抑郁症与帕金森病小鼠模型中清醒状态下腹内侧前额叶皮层的电生理特征分析

摘要

利用在背缝核（DR）中过表达人源突变型A53T α-突触核蛋白（h-α-Syn）的帕金森病（PD）样小鼠模型，我们建立了一种电生理记录方法，用于研究腹内侧前额叶皮层（vmPFC）-DR环路在帕金森病相关抑郁/焦虑障碍中的作用。

摘要

尽管帕金森病（PD）主要被视为一种运动障碍疾病，但非运动症状常在运动功能缺损出现之前就已发生，并在疾病发展的各个阶段显著影响病程进展，具有重要作用。在这些非运动症状中，抑郁和焦虑最为常见，且女性患者因此承受的症状负担高于男性。5-羟色胺（5-HT）系统的改变常与情绪障碍相关，而在帕金森病合并抑郁患者的5-HT中缝核（RN）中已观察到α-突触核蛋白（α-Syn）的聚集。因此，理解这些非运动症状背后的神经环路机制至关重要。

本文介绍了一种改进的实验方案，利用在背缝际核（DR）中过表达人源突变型A53T α-突触核蛋白（h-α-Syn）的雌性小鼠模型，研究腹内侧前额叶皮层（vmPFC）与背缝际核（DR）环路在帕金森病相关情绪障碍中的作用。本方法可在基础状态以及厌恶性条件反射和消退过程中，对下边缘皮层（IL）和前边缘皮层（PL）的神经元活动进行高分辨率评估。我们采用声音-光感条件反射范式，在清醒、头部固定的动物中使用多通道电生理探针记录神经元反应。实验在虚拟现实走廊中进行，结合圆柱形跑步机与双屏视觉显示系统，在确保感觉刺激精确控制和记录稳定性的同时维持动物的行为参与度。

本方案基于内侧前额叶下边缘皮层（IL）和前边缘皮层（PL）在恐惧条件化及消退中的已知作用，提供了一个可靠的研究框架，用于检测与帕金森病（PD）中抑郁样和焦虑样行为相关神经环路的动态神经活动。通过在受控条件下实现行为学与电生理学测量的同步进行，该方法为阐明帕金森病非运动症状的神经生物学机制以及评估潜在干预手段提供了有力工具。

引言

帕金森病（PD）是一种运动障碍性疾病，但非运动症状已知会早于运动症状出现，并且贯穿疾病的所有阶段^1,2,3,4。在这些非运动症状中，抑郁和焦虑是最常见的神经精神症状，严重影响帕金森病患者的生活质量，且女性的症状负担高于男性⁵。尽管如此，这些症状常常被漏诊且治疗不足⁶。基于上述所有原因，深入了解帕金森病神经精神症状所涉及的神经生物学机制和神经环路，对于对患者进行分层并提供更加个性化的治疗至关重要。

尽管帕金森病（PD）的病因尚未完全明确，但已发现若干关键的神经病理学特征。该疾病以黑质纹状体系统中多巴胺能（DA）神经元及其纤维进行性变性和丧失为特征，导致帕金森病典型的运动功能障碍^7,8。帕金森病的另一标志性特征是路易小体（LB）和路易神经突的存在——即主要由纤维状蛋白聚集物构成的细胞内包涵体，其主要成分为α-突触核蛋白（α-Syn）^9,10。神经影像学研究还显示，其他神经递质系统也会受累——甚至早于多巴胺能系统的损害，其中包括5-羟色胺能（5-HT）系统^11,12,13。5-羟色胺能（5-HT）系统的改变通常与情绪障碍相关，在被诊断为帕金森病（PD）合并抑郁症的个体中，已在5-HT中缝核（RN）中检测到α-突触核蛋白（α-Syn）的沉积¹⁴。

中缝背核（DR）是脑干网状结构（RN）中最大的5-HT核团¹⁵，在情绪调节、感知、奖赏、攻击行为和社会互动中发挥关键作用。因此，DR功能障碍与应激、焦虑和抑郁等神经精神疾病密切相关^15,16。值得注意的是，DR与前额叶皮层（PFC）之间存在强烈的双向功能和解剖连接，而PFC是负责高级脑功能的重要脑区。PFC的背侧区域主要参与认知功能，而腹内侧区域（vmPFC）则在情绪调节、行为控制、记忆和决策过程中起核心作用^17,18。因此，vmPFC与DR共同显著影响情绪状态，该神经环路活动的异常与抑郁症状相关¹⁸。此外，已有研究表明，在RN的5-HT神经元中聚集形式的α-突触核蛋白（α-Syn）累积可诱导出类似焦虑和抑郁的表型^19,20,21。

