网络药理学与 体外 探索噻唑酮衍生物在横纹肌肉瘤中治疗潜力的细胞实验研究

摘要

我们开展了一项研究，基于网络药理学与计算化学系统地探讨噻唑酮衍生物对横纹肌肉瘤的治疗潜力，并通过实验验证与评估其效果 体外 细胞实验

摘要

横纹肌肉瘤（RD）是一种起源于横纹肌母细胞的恶性肿瘤，对儿童和青少年的健康构成严重威胁。基于噻唑酮类衍生物在多种生物活性中的潜力，本研究拟结合网络药理学与体外细胞实验，系统探讨噻唑酮类衍生物在治疗RD中的作用机制。通过网络药理学方法整合高通量数据，预测噻唑酮类化合物的潜在作用靶点；并利用AutoDock Vina软件计算化合物与靶蛋白分子之间的结合能，揭示其与RD相关的信号通路。最后，通过体外细胞实验进一步验证该类化合物的抑瘤作用。采用网络药理学分析噻唑酮类衍生物在治疗RD中的作用靶点，经整合与去重后最终获得172个靶基因。通过化合物与靶蛋白分子对接，筛选出结合能较低的5个蛋白靶点：PIK3CD、AKT1、GSK3B、HSP90AB1和ITGB1。体外细胞培养实验结果表明，某一特定噻唑酮类衍生物对RD细胞系具有显著抑制作用，为发现治疗RD的新靶点和有效化合物提供了科学依据。本研究通过结合网络药理学与体外实验，揭示了噻唑酮类衍生物在治疗RD中的作用机制，为未来药物研发和治疗策略提供了新的视角。

引言

横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma，RD）是一种高度侵袭性的儿童软组织肉瘤，对儿童健康构成重大威胁，目前治疗手段有限。流行病学研究表明，尽管RD发病率相对较低，但其高度恶性及不良预后给临床治疗带来巨大挑战。RD可分为四种不同的组织学亚型：胚胎型、腺泡型、梭形细胞/硬化型和多形型，其中胚胎型横纹肌肉瘤（embryonal rhabdomyosarcoma，ERMS）最为常见^1,2,3。对于新诊断的低危ERMS患者，当前的治疗策略主要采用手术切除局部肿瘤并联合化疗药物，包括长春新碱、放线菌素D和环磷酰胺。高危患者通常接受强化的多药联合化疗方案，加入异环磷酰胺和依托泊苷^4,5。尽管手术、化疗和放疗相结合的多模式治疗在实现局部肿瘤控制和清除微转移灶方面已显示出一定疗效⁵，但仍面临诸多挑战。现有化疗药物具有显著的毒性，包括神经毒性以及不可逆的肾脏和膀胱损伤⁶，对儿童和青少年患者尤其构成风险。此外，RD固有的异质性及其易复发的特性，凸显了开发更有效且靶向性强的治疗药物的迫切需求⁷。

在此背景下，本研究聚焦于一类具有独特药理特性的噻唑酮衍生物。噻唑酮衍生物表现出显著的抗炎、抗氧化以及调节细胞凋亡的活性⁸，展现出广泛的生物活性和良好的药物开发前景^9,10。Elgubbi 等人通过分子对接模拟发现，噻唑酮衍生物对关键靶点如人碳酸酐酶 IX（CA IX）具有强结合亲和力，CA IX 是一种在侵袭性肿瘤中过表达的缺氧诱导酶，提示其可能介导了噻唑酮衍生物的抗增殖作用¹¹。该计算研究阐明了噻唑酮衍生物与癌症相关蛋白之间的分子相互作用。2024年，El-Helw 等人报道，基于苯并喹啉的噻唑酮衍生物对癌细胞系具有强效活性，其中噻唑硫酮和噻唑类似物表现出最高的功效¹²。机制研究表明^10,13，这些化合物通过双重通路破坏肿瘤细胞的存活能力：（1）通过调节抗氧化通路诱导氧化应激；（2）直接抑制细胞增殖。这些发现强调了噻唑酮类化合物广泛的药理学特性，包括抗炎和抗菌活性。值得注意的是，诸如吡格列酮¹⁴和曲格列酮¹⁵等化合物主要用于2型糖尿病的治疗¹⁶，而4-噻唑酮衍生物则对白血病细胞表现出抗增殖效应¹⁷（图1）。这些化合物不仅在临床研究中显示出显著的治疗潜力，还能特异性靶向多种细胞信号通路，包括抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡以及调控细胞周期。噻唑酮衍生物的抗癌机制涉及多个信号通路，通过调节PI3K/Akt和NF-κB等关键通路，有效抑制肿瘤细胞的生长与存活。此外，噻唑酮衍生物还表现出对肿瘤微环境的调控作用，包括抑制血管生成和调节免疫反应¹⁸。噻唑酮衍生物多方面的机制作用使其成为开发新型抗癌药物的理想候选分子。

