一种用于同时检测基孔肯雅、登革热和寨卡病毒感染的即时检测三重PCR平台

摘要

本文推荐一种完全自动化的集成系统，该系统采用三重PCR技术，利用单一样本同时诊断基孔肯雅热、登革热和寨卡病毒的共感染，从而优化临床和基层医疗实验室的检测效率。

摘要

基孔肯雅热（CHIKF）是一种由蚊子传播的急性病毒性疾病，于1952年在坦桑尼亚首次发现，近年来在中国呈间歇性传播，并出现越来越多的本地暴发疫情。截至2025年7月，作为当前疫情中心的广东省已报告本地病例4,824例，其中仅一周内新增感染病例近3,000例。疫情的迅速蔓延迫切需要先进的诊断技术，此类工具对于支持一线防控工作至关重要。我们提出一种可快速同步检测登革病毒（DENV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）和寨卡病毒（ZIKV）感染的解决方案，以提升早期疫情预防与控制能力。该方法包括为边境口岸和基层医疗机构开发定制化的检测流程。

在共感染情况下，传统的CHIKV和DENV诊断方法通常缺乏足够的灵敏度和特异性。由于CHIKV、DENV和ZIKV具有相似的传播模式和临床症状，对其进行同步监测至关重要。本实验方案介绍了一种基于TaqMan探针的三重qPCR方法，可在单管反应中于90分钟内同时检测这三种虫媒病毒。与病毒培养和血清学检测相比，该方法通过高特异性地识别活动性感染和共感染状态，提高了检测效率，同时简化了操作流程，并无需特殊仪器设备。

使用临床样本和外部质量评估（EQA）样本进行验证，结果与金标准单重检测方法的符合率达到100%。该方法可作为监测地方性流行区域发热性疾病的有效工具，特别是在资源有限、需快速控制疫情暴发的地区。

引言

基孔肯雅热（CHIKF）是一种日益流行的虫媒病毒性疾病，主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）传播。该疾病在热带地区反复暴发，临床表现为急性发热性疾病，常伴有严重关节痛和持续性关节炎¹。截至7月26日，中国广东省佛山市累计报告实验室确诊的基孔肯雅热病例达4,824例，其中87.2%的病例集中在顺德区。这种显著的地理聚集性给区域公共卫生系统带来了巨大负担，并导致高昂的医疗支出以及更广泛的宏观经济挑战²。

在CHIKV、DENV和ZIKV病毒传播范围日益重叠的背景下，当前的诊断方法面临三个主要局限性。首先，血清学检测无法区分急性感染，因为在病毒清除后抗体可长期持续存在¹。其次，病毒培养技术灵敏度较低，且需要数天时间，从而阻碍了及时的临床决策。第三，尽管定量PCR检测具有高特异性（超过95%），但其无法在单次反应中检测共感染，而这一缺陷尤为突出，因为在印度报告的CHIKV-DENV共感染率高达12.8%³。系统发育监测表明，流行病学模式正在发生转变。在印度2019–2022年疫情中占主导地位的ECSA谱系，其包膜蛋白已获得趋同突变：E1-A226V（增强蚊媒感染性）和E2-K252Q（与免疫逃逸相关）。这些突变导致出现了一种毒力更强的基因型，近期来自喀拉拉邦和马哈拉施特拉邦的监测研究已对此有所报道³。与此同时，中国也面临ECSA基因型输入的风险，云南暴发疫情已有相关记录，此外多个省份（包括云南）已报告其他基因型的本地传播⁴。

这些现实情况迫切需要在资源有限的条件下实现：（i）尽管临床表现存在重叠，仍能进行鉴别诊断⁵；（ii）开发无需依赖传统实时定量PCR（qPCR）所必需的复杂仪器设备的诊断检测方法⁶；以及（iii）对新型即时检测技术（包括RT-LAMP和基于CRISPR的方法）进行全面验证⁵。为应对这些诊断挑战，我们提出一种快速三重PCR检测方法，该方法采用完全自动化的集成系统，可在单次反应中同时检测CHIKV、DENV和ZIKV。我们通过与已建立的单重检测方法进行直接比较，验证了该三重qPCR检测方法的性能⁵，后者作为参考标准。下文将详细描述三重检测法及参考用单重检测法的操作流程。两种方法的对比分析结果见“代表性结果”部分。

