一种优化的从猪肠道组织中连续分离隐窝和间充质基质细胞的方法

摘要

本研究提供了一种从猪空肠组织中依次分离肠隐窝和肠间充质基质细胞（iMSCs）的逐步实验方案。该方法可获得适用于建立可重复且具有生理相关性的上皮-基质共培养模型的二维肠类器官单层细胞和iMSCs，用于研究肠道稳态和再生过程中的细胞间相互作用。

摘要

肠上皮与下方的肠道间充质基质细胞（iMSCs）密切相互作用，以调控发育、稳态及再生过程。然而，目前尚缺乏标准化的方法，能够从猪组织中依次分离上皮和基质组分。本实验方案描述了一种优化的分步流程，可从同一段仔猪空肠组织中同时分离隐窝和iMSCs。该方法首先使用基于乙二胺四乙酸/二硫苏糖醇（EDTA/DTT）的解离缓冲液释放隐窝，随后通过胶原酶/分散酶消化细胞外基质以分离iMSCs。该策略可最大限度减少所分离细胞的空间差异。分离获得的隐窝成功实现了体外培养，并在包被胶原水凝胶的培养板上形成典型的二维（2D）扩展型肠类器官单层结构。培养的iMSCs可贴附于培养瓶表面，并通过免疫染色证实其表达血小板源性生长因子受体α（PDGFRα）和分化簇81（CD81）等基质细胞标志物。总体而言，该优化的分离方案可从同一仔猪空肠节段中同时获得上皮细胞和基质细胞，为未来开展涉及猪肠类器官与iMSC共培养系统的研究提供了可重复的基础，有助于阐明调控猪体内上皮-基质相互作用的机制。猪是模拟人类生理功能和推动动物科学发展的具有转化相关性的模型动物。

引言

肠上皮是一种动态组织，通过持续的自我更新和分化来维持肠道稳态，并在黏膜损伤后促进再生^1,2。肠上皮细胞起源于肠干细胞（ISCs），并与多种微环境因素相互作用^3,4,5,6,7,8。上皮下区域主要由固有层和黏膜肌层组成，包含来自不同谱系的多种细胞群体⁹。在这些细胞群体中，肠源性间充质基质细胞（iMSCs），包括成纤维细胞和肌成纤维细胞，可产生营养因子和生长因子，调控ISC的干性、增殖和分化，从而调节上皮稳态与再生^6,7,10,11。

为了研究这些细胞间的相互作用，近期研究开发了新方法，以揭示驱动肠上皮细胞与iMSC相互交流的潜在作用机制。将类器官与间质细胞或免疫细胞结合的共培养系统，已推动了我们对发育、再生、药物筛选和疾病建模过程中上皮-上皮下细胞相互作用的理解^{12,13,14,15,16,17}。然而，大多数类器官共培养研究使用的是小鼠组织，其往往无法有效模拟人类生理状态和疾病表型，从而限制了其在临床转化中的相关性¹⁸。

在大多数小鼠肠道组织分离方案中，上皮细胞和间质细胞来自不同的组织片段，这可能导致所获得的样本反映出略有差异的特性，从而可能影响实验间的可重复性^19,20。目前尚无标准化且经过优化的方案，用于从同一份猪肠道组织样本中同时分离肠隐窝和肠间充质干细胞（iMSCs）。此外，获取合适的人类肠道样本存在实际限制，导致许多研究人员依赖来自不同器官的不匹配细胞类型（如人肠类器官与皮肤成纤维细胞）来评估上皮-间充质细胞间的相互作用，这可能使数据解读变得复杂^21,22,23。

尽管最近发表的一项人类肠道活检方案通过从去除上皮后的剩余组织中培养出成纤维细胞并分离隐窝，但在猪中尚缺乏类似的标准化方法²⁴。由于猪在解剖结构和生理特征上与人类高度相似，常被用作转化研究的合适动物模型^{2,18,25,26,27,28,29}。因此，本方法提出了一种基于肠道生理、解剖及形态结构的连续分离方案，可从同一段猪空肠组织中同时获取肠道隐窝和肠源性间充质干细胞（iMSCs）^4,30。该操作流程为分离隐窝和iMSCs提供了可重复的技术框架，适用于今后的猪肠道共培养研究。

方案

从位于马里兰大学帕克分校养猪设施中饲养的21日龄仔猪的切除近端空肠中，截取一段5 cm长的肠段。用于处死仔猪的实验程序（编号：R-JUN-22-30）遵循该校机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）批准的动物护理与使用政策指南。在开始分离操作之前，图1展示了本实验方案的流程概要，用于猪肠道隐窝和iMSCs顺序分离的试剂与设备清单见《材料表》。