在前期研究中，我们通过铜催化的远程不对称炔丙基化反应，高效构建了具有相邻手性中心的噻唑酮衍生物。以炔丙基酯和噻唑酮为底物，在CuI催化及苯基取代的吡啶双噁唑啉配体存在下实现该反应。通过优化反应条件，噻唑酮衍生物的合成取得了较高的效率¹⁹。网络药理学作为一种系统生物学方法，能够揭示药物、靶点与疾病通路之间的复杂相互作用，革新了人们对癌症等复杂疾病治疗策略的理解与开发²⁰。本研究旨在初步揭示新型噻唑酮衍生物在横纹肌肉瘤（RD）治疗中的潜在治疗价值。通过整合网络药理学分析与细胞实验，筛选出具有优良活性的化合物，这些化合物可能通过协同调控PIK3CD和AKT1等五个核心靶点，影响PI3K-Akt等关键信号通路，发挥多靶点治疗作用。采用分子对接和分子动力学模拟方法，阐明化合物与靶蛋白之间的结合特性。此外，将初步建立构效关系模型，为后续结构优化提供参考依据。本研究不仅为横纹肌肉瘤的药物研发提供了新的候选分子，也凸显了多学科策略在探索药物多靶点作用机制中的积极作用。

方案

所有网络药理学操作均按照《网络药理学评价方法指南》²¹进行。本研究采用的综合网络药理学工作流程如图2所示。

噻唑酮衍生物的合成
本研究中所用的噻唑酮衍生物已在我们先前的工作中通过铜催化的远程不对称炔丙基化反应合成¹⁹。该反应以CuI为催化剂，手性Pybox配体（L1）作为立体控制核心，在DIPEA碱和甲醇溶剂体系中于-10 °C反应48小时，实现了炔丙基酯与噻唑酮之间的高对映选择性偶联。目标产物的收率最高可达89%，对映体比（er）为97.8:2.2，非对映体比（dr）为17.8:1。有关该系列化合物合成方法的详细信息，请参见先前的研究¹⁹。该方法表现出广泛的底物适用性，可兼容芳基（邻位、间位、对位取代基）、脂肪链以及稠环炔丙基酯，同时也适用于多种取代的噻唑酮，收率范围为51%至98%。该策略首次通过一步反应高效构建了含多个手性中心的噻唑酮骨架，为合成具有重要潜在应用价值的手性药物分子提供了一种高选择性且简便直接的方法。

网络药理学预测
噻唑酮衍生物的靶点预测：使用 KingDraw 软件生成噻唑酮衍生物的结构式，并通过 Open Babel 软件将相应的结构文件转换为 SMILES 编号。为预测该化合物对抗 RD 的潜在治疗靶点，我们采用了一种综合性的计算方法，结合了三个不同的靶点预测数据库：SwissTargetPrediction（http://swisstargetprediction.ch/）、TargetNet（http://targetnet.scbdd.com）和 SuperPred（https://prediction.charite.de）。在 TargetNet 分析中，我们设置了严格的筛选标准，仅选择概率 > 0 的基因。在 SuperPred 数据库中，我们采用了更为严格的筛选参数，仅保留模型准确率 > 90% 且概率 > 60% 的基因，以确保获得高置信度的靶点预测结果。

RD 靶点的预测：基于 GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）和 OMIM 数据库（https://omim.org/），我们对横纹肌肉瘤进行了检索。对于来自 GeneCards 数据库的数据，我们筛选评分大于 20 的结果，以获得与横纹肌肉瘤相关的基因。

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建与分析：噻唑酮类衍生物的潜在靶点与RD相关基因取交集。将噻唑酮类衍生物治疗人类胚胎型横纹肌肉瘤的潜在靶点上传至STRING数据库（https://www.string-db.org/），进行高置信度靶点PPI（蛋白质-蛋白质相互作用）关系分析。使用Cytoscape软件（http://www.cytoscape.org/）构建PPI网络，并基于节点度值筛选核心靶点。