方案

本研究遵循中国广州南方医科大学广东省人民医院伦理委员会制定的伦理指南（批准号：KY2025-510-01）。有关本研究中所用材料（试剂、化学品、设备和软件）的详细信息，请参见材料表。

1. 受试者选择

1. 选择年龄在18至60岁之间的受试者。
2. 选择在症状出现后12天内出现急性发热性疾病（腋下体温 ≥ 38 °C），并伴有皮疹、关节痛或颈部淋巴结病，且近期曾前往基孔肯雅热流行地区的受试者；或具有相同旅行史的无症状个体。
3. 排除标准：7天内使用过抗菌或抗病毒药物，或发热疾病可明确归因于确诊的HIV感染或恶性肿瘤者。

2. 样品采集与处理

1. 检查采样盒的外包装是否破损且未过期，然后取出内部材料。
2. 让受试者手臂伸展。确定肘正中静脉，绑扎止血带，并用70%酒精棉片消毒穿刺部位。
3. 使用不含抗凝剂的采血管，从受试者肘前静脉采集1~3 mL血液。
4. 轻轻将采血管倒置5~8次，于室温静置30分钟，使其充分凝固。
5. 将血液样本在4 °C下以1000 × g 离心10分钟。离心后获得的血清样本可立即进行检测。
6. 小心地将上清液血清分装至无菌微量离心管中。血清应立即用于检测，或分装后于-80 °C保存，用于后续通过qPCR进行病原体核酸分析。

3. 基于自动化三重qPCR检测CHIKV、DENV和ZIKV

1. 试剂与试管的准备
   1. 从储存处取出所有所需试剂，在室温下解冻。
   2. 目视检查每支密封的TD检测管是否有损坏或密封失效。丢弃任何有缺陷的检测管。
   3. 短暂涡旋震荡TD核酸提取缓冲液5秒，以确保其均匀。
   4. 无菌条件下，将500 µL均质缓冲液加入TD提取试剂管（含紫色冻干磁珠）中。
   5. 剧烈涡旋混合30秒，直至所有组分完全溶解，且微珠完全重悬。
   6. 将全部重悬溶液转移至预先标记的TD检测试管中。
2. 样品上样
   1. 用移液器吸取200 µL清澈、无溶血、无脂血的血清，加入已准备好的TD检测试管中。
   2. 将试管盖紧并倒置十次，充分混匀。
      注意：倒置过程中，让石蜡层在管内短暂漂浮。这是正常步骤的一部分。
3. 仪器操作与数据采集
   1. 将密封的检测管插入分析仪的指定插槽中。
   2. 在触摸屏界面上输入样本标识信息。
   3. 按 S起始检测 以启动完全自动化的封闭管式工作流程。
      注意：系统将自动执行条形码扫描和核酸提取 通过 磁珠捕获及荧光PCR扩增，无需进一步人工干预。标准程序包括在95 °C下变性3分钟，随后进行40个循环的扩增。
4. 结果解读
   1. 运行结束后，在同一屏幕上观察所有三个靶标（CHIKV、DENV、ZIKV）及内参的扩增结果。
   2. 记录自动生成的读数， "阳性" "阴性" 或 "无效"，针对每种目标病原体在其相应的荧光通道中。
      注意：该系统内部软件采用 37.0 的循环阈值（Ct）进行自动判读，无需手动数据分析。