1. 分离前准备阶段

1. 每5 cm组织片段，在50 mL锥形管中准备30 mL洗涤缓冲液。
2. 根据所采集的组织样本数量调整体积。
   注意：洗涤缓冲液的成分见表1。所有组织处理和细胞分离步骤均在台面上进行。

2. 肠道组织制备阶段

1. 将切除的肠组织放入含有30 mL洗涤缓冲液的50 mL锥形管中。
   注意：切除的组织可在使用前置于冷洗涤缓冲液中保存1小时。
2. 冲洗组织3次× 使用预冷的洗涤缓冲液和21 G注射器去除管腔内容物。
3. 将组织置于无菌的聚苯乙烯泡沫表面，小心去除浆膜上的肠系膜和脂肪组织。
4. 使用手术刀沿纵向解剖组织以打开肠腔（图2A).
5. 将初步清洗后的解剖组织转移至新鲜的洗涤缓冲液中，洗涤两次，或直至缓冲液变澄清。
6. 将组织放入100 mm培养皿中的洗涤缓冲液中，使用新的手术刀片将其切成10–15 mm的片段（图2B, C此步骤可增加与消化缓冲液接触的表面积。
7. 将切碎的组织转移至新的50 mL锥形管中。
8. 用洗涤缓冲液轻轻洗涤，并让剪碎的组织依靠重力自然沉降约30 s（图2D).
9. 轻轻吸去上清液，仅保留足以覆盖锥形管中组织块的缓冲液。
10. 上皮细胞解离阶段
    1. 加入30 mL预热的上皮解离缓冲液（表 2）并在 37 ℃ 下孵育 20–30 分钟 °在约 9°C 的静态珠浴或摇动水浴中 × g.
    2. 每15分钟轻轻摇动试管一次，以促进隐窝从上皮膜上释放。
    3. 让组织自然沉降，用血清移液管轻轻吸除上清液，仅保留足以覆盖锥形管中已沉降组织的缓冲液。
    4. 加入30 mL新鲜洗涤缓冲液至已沉淀的组织中，剧烈振荡以释放绒毛、隐窝及碎片（图3A). 让组织残余物沉淀，然后轻轻倒出上清液（其中含有悬浮的隐窝片段），通过100 µ将细胞悬液通过一个 m 细胞筛滤入新的 50 mL 锥形管中。
       1. 重复向残留组织中加入新鲜洗涤缓冲液并倾倒的步骤，共三次（3）×）。用移液器吹打10次 µ将含有隐窝的洗涤缓冲液转移至100 mm培养皿中，在体视显微镜下观察隐窝密度。
          注意：每次洗涤后，保留含有隐窝的洗涤缓冲液。
    5. 第三次洗涤后，含有隐窝的洗涤缓冲液应较为清澈，仅含少量碎片（图3B).
       注意：将含有细胞外基质（ECM）的组织残余物保留在锥形管中，用于后续的iMSC分离处理。
    6. 将隐窝悬液在150 × g下离心 × g 在室温下以 2 分钟离心使隐窝片段沉淀。
    7. 吸弃上清，将隐窝沉淀重悬于上皮细胞培养基中。
    8. 将重悬的隐窝再次在150 × g下离心 × g 离心2分钟以收集隐窝片段沉淀。
    9. 加入上皮细胞培养基重悬隐窝，并用移液器吹打5次× 使用 1,000 µL型移液器吸头
    10. 将约100个重悬的隐窝接种至预先制备的1型胶原蛋白水凝胶包被的6孔板中，以培养并扩增隐窝，形成二维（2D）肠类器官单层。
        注意：检查胶原水凝胶包被板的制备情况 表3最终胶原蛋白I型浓度应为1.0 mg/mL。避免接种过密的隐窝或碎片，以防止酵母或真菌污染。洗涤缓冲液和培养基中的抗生素-抗真菌剂（anti-anti）应提供保护作用。
    11. 在37℃孵育前，于倒置相差显微镜下观察细胞 °C，置于含5% CO₂的湿润环境中₂ 培养箱
    12. 接种后12小时内更换培养基，以去除漂浮的碎片并减少细菌污染。
    13. 使用上皮细胞培养基培养类肠体表 4) 并每隔一天更换一次培养基，直至约第8天，此时扩增的二维单层细胞达到≥85%融合度，可用于传代培养。
11. 细胞外基质解离阶段
    注意：继续使用锥形管中含细胞外基质的剩余组织碎片进行分离过程（图3C 和 图4A).
    注意：尽管上皮细胞解离缓冲液中的EDTA可能抑制胶原酶活性，但此前的三次洗涤步骤已去除全部EDTA和DTT，因此后续过程中胶原酶活性不应受到影响。
    1. 将剩余组织再次切碎成小块，然后继续分离固有层中的iMSCs。
    2. 加入25 mL细胞外消化缓冲液（表 5) 加入组织中，在37℃静态珠浴中孵育15–20分钟 °C (图4B).
    3. 孵育后剧烈振荡。
       注意：上清液将变得浑浊，且漂浮的组织碎片减少。用移液器吸取10 µ在倒置显微镜下观察上清液中iMSCs的密度。如果观察到的iMSC密度较低，则将组织在珠浴中继续孵育额外15分钟。
    4. 轻轻倾倒上清液（在步骤 2.2.3 剧烈振荡后立即进行），通过 100 µ将细胞悬液通过细胞滤网过滤至新的锥形管中，以尽量减少杂质。
    5. 将细胞悬液在280 × g下离心 × g 在室温下离心5分钟以沉淀iMSCs。
    6. 吸弃上清液，并将iMSCs重悬于间充质细胞培养基中（参见iMSC培养基） 表6).
    7. 再次以280 × g离心重悬的iMSCs × g 5 分钟以洗去解离缓冲液。
    8. 吸弃上清，用间充质细胞培养基重悬iMSCs。
    9. 将iMSCs以每T75培养瓶约5×10⁴个细胞的密度接种 × 10⁵ 每瓶细胞数。
       注意：确保接种的细胞覆盖约60%的培养瓶表面积，因为间充质细胞需要中等到较高的接种密度才能实现最佳生长。
    10. 接种后12小时内更换培养基，以去除多余碎片并防止细菌污染。
    11. 接种后第2天，在倒置相差显微镜下观察成纤维细胞样细胞。
        注意：每隔一天更换一次间充质细胞培养基。iMSCs 应在第 4 天达到约 85% 汇合度，并可进行传代培养。