利用在背缝核（DR）中通过腺相关病毒（AAV）载体过表达人源突变型A53T α-突触核蛋白（h-α-Syn）并表现出抑郁表型的帕金森病（PD）雌性小鼠模型，我们建立了一种电生理记录方法。该方法旨在研究vmPFC-DR环路在帕金森病相关抑郁/焦虑障碍中的作用。该技术通过在清醒小鼠中进行单神经元放电和局部场电位（LFPs）记录，评估下边缘（IL）和前边缘（PL）皮层的神经元活动。实验采用多通道探针结合虚拟现实跑轮系统完成。鉴于PL和IL皮层均参与厌恶性条件反射，我们还在该行为范式中同步记录其神经活动，以评估其在应激状态下的功能。需要明确的是，PL皮层主要介导条件性反应的形成，而IL皮层则在这些反应的消退过程中发挥关键作用^22,23。

以下方案描述了植入头杆并急性记录PL和IL皮层电活动的步骤 体内我们通过使用虚拟现实走廊实现这一目标，该装置将用于头部固定小鼠的圆柱形跑步机与双屏视觉显示系统相结合。本方案分为四个主要阶段：（1）头杆植入手术，（2）适应性训练，（3）记录与信号采集，以及（4）数据分析：包括脉冲信号分选和数据预处理。

在诱导脑内5-HT系统过表达h-α-Syn后的三周，小鼠接受头杆植入手术，以便后续进行头部固定。经过一周的恢复期后，小鼠需适应实验人员以及跑步机和头部固定系统，持续4天。在记录当天，利用该装置在基线条件下以及厌恶性条件反射过程中记录前边缘（PL）和下边缘（IL）皮层的神经活动。原始神经数据通过Kilosort4进行自动 spike 分选，随后在Phy2中进行人工校正，以提取高质量的单细胞簇用于进一步分析（图1）。

所提出的清醒状态下固定头部的多通道vmPFC记录方案，相较于传统的麻醉或 离体 自由活动动物的制备与无线记录。与麻醉或 离体 该方法能够在虚拟现实环境中，在受控的视觉和听觉刺激条件下评估腹内侧前额叶皮层（vmPFC）的活动，这对于实施厌恶条件化范式至关重要^24,25与自由活动记录相比，头部固定装置能够精确控制感觉输入和任务相关条件，从而减少变异性并实现稳定的试验结构。此外，头部固定可降低自由活动范式中常见（尤其是在厌恶刺激条件下）的任务脱离风险，同时仍能获得高产量且稳定的多通道记录。²⁶.

从实际角度来看，本实验方案需要动物预先适应头部固定和跑台跑步，但得益于市面上可获取的、价格相对低廉的整合了圆柱形跑台的头部固定系统，该方法使得小型实验室也能开展相关研究，因为探针可重复使用多次（最多约10次插入），与慢性自由活动植入式装置相比显著降低了成本。因此，该方法在实验控制性、行为相关性和成本效益之间实现了良好平衡。另一个需要考虑的因素是厌恶性条件反射范式的实施。在本研究中，我们采用了一种基于啮齿类动物天生避光特性的实验设计：10个听觉音调（条件刺激）各自随后伴随短暂的强光暴露（非条件刺激）。尽管这种模式比其他经典条件反射方法（如使用电击的方法）造成的应激更小，但它更接近现实世界中的真实应激源。

方案

所有实验均使用年龄匹配的对照组进行，动物实验设计遵循“3R”原则，符合欧盟指令2010/63（2010年9月22日）、西班牙法律法规（RD 1201/2005、L.32/2007和L.6/2013）规定的伦理准则，并已获得巴伦西亚自治区政府（ES462500001003；编号2023-VSC-PA-0073）以及瓦伦西亚大学本地生物伦理委员会（编号A20230214153605）的批准。