化合物-疾病-靶点通路网络构建：通过药物-靶点-通路网络可清晰观察化合物和疾病的靶点及其相关通路，从而识别化合物治疗罕见病（RD）的潜在关键靶点和通路。首先，在电子表格中构建网络表和属性表。网络表的内容主要包括化合物与核心靶点之间的对应关系、核心靶点与所涉通路之间的对应关系，以及罕见病（RD）与主要通路之间的对应关系。属性表的内容主要是对网络表中的所有信息进行分类和命名。随后，打开 Cytoscape 软件，将网络列表上传至加载位置，设置起点和终点，上传属性表，最后调整图像形态。

整合功能注释与网络药理学分析——基因本体（GO）富集分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）：通过DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对核心靶点进行GO和KEGG富集分析。根据P值由小到大排序，选取GO中生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）类别前10项进行分析，对KEGG通路中前20项进行分析，并基于在线微生信平台绘制核心靶点的GO和KEGG气泡图。

分子对接：从 PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）中选取核心靶标蛋白，并下载这些核心靶标的结构文件。首先使用 PyMol 软件对蛋白进行脱水处理，随后分离配体与受体。接着使用 ADFRSuite 软件对蛋白进行加氢处理，并获取 AutoDock 分子对接软件所需的格点盒子参数。使用 AutoDock Vina 软件制备噻唑啉酮衍生物与核心靶标蛋白的 pdbqt 文件。然后进行噻唑酮衍生物与核心靶标蛋白的分子对接模拟。最后，利用 PyMol 软件对分子对接模型进行可视化分析。

分子动力学模拟：使用 amber99sb-ildn 力场和 TIP3P 水模型将 PDB 文件转换为与 GROMACS 兼容的 GRO 格式：
gmx pdb2gmx -f Pro.pdb -o Pro_temp_H.gro -ff amber99sb-ildn -water tip3p -ignh
添加立方周期性边界盒子，蛋白质与盒子边缘的距离为 1.2 nm：
gmx editconf -f Pro_temp_H.gro -o Pro_temp_H_box.gro -c -d 1.2 -bt cubic
用 TIP3P 水分子填充盒子：
gmx solvate -cp Pro_temp_H_box.gro -o Pro_temp_H_box_water.gro -p topol.top
通过添加 Na 离子使体系中性化：
gmx grompp -f ions.mdp -c Pro_temp_H_box_water.gro -p topol.top -ions.tpr
gmx genion -s ions.tpr -o Pro_temp_H_box_water_ion.gro -p topol.top -neutral
进行能量最小化：
gmx grompp -f minim.mdp -c Pro_temp_H_box_water_ion.gro -p topol.top -o em.tpr
gmx mdrun -v -deffnm em
进行 NVT 系综平衡：
gmx grompp -f nvt.mdp -c em.gro -r em.gro -p topol.top -o nvt.tpr
gmx mdrun -deffnm nvt -v
进行 NPT 系综平衡：
gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr
gmx mdrun -deffnm npt -v
启动生产阶段的分子动力学模拟：
gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -o md_0_1.tpr
gmx mdrun -deffnm md_0_1 -v

模拟完成后，使用 Visual Molecular Dynamics (VMD) 和 PyMOL 分析所得轨迹，并利用 g_mmpbsa 程序进行蛋白质与小分子配体之间的结合自由能分析。

药物对RD细胞活力的影响评估
将处于对数生长期的RD细胞（胚胎性横纹肌肉瘤细胞；STR认证）用胰蛋白酶消化，制备成浓度为1×10⁵个细胞/mL的单细胞悬液。将该细胞悬液以每孔100 µL（含1×10⁴个细胞/孔）接种至96孔板中，于37 °C、5% CO₂条件下培养，使细胞贴壁。待细胞贴壁后，弃去原培养基，更换为含1% FBS的无血清培养基100 µL，饥饿培养12小时。随后，弃去饥饿培养基，加入含不同浓度待测化合物的相应培养基各100 µL。对照孔加入含溶剂的培养基或正常培养基，空白孔则仅加入相应培养基而不接种细胞。将96孔板置于37 °C、5% CO₂条件下继续培养24小时（该时间长度经预实验确定为此类化合物对RD细胞最大抑制效应的最适观察时间，即细胞密度的OD值达到约1.0所需的时间）。培养结束后，每孔加入10 µL CCK-8溶液，再于相同条件下孵育1–4小时。最后使用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度值。以溶剂处理组作为对照组，空白孔用于背景校正，根据吸光度值计算细胞活力。

