）。
5. 使用真空离心浓缩仪冻干蛋白样品以进行浓缩。
   注意：根据下游应用所需的脱盐程度调整循环次数。

5. 使用二辛可宁酸（BCA）法进行蛋白质定量

注意：使用BCA蛋白检测试剂盒测定样品的蛋白浓度，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准品。BCA检测是一种基于双辛可宁酸的比色法，具有去垢剂兼容性，可用于总蛋白的检测与定量。该方法依赖于蛋白质在碱性环境中将Cu²⁺还原为Cu⁺（双缩脲反应），随后利用含双辛可宁酸的试剂对亚铜离子（Cu⁺）进行高灵敏度、高选择性的比色检测。该检测可形成紫色复合物，由一个亚铜离子与两个BCA分子螯合而成。BCA检测对BSA具有稳定且线性的响应，可确保标准曲线的可靠性。尽管已知不同蛋白质在BCA检测中的响应存在差异，但使用BSA可实现不同样品间可重复的相对定量。由于本研究的目的是实现等量蛋白上样的归一化，而非对每种蛋白进行绝对定量，因此基于BSA的校准提供了最稳健且可重复的方法。

1. 实验步骤
   1. 将每种BSA标准品（工作浓度范围20-2000 µg/mL）各25 µL以及待测蛋白样品加入96孔板的指定孔中。
   2. 向每个孔中加入200 µL BCA工作液。
   3. 使用微量板振荡器充分混匀30秒。
   4. 覆盖板孔，于37 °C孵育30分钟。
   5. 将板冷却至室温。
   6. 使用酶标仪在562 nm处测定吸光度。
2. 数据分析
   1. 从所有样品和标准品的吸光度值中减去空白孔（零蛋白）的平均吸光度。
   2. 绘制吸光度对BSA浓度（微克/微升）的标准曲线。
   3. 利用该曲线的回归方程计算未知样品中的蛋白浓度。

6. 蛋白质浓度的标准化

1. 实验步骤
   1. 使用适当的定量方法测定每个血浆样品的蛋白浓度。
   2. 记录每个样品的浓度和总体积。
   3. 配制 50 mM 碳酸氢铵缓冲液（pH 7.8）作为稀释液。
   4. 使用公式 C₁V₁ = C₂V₂ 计算所需的稀释倍数。
   5. 对于浓度为 1.3 mg/mL、体积为 100 µL 的样品，计算达到 1 mg/mL 所需的终体积：[V₂ = \frac{1.3 \times 100}{1} = 130\ \mu L]
   6. 通过从终体积中减去初始体积，计算需加入的缓冲液体积：缓冲液体积 = 130 µL − 100 µL = 30 µL。
   7. 向 100 µL 血浆样品中加入 30 µL 的 50 mM 碳酸氢铵缓冲液（pH 7.8）。
   8. 通过移液或短暂涡旋轻轻混匀样品。
   9. 确认最终体积为 130 µL，蛋白浓度已标准化至 1 mg/mL。
   10. 继续进行后续的蛋白质组学样品制备。
       注意：应根据 BCA 测定结果准确计算所需稀释倍数，以确保浓度调整精确。每一步均经过验证，相关数据见补充材料（补充表 1）。