注意：为确保安全并防止污染，在整个操作过程中，应穿戴个人防护装备，包括一次性手套和鞋套、实验服、口罩和发网。根据当地法规和适用的国家回收计划，使用兽药回收系统处理使用后产生的残留物。

1. 小鼠模型构建

注意：成年雌性 C57BL/6J 小鼠（9 周龄）饲养于环境受控条件下（22 ± 1 °C；12 小时光照/黑暗循环），可自由摄食和饮水。

1. 在小鼠麻醉舱中，使用异氟烷麻醉（诱导浓度为4%，维持浓度为2%），随机分配小鼠接受向中缝背核（DR）的立体定位微量注射（相对于前囟的坐标：前后位 [AP] −4.5 mm，内外侧位 [ML] −1.0 mm，背腹位 [DV] −3.2 mm；注射角度：20°），采用自动微量注射仪，流速为0.4 µL/min，操作方法如前所述^19,27,28。
2. 确保每只小鼠注射总体积为0.6 µL，注射物为携带编码人源α-突触核蛋白A53T突变体（h-α-Syn）的重组腺相关病毒血清型1/2（AAV1/2；浓度：5.16 × 10¹² gp/mL），以诱导DR中5-HT神经元过表达（n = 4）；或注射含非编码填充DNA的空载AAV1/2载体（AAV-EV），作为对照组（n = 5）。
3. 为防止回流，注射完毕后将针头留置原位额外8分钟，再以320–400 µm/min的速率缓慢撤出。
   注意：出于安全考虑，在进行任何立体定位手术（第1和第2节）前，应确保废气清除系统正常运行，以有效捕获麻醉气体。若在加注挥发罐时发生异氟烷泄漏，应立即使用惰性吸水材料（如木屑）清理。根据当地法规，使用兽用药品回收系统处理异氟烷过滤器及使用过程中产生的任何残留物。