存活率% = [（对照组-空白组）-（实验组-空白组）]/（对照组-空白组）× 100%

结果

在本研究中，13 种噻唑酮衍生物（化合物 a-m；图 3、图 4）此前已合成¹⁹，并被选用于评估其对癌细胞的抑制活性（图 5）。在这些化合物中，化合物 m 在 100 µM 浓度下对 RD 细胞（胚胎性横纹肌肉瘤细胞）（STR 鉴定）²²表现出最高的抑制率。后续实验通过不同浓度（5 µM、10 µM、20 µM、50 µM、100 µM）处理，测得其对 RD 细胞的 IC50 值为 53.14 µM（图 6B）。如 图 6A 所示，在 10 µM 低浓度下，RD 细胞和 HepG2 细胞的抑制作用均较弱，未观察到显著效应。然而，当浓度为 100 µM 时，RD 细胞的存活率显著低于 HepG2 细胞。

讨论

网络药理学常用于预测和筛选复杂中药成分中的潜在活性分子，并阐明中药复方中多组分、多靶点、多通路协同作用的机制。本研究采用网络药理学方法，通过构建化合物-靶点-通路-疾病网络，系统探讨了我们新合成的噻唑酮衍生物抗横纹肌肉瘤RD细胞的潜在作用机制。在本研究中，我们系统评估了13种噻唑酮衍生物对人横纹肌肉瘤RD细胞增殖的抑制作用，并基于其结构特征进行了构效关系（SAR）分析。所有化合物均表现出不同程度的抗增殖活性，其中化合物m的抑制作用最强，可使细胞活力降至对照组的21.7%。当以100 µM浓度作用于RD细胞和HepG2细胞时，RD细胞的存活率显著低于HepG2细胞，表明化合物m即使在高浓度下对HepG2细胞的抑制作用也较弱，而对RD细胞具有特异性抑制作用。

结构分析表明，苯环取代基的性质对生物活性具有显著影响。与叔丁基或正戊基等大体积取代基相比，乙基等小烷基与更高的活性相关，表明过大的空间位阻可能阻碍与靶标的结合。此外，甲氧基取代的位置起着关键作用：邻位甲氧基化合物 l（RPR = 66.7%）的活性显著高于其对位取代的对应物 a（RPR = 95.0%），提示局部电子效应或构象偏好...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CCK-8 检测试剂盒	Beyotime Biotechnology Co., Ltd.	C0038	一种基于水溶性四唑盐还原生成有色产物来测定细胞活力和增殖的试剂盒。
超净工作台	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd	SW-CJ-1FD	一种提供层流空气的工作站，用于在无菌环境中操作细胞培养物及其他敏感材料。
CO2 培养箱	Heal Force	HF90	一种可控制温度、湿度和 CO2 浓度的环境设备，用于细胞培养以维持最佳生长条件。
DMEM 高糖培养基	cytiva	SH30022.01	一种高葡萄糖浓度（4.5 g/L）的细胞培养基，适用于多种细胞类型，包括快速增殖的哺乳动物细胞。
胎牛血清（FBS）	YEASEN	40130ES76	细胞培养基中常用的添加剂，提供细胞增殖所必需的生长因子、激素和营养成分。
倒置显微镜	OLYMPUS	IX51	一种物镜位于载物台下方的显微镜，可从底部观察培养瓶或培养板中的细胞培养情况。
酶标仪	Diatek	DR-200Bs	一种通过检测吸光度、荧光或发光信号来分析微孔板样品中生物、化学或物理事件的仪器。
磷酸盐缓冲液（PBS）	浙江金诺生物医学科技有限公司	GNM20012	一种常用于生物学研究的缓冲溶液，用于洗涤细胞、稀释溶液以及维持 pH 稳定性。
RD（胚胎性横纹肌肉瘤细胞）（STR 鉴定）	上海复祥生物科技有限公司	FH0712	该细胞系已通过短串联重复序列（STR）分析进行鉴定，具有明确的遗传背景和细胞身份，从而确保实验数据的可靠性和可重复性。
RMPI 1640 改良培养基	cytiva	SH30809.01	一种最初为人类白细胞细胞开发的广泛使用的细胞培养基，现已被应用于多种哺乳动物细胞类型。
胰蛋白酶-EDTA 溶液	浙江金诺生物医学科技有限公司	GNM25200	一种通过消化细胞外蛋白并螯合钙离子来使贴壁细胞从培养表面脱离的溶液。