7. 样品制备与胰蛋白酶消化

1. 蛋白质还原
   1. 向碳酸氢铵缓冲液中的蛋白质溶液中加入适量的还原剂（例如，1,4-二硫苏糖醇 [DTT]），使其终浓度达到 100 mM。
   2. 在恒温混匀仪或加热块中于 60 °C 孵育 30 分钟。
      CAUTION: DTT 具有刺激性，应在通风橱内戴手套操作。
      ​NOTE: 有关消化所用胰蛋白酶的附加信息见于材料表。简而言之，使用测序级甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）处理的胰蛋白酶（以消除糜蛋白酶活性），确保对赖氨酸和精氨酸残基的高特异性切割。酶活性根据制造商说明进行验证，相当于每毫克蛋白约 1 单位的 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）活性。关于 DTT 和碘乙酰胺（IAA）的浓度，我们确认 100 mM DTT 和 200 mM IAA 指的是储备液浓度，而非反应中使用的终浓度。还原和烷基化步骤中的实际工作浓度处于标准范围内（通常分别为 5–10 mM DTT 和 10–20 mM IAA）。
2. 半胱氨酸残基的烷基化
   1. 还原完成后，将样品在室温下冷却 5 分钟。
   2. 短暂离心，使冷凝液聚集于离心管底部。
   3. 加入用 50 mM 碳酸氢铵（ABC）缓冲液配制的 200 mM IAA，以烷基化还原后的半胱氨酸残基。
   4. 在避光条件下室温孵育 30 分钟，防止 IAA 降解。
      ​NOTE: 碘乙酰胺对光敏感且可能具有毒性；应避免光照，并在弱光条件下操作。
3. 酶解消化
   1. 使用前立即用 50 mM ABC 缓冲液配制测序级修饰胰蛋白酶。
   2. 按胰蛋白酶与蛋白质质量比 1:25（w/w）向各样品中加入胰蛋白酶。
   3. 在 37 °C 孵育 17 小时，以确保完成酶解消化。
      ​NOTE: 延长消化时间可能导致过度消化；孵育期间应确保温度稳定。
4. 终止反应
   1. 向每个样品中加入甲酸，使其终浓度达到 1.0%（v/v），以终止酶促反应。
   2. 在 37 °C 孵育 20 分钟，使残留的胰蛋白酶变性并稳定肽段混合物。
      ​CAUTION: 甲酸具有腐蚀性，操作时应佩戴适当的个人防护装备（PPE），并在化学通风橱中进行。
5. 肽段回收
   1. 将消化后的肽段混合物在室温下以 3500 g 离心 12 分钟，去除不溶性物质。
   2. 小心转移含有消化肽段的澄清上清液至自动进样瓶中，避免扰动沉淀。
   3. 将肽段溶液储存于 -20 °C，待后续进行 LC-MS/MS 分析。
6. LC-MS 分析前准备
   1. 将肽段样品直接加载至配备离子淌度的 LC-MS 系统，用于肽段分离与分析。
   2. 确保所有样品瓶密封良好，防止蒸发和污染。