2. 头部固定杆植入手术

注意：在建立小鼠模型后 3 周，按照以下步骤进行头颅固定杆植入手术。

1. 术前准备与麻醉
   1. 通过异氟烷蒸发器输送异氟烷（诱导浓度为4%，维持浓度为1.5–2%）对动物进行麻醉。
   2. 将小鼠置于立体定位仪中，并放置在加热垫上，以在整个手术过程中维持其体温。
   3. 轻柔地打开小鼠口腔，将其门齿置于咬合杆上，并连接与立体定位仪相连的面罩，以确保持续输送异氟烷以维持麻醉状态。
   4. 滴注眼药水，防止角膜溃疡。
   5. 在手术刀切口前至少10分钟，通过皮下注射喷他佐辛（5 mg/kg生理盐水溶液）给予镇痛处理。
   6. 在耳部内侧注射局部利多卡因（每耳0.03 mL，4 mg/kg，剂量不得超过最大限值7 mg/kg，或使用利多卡因/丙胺卡因乳膏[利多卡因25 mg/g，丙胺卡因25 mg/g]）以减轻耳杆带来的不适。
2. 立体定位与颅骨准备
   1. 调整耳杆位置，牢固固定头部，确保对称且尽量减少移动。
   2. 调节门齿杆，使前囟（bregma）和后囟（lambda）处于同一水平面，并确保二者位于中线上。
   3. 通过检查足底回缩反射、眼睑反射消失、呼吸频率降低以及胡须无运动等指标，确认麻醉诱导成功。
   4. 确保小鼠在立体定位架中正确固定，耳杆已仔细调整到位。
   5. 剃除手术区域毛发，并使用消毒液（聚维酮碘后接70%乙醇）进行消毒，以最大限度降低感染风险。
   6. 沿中线做头皮切口，轻柔地分离并牵拉下方组织以暴露颅骨，同时保持止血。确保切口足够大，以便清晰观察顶颞嵴。为此，可在皮肤下方的筋膜上放置四个精细的止血钳，以最大程度暴露手术视野。
   7. 清洁并彻底干燥暴露的颅骨，以便清晰观察解剖标志（前囟和后囟）。
   8. 通过将前囟和后囟调整至同一水平面，实现颅骨在前后轴上的水平对齐。
   9. 通过匹配两侧顶颞嵴的深度，实现颅骨在内外侧轴上的水平对齐。
3. 钻孔与植入物放置
   1. 在腹内侧前额叶皮层（vmPFC）上方钻一个直径为1 mm的孔，坐标为AP: +1.75；ML: −0.4；DV: +3.1（图2）。使用立体定位臂用墨水标记四个顶点，以指导记录日硅探针的插入。此外，用手术刀连接上述各点画出十字线，并充分涂抹墨水使其渗入切口，确保标记稳定。用蘸有70%酒精的棉签去除多余墨水。
   2. 在小脑上方的后颅骨区域再钻两个孔。分别手动插入一根导线，作为未来的参考电极和接地电极（图2）。
      1. 也可选用不锈钢螺钉（A2不锈钢，M1 × 2规格，或18-8不锈钢，直径0.061" × 长度3/16"）或不锈钢公跳线。无论选择何种方式，均需确保提供电接触的元件与脑表面直接接触，且不施加压力，以避免组织损伤、影响动物福利或干扰记录质量。
   3. 用手术刀在暴露的颅骨上刻出浅沟，以增加表面积，提高植入物的粘附性。
   4. 在清洁干燥的颅骨上分两步涂布中间牙科粘接树脂：首先涂布基质-催化剂混合物，待其完全干燥后，再涂布含粉末的混合物，确保覆盖整个表面及颅骨边缘。使用镊子检查颅骨与未来植入水泥之间的粘接是否完全固化后再继续操作。
   5. 在PFC记录孔与参考/接地孔之间放置一根不锈钢头杆（图2）。将头杆与立体定位臂对齐，确保其与颅骨完全水平，从而在头部固定及后续硅探针插入过程中保持准确的立体定位坐标。
   6. 使用牙科水泥将所有金属部件牢固粘合至颅骨，注意避免水泥进入记录孔。
   7. 使用双组分外科硅胶覆盖颅骨开窗区域。
      注：若所有步骤均被严格遵循，则头杆的植入及其后续功能应无并发症发生，预计成功率超过95%。
4. 术后护理
   1. 密切监测小鼠在脑部手术后的恢复情况，确保其意识恢复、体温维持正常并获得有效镇痛。
   2. 将小鼠单独饲养于笼中，并持续观察直至完全恢复。
   3. 术后3天内每12小时皮下注射一次喷他佐辛（5 mg/kg生理盐水溶液）。
      注：（关键步骤）在整个手术过程中，需持续监测生命体征（心率、呼吸频率、血氧饱和度和血压）。根据需要滴注眼药水，防止角膜干燥或损伤。

3. 习惯化

注意：小鼠恢复术前体重后（术后约5至7天），开始为期4天的适应性训练方案，逐步使动物适应实验装置。

1. 第1天：进行两次每次10分钟的抓握操作训练，两次之间间隔1小时，以使小鼠熟悉实验人员。在小鼠位于前臂上时轻柔触碰其身体，使其适应实验人员的接触。
2. 第2天：进行两次每次5分钟的抓握操作训练。每次训练结束后，以10秒为间隔，轻轻用手持头杆的方式固定小鼠头部，累计持续5分钟。
3. 第3天：在短暂的抓握训练后，让小鼠在跑步机上自由奔跑7分钟。随后固定其头部，并维持头固定状态5分钟。
4. 第4天：进行一次持续15分钟的头固定状态下的跑步机跑步训练。
   注意：（关键步骤）根据既定的动物福利指南，若动物出现明显体重下降、啃毛行为、探索活动减少或运动能力降低等情况，必须将其退出实验。植入装置必须保持完全稳定。若发生任何位移，该动物必须被排除在实验之外，因为这可能在记录过程中损坏多通道探针，和/或导致信号不稳定、噪声增加。