4. 用于方法比较的参考单重qPCR检测

1. 核酸提取试剂的准备
   1. 从试剂盒中取出预包装的96孔板。轻轻敲击96孔板，使试剂和磁珠全部集中至孔板底部。小心撕去铝箔封膜，避免震动96孔板，以防液体溅出。
   2. 在96孔板的第1列和第7列中，先加入20 µL蛋白酶K，随后加入200~300 µL待提取样本。
   3. 自动化核酸提取（磁珠法）
      1. 将预包装的96孔板（含样本）放入自动化核酸提取仪系统的相应插槽中。
      2. 核酸提取过程如下：在实验室腔室内使用磁棒吸附结合核酸的磁珠。将磁珠复合物转移至下一个指定的试剂孔中。启动搅拌装置，通过快速反复搅拌使液体与磁珠充分混合。让自动化核酸提取仪自动执行后续步骤：i) 细胞裂解：25 °C下10分钟。ii) 核酸吸附：70 °C下15分钟，进行3次磁吸附。iii) 洗涤：混合2分钟（重复3次），随后进行两次磁吸附（每次15秒）。iv) 洗脱：进行两次（每次5分钟），进行3次磁吸附。最终获得高纯度的核酸。
   4. 如需立即检测，直接从第6列和第12列中吸取含有核酸的洗脱液。如需长期保存，将剩余的核酸样本转移至-20°C保存。
2. 扩增试剂的准备
   注意：对于单重PCR反应，需使用三种不同的酶和三种相应的反应混合物分别制备三个独立的PCR管。试剂准备需分三步完成。由于各步骤相似，以下仅以基孔肯雅病毒（CHIKV）检测试剂的制备为例进行说明。
   1. 从试剂盒中取出核酸扩增反应液和CHIKV反应液（含CHIKV特异性引物/探针）。解冻后置于22~25 °C环境中，剧烈震荡充分混匀，然后进行短暂离心（1000 x g，15秒，22~25 °C）。
   2. 计算总反应数为N + 2（其中N = 待测样本数，+2 = 一个阴性对照和一个阳性对照）。在适当大小的微量离心管中配制总反应混合液（Master Mix），每反应加入：17 µL 核酸扩增反应液（含缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、UDG酶），3 µL CHIKV反应液（含CHIKV靶基因的引物、探针及内参IC）。充分涡旋混匀Master Mix。在室温（22~25 °C）下以10,000 x g短暂离心15秒，使液体沉至管底。将20 µL Master Mix分装至各PCR反应管中。
   3. 加入核酸和质控样本：向上述已准备好的PCR反应管（20 µL）中，分别加入5 µL待测样本核酸、阳性对照和阴性对照，使每管终体积为25 µL；盖紧管盖，进行瞬时离心（1000 x g，15秒，22~25 °C），然后将反应管放入PCR仪中。
3. PCR扩增
   1. 设定循环程序如下：预变性：50 °C 15分钟，然后95 °C 15分钟（两步共构成1个循环）；随后进行40个循环：94 °C变性15秒，55 °C退火45秒。
   2. 设定荧光信号检测参数如下：FAM荧光标记CHIKV基因；VIC荧光标记作为试剂盒内参的IC基因。在55 °C时采集数据。反应结束后，确保数据已保存以供后续分析。
   3. 使用qPCR专用软件进行数据分析
      1. 样本信息：在软件的孔板布局图中，标注各样本加样位置对应的样本类型（如阳性对照、阴性对照、未知样本、内参基因等）。
      2. 放置反应管：打开仪器加热模块的盖子，将密封的PCR板或反应管平稳放入，确保其与加热模块紧密贴合，并紧闭模块盖子（以避免温度不均）。
      3. 启动反应：确认软件中的程序设置无误后，点击开始运行，并记录实验编号以备后续查询。
      4. 停止运行并取出反应管：程序完成后，等待加热模块温度降至50 °C以下，然后打开盖子，小心取出PCR板或反应管。根据需要进行下游分析或样本保存。
      5. 数据分析 在进行分析前，需确认：i) 所有样本及内参的扩增曲线呈典型S型；ii) 荧光阈值设定在指数扩增期，所得Ct值 ≤ 38个循环（CV < 5%）；iii) 对照结果有效，表明无污染。若任一条件未满足，或某样本出现异常扩增（如曲线形态异常或Ct值处于临界范围），应重新检查整批样本或特定标本。
      6. 使用软件处理原始数据，确定Ct值，采用自动选定的阈值；若样本Ct < 38且其扩增曲线呈S型，则判为阳性。