8. LC-MS/MS 分析

1. 肽段加载与脱盐
   1. 加载 1 µg 肽样品注入进样环，采用部分进样环进样模式。
   2. 使用C18捕获柱通过以15的流速用含0.1%甲酸的水溶液冲洗来脱盐肽段 µL/min，持续 1 分钟。
      注意：运行全程使用含0.1%甲酸的水作为溶剂A，含0.1%甲酸的乙腈作为溶剂B。
2. 肽段分离
   1. 将捕获柱与分析用反相C18柱串联连接。
   2. 使用线性梯度在55分钟内从3%到40%溶剂B进行洗脱，流速为300 nL/min。
   3. 用80%溶剂B冲洗色谱柱7.5分钟，以去除残留组分。
   4. 在下一次进样前，用3% 溶剂B重新平衡色谱柱。
   5. 将色谱柱温箱保持在 35 °C，自动进样器温度为4 °运行过程中保持温度为 C。
      注意：样品之间需插入空白进样，以尽量减少残留。
3. 质谱采集参数
   1. 洗脱肽的质谱分析
      1. 设置超高效液相色谱系统，并将其直接连接至高分辨质谱仪。
      2. 使用质谱软件控制系统。
      3. 确保质谱仪配置为混合型四极杆-离子淌度-正交加速-飞行时间（oa-TOF）仪器。
      4. 确认所有氮气和锁喷雾气体连接在启动操作前均已牢固连接且无泄漏。
         警告：操作高压连接和加压气体时，须遵守实验室安全标准。
   2. 电离设置
      1. 使用双电喷雾离子源，以正电喷雾电离（ESI）模式操作质谱仪。
      2. 将纳米电喷雾电离毛细管电压设置为 3.4 kV。
      3. 将样品锥电压调整为 40 V，提取锥电压调整为 4 V。
      4. 将离子迁移谱（IMS）氮气流速设置为 90 mL/min。
      5. 检查喷雾稳定性，并在继续操作前确保离子流稳定。
   3. 离子淌度分离
      1. 在离子传输过程中，将 IMS 离子导引脉冲高度设置为 40 V。
      2. 将 IMS 离子导引速度调整为 800 m/s。
      3. 在整个离子迁移谱（IMS）循环中，将行波电压从8 V线性 ramp 升至20 V，以实现基于迁移率的最优离子分离。
         注意：确保 IMS 气体流速稳定；波动可能影响离子分离及漂移时间的重复性。
   4. 锁质量校准
      1. 使用 2 校准飞行时间（TOF）分析仪 µ克/µL 碘化钠（NaI）溶液
      2. 将校准范围设置为检测 50 m/z 至 2000 m/z 之间的离子。
      3. 每45秒使用双电喷雾离子源通道获取锁质量参考谱图，以进行实时质量校正。
      4. 验证校准曲线在规定范围内达到质谱质量准确性 ±5 ppm，然后进行数据采集。
4. 数据采集
   1. 以连续模式采集数据，交替执行两个功能：
      1. 功能1（低能量质谱）：记录低能量的前体离子谱图。
      2. 功能2（高能量HDMSE）：在较高碰撞能量下结合离子淌度分离记录碎片离子谱图。
   2. 在功能2中，将离子阱区域的碰撞能量设置为4 eV。
   3. 在传输区域将碰撞能量从 20 eV 逐步增加至 45 eV，以实现肽段的可控碎裂。
   4. 将每个函数的光谱采集时间设置为 0.9 s，扫描间延迟设置为 0.024 s。
   5. 监测总离子流色谱图（TIC），以确认仪器在整个运行过程中的响应一致性。
   6. 将原始数据导入蛋白质组学分析软件（例如 Progenesis QI 或同等软件）。
   7. 使用默认的比对参考或手动选择的参考运行，对各次运行的色谱图进行比对。
   8. 使用精选数据库（例如，UniProt 人类数据库——仅限已审阅条目）鉴定肽段和蛋白质。
   9. 设置以下搜索参数：
      酶：胰蛋白酶
      固定修饰： Carbamidomethylation (C)
      可变修饰：氧化（M）
      肽段耐受性：根据仪器分辨率而定
      允许的未完全酶切：1
      错误发现率（FDR）：≤ 1%
   10. 使用以下方法进行归一化 归一化至所有蛋白质 方法
   11. 应用过滤阈值：每种蛋白质至少包含2个肽段，至少1个独特肽段，变化倍数≥1.5，且校正后p值 <0.05.
       注意：这是通用的实验室安全指南——务必始终遵守机构的环境健康与安全（EHS）规定。 & 安全）法规及当地法律法规要求。
5. 质量控制
   1. 使用 NaI 标准品进行运行前和运行后的校准检查，以确认质量准确性。
   2. 确保锁质量校正参考在整个分析过程中保持稳定。
   3. 评估重复进样，以确认保留时间、漂移时间和谱图强度的可重复性。
      警告：碘化钠具有刺激性。操作时应戴手套，避免吸入或与皮肤接触。
      注意：参见 补充文件 1 处理废弃物时请遵循相关处置指南。操作血浆样本时，务必在低温环境或冰上进行，以防止蛋白质降解。处理生物样本和缓冲液时，应佩戴丁腈手套、实验服及护目装备。离心步骤需使用已预冷至4℃的冷藏离心机进行。 °C. 确保使用的所有离心管和注射器均为无菌且正确标记，以避免交叉污染。配制缓冲液时务必使用蛋白质组级水。

结果

采用离心柱处理血浆样本，选择性去除14种高丰度蛋白，即白蛋白（albumin）、IgG、IgA、转铁蛋白（transferrin）、结合珠蛋白（haptoglobin）、抗胰蛋白酶（antitrypsin）、纤维蛋白原（fibrinogen）、α2-巨球蛋白（alpha2-macroglobulin）、α1-酸性糖蛋白（alpha1-acid glycoprotein）、IgM、载脂蛋白AI（apolipoprotein AI）、载脂蛋白AII（apolipoprotein AII）、补体C3（complement C3）和转甲状腺素蛋白（transthyretin）。该去除非目标蛋白步骤对于增强后续蛋白质组学分析中低丰度生物标志物的检测至关重要。每个血浆样本（8–10 µL）经稀释后，通过0.22 µm离心过滤进行澄清，并在受控离心条件下通过亲和柱。收集穿流组分（F1和F2），代表富含低丰度蛋白的血浆，合并用于后续处理。合并后的穿流样本使用50 mM碳酸氢铵缓冲液（pH 7.2–7.4）进行缓冲液置换/脱盐，以确保与基于质谱的蛋白质组学分析兼容，所用装置为5 kDa截留分子量的离心浓缩管。该过程重复三次，通过电导率测定确认已去除超过9...