4. 探针制备

注意：连接探针与适配器（图3A）时，请遵循以下步骤：

1. 将探针适配器/连接器安装到立体定位仪机械臂适配器上。
2. 将两个头级适配器（每个Om32）与探针适配器连接（图3A），确保方向匹配，并避免施加过大的力。
3. 将探针连接至适配器（图3B）。为实现从IL和PL脑区在64个不同深度的同步记录，使用单叉、64通道硅探针（叉长：8 mm；叉厚：15 µm）（图4A）。
4. 为便于后续定位探针位置，可用组织学兼容的荧光染料或铁磁性颗粒涂覆探针，以用于事后验证记录位点。
5. 通过以下任一方法施加染料：
   1. 将整个叉部浸入溶液中。
   2. 用微量移液器在探针上释放少量溶液液滴，并沿叉部涂抹均匀。
   3. 使用蘸有溶液的细刷在探针背面进行涂刷。
   4. 对于步骤4.5.2和4.5.3，至少重复涂抹三次，以确保叉部充分覆盖。
      注意：步骤4.1至4.3仅在首次使用探针时需要，因为探针可在多次记录会话中重复使用。记录结束后，断开串行外设接口（SPI）电缆，同时保持探针与适配器连接，并将适配器保留在立体定位仪机械臂适配器上。

5. 记录与信号采集

1. 采用基于阴道涂片细胞形态学的非侵入性方法监测动情周期，以确保雌性动物处于动情间期^29,30。
2. 将动物固定于集成在立体定位仪上的圆柱形跑步机中，保持头部固定（图4B）。确保跑步机与立体定位仪正确对齐，以保证各实验对象之间的稳定性与可比性。
3. 为记录和采集信号，请执行步骤 5.3.1–5.3.15。
   1. 使用放大镜确保植入物完全静止不动。
   2. 将探针组件（包括探针、适配器和前置放大器适配器）安装至立体定位仪的适配臂上。
   3. 将先前连接至采集板的 SPI 电缆连接到前置放大器（图3B）。记录每根 SPI 电缆所连接的前置放大器，因为该对应关系对于后续自动尖峰分类过程中电极布局的保持至关重要。
   4. 将探针适配器的接地线连接至记录半球同侧的雄性桥接电极，参考线连接至对侧。在埋入脑内的导线上涂抹少量焊锡，然后短暂加热以固定连接。避免过热，以防损伤下方组织或适配器电子元件。
   5. 放置放大镜以观察用于探针插入前边缘皮层（PL）和下边缘皮层（IL）的颅骨开孔。确保墨水标记在整个操作过程中始终清晰可见，以维持精确的立体定位坐标。
   6. 利用立体定位臂和预先标记的解剖标志，将探针引导至 vmPFC 开孔的中心位置。
   7. 小心地将探针置于颅窗中央，并轻触脑表面。向暴露的组织滴加温热的生理盐水，防止组织干燥。
   8. 以 50 µm/min 的速度缓慢下探 4–5 分钟，以最小化组织炎症反应。确保探针柄在初始插入过程中不发生弯曲。
   9. 测量记录位点的阻抗，并与制造商提供的数值进行比较。此初步评估可确认首次进入脑组织的通道在插入过程中未受损或堵塞。
      注意：（关键步骤）电极阻抗应与制造商提供的基线值进行比较。偏差在约 30% 以内通常可接受，不会影响记录质量；30–100% 的升高仍可能使用，但需谨慎并加强监测；超过 100% 的变化常提示存在损伤或堵塞，相关记录位点应视为不可靠。此时应按前述方法清洗探针以降低阻抗。若阻抗无法恢复至可接受范围，则必须弃用该探针。然而，最终由实验人员判断可容忍多少不可靠通道后才弃用探针；通常的标准是受损通道不超过总通道数的约 10%。
   10. 继续以 50 µm/min 的速度下探，同时监测进入脑组织通道的实时信号。验证这些信号是否与先前评估的通道信号相似，以确认插入操作正确。
   11. 推进探针至腹背向深度 +3.1 mm 处，在下探过程中持续滴加温热生理盐水以保持颅窗湿润。
   12. 移除放大镜，并清除实验室内其他可能的电噪声源。
   13. 再次测量阻抗，以确认探针下探过程中无记录位点发生堵塞。
   14. 以连续 4–5 个通道的信号作为参考进行监测，等待 90–120 分钟，直至探针信号稳定。在此稳定期后，确认信号漂移极小，以确保后续自动尖峰分类能够可靠地分离出单个神经元簇。
   15. 在开始数据采集前再次测量阻抗，以确认记录位点状态良好，并建立基线阻抗值。定期滴加温热生理盐水，防止组织干燥。将记录数据保存为二进制文件（例如 .dat 或 .bin），以便后续数据预处理。
4. 信号稳定后，执行步骤 5.4.1–5.4.6。
   1. 记录 30 分钟的基础神经活动（图4C）。
   2. 在基础记录结束后 30 分钟，使用 Arduino 启动厌恶条件反射实验程序。该程序包含 10 次听觉音调刺激（每次 10 秒），每分钟呈现一次，持续 10 分钟。每次音调结束后立即通过虚拟现实迷宫屏幕呈现 10 秒的光刺激（图4C）。
   3. 在无任何条件刺激的情况下继续记录神经活动 10 分钟。
   4. 在消退实验阶段记录 PL 和 IL 皮层的神经活动，此阶段呈现 10 次听觉音调，但不伴随后续光刺激。
   5. 在无任何刺激的情况下再记录神经活动 10 分钟。
   6. 停止记录。
5. 记录后处理：完成记录后，执行步骤 5.5.1。
   1. 探针撤出：滴加温热生理盐水，以 100–150 µm/min 的速度小心撤出探针，同时持续监测电极信号，避免对探针造成机械损伤或对脑组织产生牵拉，以免影响后续组织学重建。
   2. 探针完全退出脑组织后，立即将探针柄浸入蒸馏水中 10 分钟，防止附着组织干燥。
   3. 使用戊巴比妥钠（100 mg/kg）麻醉动物。随后在化学通风橱内进行经心脏灌注：先灌注 80 mL 生理盐水（0.9%），再灌注 80 mL 4% 多聚甲醛（溶于 0.1 M、pH 7.6 的磷酸缓冲液 PB 中）。
      1. 为避免接触和吸入多聚甲醛，请佩戴眼部/面部防护装备、化学防护手套和防尘口罩。灌注结束后，将剩余多聚甲醛倒入非卤化溶剂专用容器中。
      2. 若发生泄漏，应润湿污染物以防止粉尘扩散，并将其置于密封容器中。使用漂白剂清洁受污染区域和工作台面，以中和多聚甲醛。
   4. 取出脑组织，在 4 °C 下后固定过夜，随后转移至含 30% 蔗糖的 PB 缓冲液（0.1 M，pH 7.6）中，于 4 °C 保存以进行冷冻保护。使用冷冻切片机获取 30 µm 厚的冠状切片，并将切片贴附于明胶包被的载玻片上。
      注意：这些切片将用于通过免疫组织化学方法验证 DR α-Syn 的过表达情况（如前所述^19,20,21）以及探针位置。
   5. 探针清洗：将探针的可植入部分浸入含 1% 酶性洗涤剂的蒸馏水中，浸泡 1 小时。
   6. 再将探针柄浸入蒸馏水中 10 分钟，以去除残留的洗涤剂。
   7. 直立干燥 20–30 分钟。干燥后，在显微镜下检查探针，确认记录位点无残留组织或碎屑。若探针完全清洁，将其浸入高纯度异丙醇中 1 分钟，随后存放于原装防静电盒中。