5. 生物安全与废物处理

1. 将所有材料转移至指定的防刺穿生物危害容器中，并按照机构医疗废物处理系统的规范，经高压灭菌去污后进行最终处置。立即将这些材料转移至标有高风险废物标识的防泄漏、防刺穿生物危害容器中。根据机构指南，对所有含有扩增产物的废弃物进行高压灭菌处理（例如，121 °C 持续 30 分钟），以灭活病原体并降解核酸。最后，通过指定的医疗废物管理系统处置已灭菌的废弃物。
   注意：所有操作步骤均须遵循生物安全二级（BSL-2）规范，使用适当的个人防护装备，以最大限度降低暴露风险。

结果

为验证三重PCR检测系统的稳定性和准确性，我们从本实验室选取了五份具有临床代表性的样本，并选取了十份外部EQA盲样进行验证。这五份代表性临床样本包括阴性和阳性病例（S1-S5），其中包含CHIKV和DENV阳性样本，用于展示该检测方法的临床适用性，并支持对检测性能的内部验证（表1）。2025年针对新发蚊媒病原体的EQA盲样样本集包含10份灭活血浆样本（DZC2511-2520），其中含有不同浓度和组合的CHIKV、DENV和ZIKV，其浓度和组合由国家临检中心（NCCL）预先确定。使用本研究的三重qPCR平台对该样本集进行分析，结果与参考结果完全一致（表2），证实了该检测方法的稳健性和临床适用性。

三重qPCR检测在所有验证样本中均能可靠地区分阴性和阳性感染（图1）。在临床队列中，该检测鉴定出两个样本（S2、S3）为基孔肯雅病毒（CHIKV）阳性，一个样本（S5）为登革病毒（DENV）阳性，而样本S1和S4对三种检测靶标均为阴性（

讨论

CHIKV 是一种正义单链 RNA 病毒，属于披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（alphavirus）⁷。全球气候变暖加速、国际贸易加剧以及旅游网络的扩展，共同增加了人类暴露于虫媒病毒威胁的风险⁸。在过去十年中，分子诊断技术的快速发展从根本上改变了传染病管理的格局。在这些技术中，实时荧光定量 PCR（qPCR）因其检测周期短、分析灵敏度极高、定量准确性高以及在常规操作中显著降低交叉污染风险，已在中国各地的临床实验室中获得广泛应用²。通过将单次采血与可同时检测 CHIKV、DENV 和 ZIKV 的三重 qPCR 平台相结合，我们现在能够在同一分析窗口内筛查单一感染和共感染情况。这一简化的检测流程为临床医生提供了可操作的实验室证据，有助于支持早期、精准且果断的公共卫生干预措施。

本研究通过将三重qPCR整合到一个完全自动化、封闭式反应管平台中，推动了虫媒病毒诊断技术的发展，该平台专为现场即时检测而优化。与需要专用设备的常规多重PC...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动化核酸提取仪	DAAN	Smart 32	用于DNA提取
BECKMAN X-12	BECKMAN	ALA04H01	用于  血清离心
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	生物安全柜
E-Centrifuge	WEALTEC		离心去除管壁残留液体
全自动医用PCR分析仪	Bioustar‌	UP0102	荧光定量PCR扩增
基孔肯雅病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）	DAAN	20250804	检测  基孔肯雅病毒基因
登革病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）	DAAN	202504003	检测  登革病毒基因
登革病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）	Bioustar‌	20250724	检测  登革病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病毒基因
寨卡病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）	DAAN	202508041	检测寨卡病毒  基因
核酸提取试剂盒	DAAN		提取核酸
SLAN 全自动医用PCR分析系统	HONGSHI		数据分析
SLAN-96S 实时荧光定量PCR仪	HONGSHI	SLAN-96S	荧光定量PCR扩增
超低温冰箱（DW-YL450）	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C 用于试剂储存
Vortex-5	Kylin-bell		用于试剂混匀