3. 免疫细胞化学检测

1. 在96孔板中，每孔接种约5,000个iMSCs，使用间充质细胞培养基培养2-3天，直至细胞融合度达到约80%。
2. 轻轻吸除培养基，于室温下用100 µL的1× PBS/孔洗涤培养的iMSCs两次³¹。所有免疫染色试剂盒的参考信息均见于材料表。
3. 每孔加入100 µL的4%多聚甲醛（PFA）固定培养的iMSCs，于室温静置固定30分钟。
4. 用100 µL的0.1% Tween-20/PBS（PBST）洗涤固定后的iMSCs两次，每次5分钟，随后加入100 µL的0.5% Triton X-100/PBS处理30分钟以进行通透。
5. 每孔加入100 µL的5%牛血清白蛋白（BSA）/PBST，用于封闭固定细胞上的非特异性结合位点。
   注：室温孵育1小时，然后用100 µL PBST洗涤两次，每次5分钟。
6. 每孔加入100 µL稀释的一抗溶液（1:250，即1 µL一抗加入250 µL抗体稀释液），于4 °C孵育过夜。所用一抗为PDGFRα和CD81。
   注：设置阴性对照孔，仅加入抗体稀释液而不加一抗。
7. 第二天，用100 µL PBST洗涤去除一抗两次，每次5分钟。
8. 用1× PBS按以下比例稀释二抗：Alexa Fluor Plus 555（1 µL:100 µL）、Alexa Fluor Plus 647（1 µL:100 µL）、DAPI（1 µL:800 µL）。
9. 于室温下用稀释后的二抗对细胞进行复染，孵育1小时。
10. 用1× PBS洗涤细胞两次，每次5分钟。
11. 每孔加入100 µL封片剂，盖上盖板，用铝箔纸包裹，于4 °C保存，最长可保存6个月，待进行荧光成像。

4. RNA提取与qPCR检测

1. 使用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿分离法从T75培养瓶中培养的iMSCs中提取总mRNA。
   注意：使用分光光度计测定RNA浓度和纯度。
2. 将总mRNA逆转录为cDNA，作为定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测的模板，用于验证先前研究中报道的选定家猪（Sus scrofa）基因引物GAPDH（正向：ATCCTGGGCTACACTGAGGAC；反向：AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG）的扩增曲线^2,28。

结果

在上皮细胞解离过程中，乙二胺四乙酸（EDTA）通过螯合钙离子破坏钙依赖性细胞间黏附，而二硫苏糖醇（DTT）可切断黏蛋白糖蛋白中的二硫键，促进黏液溶解。因此，联合使用螯合剂（EDTA）和还原剂（DTT）可在不破坏细胞外基质（ECM）结构的前提下，有效释放隐窝结构^2,32 (图3）。隐窝成功从上皮层释放，且细胞外基质（ECM）破坏极小（图 3B，C）。在肠道上皮细胞培养基中培养时，分离的隐窝会附着于胶原蛋白包被的水凝胶表面，并扩展形成肠类器官单层，每隔一天更换一次培养基（图5A）。胶原蛋白水凝胶为肠道类器官单层结构提供了必要的结构支撑，重现了 体内 结构组织及模拟上皮生长所需的架构。

同时，使用含有胶原酶和分散酶的缓冲液解离肠源性间充质基质细...