6. 数据分析：峰电位分类与数据预处理

注意：为分析细胞外神经记录并将单个峰电位归因于特定神经元，请使用Kilosort4³¹峰电位分类算法。

1. 使用 Kilosort4³¹ 进行自动尖峰聚类分选。在 Kilosort4 图形用户界面中，选择二进制记录文件，并根据制造商提供的探针布局配置表指定探针结构。使用默认参数运行尖峰分选，这些参数非常适合捕获内侧前额叶下边缘（IL）和前边缘（PL）皮层记录的波形，无需进一步调整。
2. 使用 Phy2（kwikteam/phy）检查 Kilosort 的输出结果，并进行额外的手动校正。集成社区开发的插件（petersenpeter/phy2-plugins；jiumao2/PhyWaveformPlugin），为 Phy2 添加额外功能，以提高校正后数据的质量。
3. 将频率 <0.05 Hz 或包含少于 500 个尖峰的任何聚类标记为噪声并予以剔除。
4. 同时，将以下聚类标记为噪声：
   1. 自相关图呈三角形的聚类标记为噪声。
   2. 波形形状不类似尖峰的聚类标记为噪声。
   3. 仅在一个记录通道上被检测到，或在所有通道上振幅变化不一致的聚类标记为噪声。
   4. 自相关图中表现出强烈周期性的聚类标记为噪声。
5. 仅保留具有生理学合理波形、自相关图中存在不应期谷、振幅变化合理且主成分清晰分离的聚类。
6. 通过应用基于马氏距离的离群值剔除方法，对手动筛选的每个聚类进行清理。
7. 继续将波形形状和振幅变化作为评估手动清理有效性的关键指标。
   注：完成尖峰分选后，可使用 Python 中实现的分析流程对腹内侧前额叶皮层（vmPFC）的神经元活动模式进行分析。