讨论

血浆作为一种生物基质，其内在复杂性给蛋白质组学分析带来了重大挑战。蛋白质浓度的巨大动态范围以及少数高丰度蛋白的存在，可能掩盖对临床相关低丰度蛋白的检测。在本研究中，我们采用了一种多步骤、标准化的样本制备流程，以选择性富集中等和低丰度蛋白，并确保样本间分析的一致性，从而克服上述不利因素。血浆蛋白质组学工作流程的每一步均经过优化，以控制技术噪声、提高检测灵敏度，并增强对系统性炎症及其他临床重要疾病相关蛋白组的覆盖。

免疫耗竭作为该流程的初始步骤，可有效去除血浆中丰度最高的14种蛋白质。通过比较性SDS-PAGE分析验证了耗竭效果，结果显示流出组分中的总蛋白浓度显著降低，并消除了强条带，从而证实了白蛋白、免疫球蛋白及其他高丰度组分的有效去除。该步骤增强了对中低丰度蛋白质（包括细胞因子、急性期反应物以及与疾病病理生理相关的分泌因子）的相对检出能力。然而，免疫耗竭方法已知存在若干缺点，包括非特异性共耗竭、柱容量有限，以及在大样本队列中定量重复性的潜在变异^17，18。本工作流程...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 kDa 分子量截留值离心浓缩管	安捷伦科技	5185−5991	用于缓冲液置换和去盐；可截留分子量大于5 kDa的蛋白质
碳酸氢铵（ABC）	Sigma Aldrich	货号：T6567	用于胰蛋白酶消化
缓冲液A 平衡/上样/洗涤	安捷伦科技	5185-5987
缓冲液B洗脱	安捷伦科技	5185-5988
冷却离心机	CPR-30 Plus 冷冻离心机	N/A	用于在低温下离心蛋白质样品
DTT	Sigma Aldrich	CAS号: 3483-12-3	用于胰蛋白酶消化
电泳装置	BIO RAD	1658004	用于 SDS-PAGE
IAA	Sigma Aldrich	CAS号：144-48-9	用于胰蛋白酶消化
IMS T-Wave	Waters	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/library/white-papers/2012/water-whitepapers-Triwav eMoreCompleteCharacterizationofMi xturesandMolecules-720004176.pdf	离子淌度分离（IMS）
Infinite M Plex 多功能酶标仪	TECAN		多功能酶标仪
LC-MS 系统	Waters	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/liquid-chromatography-ms-systems.html
MassLynx 4.1 SCN781 软件	Waters	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/informatics-and-software/mass-spectrometry-software/masslynx-mass-spectrometry-software.html	质谱软件
人类14种多重亲和去除离心柱（MARS Hu-14）	安捷伦科技	5188−6560	用于去除14种高丰度血浆蛋白，包括白蛋白、IgG、IgA、转铁蛋白等。
nanoACQUITY UPLC 系统	Waters	https://www.waters.com/nextgen/en/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-m-class-system.html
NanoLockSpray	Waters	https://www.waters.com/nextgen/us/en/services/instrument-services/instrument-upgrades/mass-spectrometry-ms-upgrades/nanolockspray-exact-mass-ionization-source-upgrade.html
Operon FDU-7003	操纵子	http://www.operon.co.kr/en/pro2-FDU.html	真空离心浓缩仪
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	赛默飞世尔科技	23225	用于通过比色法测定蛋白质浓度
Progenesis QI for Proteomics	Waters	V4.2
R-8C BL 实验室离心机，固定角转子，可容纳 12 个 × 15 mL	REMI		离心
SYNAPT G2 高分辨质谱	HDMSE 系统，Waters Corporation	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/app-notes/2009/720003057/720003057-en.pdf	混合四极杆离子迁移谱正交加速飞行时间（oa-ToF）质谱仪
总回收小瓶	Waters	https://www.waters.com/nextgen/us/en/shop/vials-containers--collection-plates/186004631-clear-glass-12-x-32-mm-screw-neck-total-recovery-vial-preassembl.html
胰蛋白酶	Sigma Aldrich	货号：T6567	用于胰蛋白酶消化