讨论

从同一段猪空肠组织中分离肠隐窝和肠间充质干细胞（iMSCs），为保留组织片段特异性的细胞特征和功能特性提供了一种新颖的方法。这一点至关重要，因为肠道组织具有区域性和空间特异性，此前的猪研究已对此有所证实^2,36,37,38。以往在猪或其他物种中开展的类器官研究，通常依赖于从一个肠段分离隐窝，同时从远端区域或外植体培养中获取成纤维细胞，这种方法存在微环境生态位不匹配或生理特性差异的风险^24,28,33,35。本方法通过精确控制化学、酶解和机械消化过程，针对空肠黏膜解剖结构的各层组织，实现了成功的分步分离

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA	Promega	PR-V4231
1 M HEPES 缓冲液	ThermoFisher	15630080	用于胶原蛋白水凝胶板的制备
1000 µL 移液器吸头	Alkali Scientific FT1000	104027-530
10x PBS	Invitrogen	AM9624	用于胶原蛋白水凝胶板的制备
1 N 氢氧化钠	Thermo	SS266-1	用于胶原蛋白水凝胶板的制备
1x HBSS	ThermoFisher	14025092
1X PBS	Hyclone	SH30256FS
4% 多聚甲醛（PFA）	ThermoFisher	AAJ61899AK
50 mL 圆锥形离心管	ThermoFisher	12-565-271
6 孔板	Fisherbrand	FB012927
7.5% 碳酸氢钠溶液	Corning	MT25035CI	用于胶原蛋白水凝胶板的制备
Advance DMEM/F12	Gibco	12634-010
Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32728	二抗
Alexa Plus 555 - A32732	Invitrogen	A32732	二抗
铝箔	Reynolds	https://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1
ANTI-ANTI	Gibco	15240096
B27	ThermoFisher	12587010
BSA	Fisherbrand	BP1600-100
CD81	Proteinintech	66866-1-ig	一抗
细胞培养级水	Hyclone	SH30529FS	用于胶原蛋白水凝胶板的制备
胶原蛋白 I 型	Corning	356236	用于胶原蛋白水凝胶板的制备
胶原酶 IV	Gibco	17104019
Corning 100 mm 培养皿	Corning	07-202-011
Cryostor 细胞冻存培养基	Stemcell Technologies	7930
细胞冻存管	Fisherbrand	1050026
Dako 抗体稀释液	Dako/Agilent	部件编号：S302283-2	一抗稀释液
Dako 荧光封片介质	Dako/Agilent	部件编号：S302380-2
DAPI	Promocell/VWR	10180-470	DNA 染色
Dispase II	Roche	4942078001
DMEM，高糖	Corning	MT10013CV
DTT	Sigma	646563
EGF	Peprotech	315-09
FBS（热灭活）	Avantor	1300-500H
胃泌素	Anaspec	AS-64149
庆大霉素	MP Biomedicals	ICN1676045
GlutaMax	ThermoFisher	35050061
HEPES	ThermoFisher	15630-080
倒置荧光显微镜	Nikon	ECLIPSE Ti2	荧光成像
倒置相差显微镜	Nikon	Eclipse TS100	用于培养细胞的成像
iScript Advanced cDNA 合成试剂盒	Bio-Rad	1725038	RT-PCR 试剂盒
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725122	qPCR 试剂盒
LWRN 条件培养基	ATCC	CRL-3276	LWRN 培养基根据 ATCC 操作规程在本实验室制备
N-乙酰半胱氨酸	MP Bio	194603
Nanodrop 2000 分光光度计	ThermoFisher	ND 2000
烟酰胺	Sigma	N0636-100G
带条形码的光学 384 孔板	Applied Biosystems	4483285	qPCR 试剂盒
PDGFRα	Abcam	ab230457	一抗
前列腺素 E2（PGE2）	Cayman Chemical	14010
QuantStudio 5	Applied Biosystem	A28570	qPCR 仪器
SB202190	LC Laboratories	S-1700
体视显微镜	Nikon	SMZ745
T75 培养瓶	Fisherbrand	FB012937
吐温 X100	Fisherbrand	PI85111
Trizol 试剂	Invitrogen	15596026
吐温 20，100% 非离子型去污剂	Bio-rad	1706531
Y27632	ApexBio	A3008-200