结果

利用详细的实验方案对PL和IL皮层活动进行的最新记录揭示了重要发现：在背缝核（DR）中过表达h-α-Syn可诱导雌性小鼠出现类焦虑表型，同时也会改变腹内侧vmPFC的活动。通过基于Python的分析，我们证明DR核中5-HT神经元的α-Syn过表达改变了vmPFC-DR环路的放电动态和功能组织，降低了不同神经元亚型之间的电生理差异。在对照组动物中，神经元亚型可根据电生理特性清晰区分，从而能够准确分类SST+、锥体细胞以及PV+神经元。相比之下，A53T α-Syn过表达导致亚型可分性显著丧失，不同神经元群体的特征空间出现重叠，并发生广泛的错误分类（图5）。这种破坏表现为放电率分布的崩溃，表明α-Syn病理损害了在正常条件下维持环路层级组织所依赖的特异性电生理身份。

图6展示了使用我们自主开发的Python程序（https://github.com/NeuronalCircuitsLab-UV/Papers-Projects/tree/main/ParkinsonM...

讨论

本方案介绍了一种可靠的实验方法 体内 在清醒、头部固定的转基因小鼠中，利用虚拟现实走廊系统对前边缘（PL）和下边缘（IL）皮层进行电生理学评估。该方法的重要意义在于能够在帕金森病（PD）模型中，直接于清醒且具有行为反应的小鼠体内研究腹内侧前额叶皮层-背缝核（vmPFC-DR）神经环路。尽管头部固定会限制动物的运动并可能引发应激反应，但它提供了精确的刺激控制和稳定的记录条件，适用于感知与认知过程的研究，尽管其结果可能无法完全反映自然状态下的行为表现。^24,25该方法相较于离体或麻醉状态下的制备具有显著优势，能够在一个更接近生理状态的条件下研究神经活动，特别是在厌恶条件反射过程中，可模拟与应激相关的情境。^32,33事实上，在全身麻醉期间，行为状态和全脑活动（尤其是皮层反应）会发生显著改变。^34,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AAV1/2-CMV/CBA-人 A53T aSyn-WPRE-BGH-polyA	查尔斯河实验室	GD1001-RV	人 A53T α-突触核蛋白
AAV1/2-CMV/CBA-Null/Empty-WPRE-BGH-polyA	查尔斯河实验室	GD1004-RV	空载体对照
ADPT A64-Om32x2	剑桥神经科技	Omnetics 2228	衔接器
双组分外科硅胶	世界精密仪器公司	KWIK-SIL
布托啡诺	托曲布西 Vet / 西米特 Qí云母	67753-31-5
DuraLay	Reliance Dental Manufacturing / Kalma	43640	牙科水泥
H9 多通道探针	剑桥神经科技	ASSY-77 H9
EMLA 乳膏（利多卡因 / 丙胺卡因）	Lirios Vañó Sempere 药房	679290
显微注射仪	世界精密仪器公司	KDS-310-PLUS
MSS 异氟烷蒸发器	英国医疗用品与服务	MSSVAP02
Open Ephys 采集板	Open Ephys	OEPS-9029	采集板；Open Ephys 采集板可通过 USB 将最多 512 通道的神经数据流传输至计算机
C&B MetaBond	Parkell	S380-RD	快速粘合水泥
戊巴比妥	Dolethal Vetoquinol /Merck Life Science, S.L.U.	P-010-1ML	巴比妥类药物
RHD 32通道 前置放大器	Intan Technologies	#C3314	头级适配器
Siccafluid	Thea S.A. Laboratories / Lirios Vañó 森佩尔药店	6515167	眼科凝胶
立体定位仪	斯托尔廷	51730U
立体定位仪	Narishige	SR-6N/SM-15R
Terg-a-zyme	Sigma Aldrich	Z273287	探针清洗液