采用胶原酶诱导的小鼠脑出血（ICH）模型进行兰索拉唑治疗。兰索拉唑不仅减轻了ICH引起的肠道损伤，降低了脂多糖（LPS）和IL-1β的水平，还抑制了脑部炎症反应。此外，兰索拉唑改善了ICH小鼠的学习与记忆能力（长期神经功能）。
研究文章
采用胶原酶诱导的小鼠脑出血（ICH）模型进行兰索拉唑治疗。兰索拉唑不仅减轻了ICH引起的肠道损伤，降低了脂多糖（LPS）和IL-1β的水平，还抑制了脑部炎症反应。此外，兰索拉唑改善了ICH小鼠的学习与记忆能力（长期神经功能）。
脑内出血（ICH）可能损害胃肠道并引发肠道损伤，从而导致不良的临床预后。本研究探讨了兰索拉唑对脑内出血小鼠肠道损伤及神经功能的影响。采用立体定位注射胶原酶的方法建立脑内出血小鼠模型。评估了神经功能、脑含水量、血脑屏障通透性、肠道损伤及肠道通透性。同时检测了血液和脑组织中脂多糖（LPS）和白细胞介素-1β（IL-1β）的水平。兰索拉唑治疗与减轻肠道损伤、降低血液和脑组织中LPS和IL-1β水平、减少脑含水量以及抑制脑部炎症反应相关。尽管兰索拉唑给药未改善小鼠在Garcia评分、前肢放置试验和转棒试验（短期神经功能）中的表现，但显著增强了其学习和记忆能力（长期神经功能）。这些结果表明，兰索拉唑治疗与脑内出血小鼠长期神经功能改善及肠道损伤减轻相关。
出血性卒中的死亡率和致残率较高。近年来，中国卒中的发病率不断上升，已成为首要死亡原因1。尽管脑内出血（ICH）相对少见，但其致死性显著高于缺血性卒中。研究报道，ICH发生后1个月内的死亡率高达40%；此外，约75%的幸存者在1年后无法独立生活2。
大脑通过多种途径与胃肠道进行通信，包括迷走神经、肠神经系统以及肠道微生物代谢。脑-肠轴是一个公认且具有临床意义的调节系统3。肠黏膜在调控水、电解质和营养物质吸收的同时，阻止病原体和毒素进入血液循环。脑出血（ICH）可破坏这一肠道屏障，引发胃肠道损伤。屏障功能障碍反过来会导致营养不良、免疫抑制以及不良临床预后4。ICH 引起的肠道通透性增加，使有害的内源性物质进入血液，触发全身性炎症反应及多器官功能障碍综合征。脑出血后肠黏膜受损甚至可导致肠道细菌易位入血，可能引发全身性感染5。许多患者会出现肠动力障碍、微生物群失调、黏膜出血和败血症。一项既往研究表明，脑出血可导致肠道病原体和毒素向脑部迁移6。
兰索拉唑是一种质子泵抑制剂（PPI），可通过不可逆地抑制质子泵来减少胃酸分泌。它被用于治疗胃和十二指肠溃疡、糜烂性食管炎、胃食管反流病以及非甾体抗炎药相关的胃溃疡7。先前的一项研究表明，PPI预防性使用对缺血性卒中患者的预后产生负面影响8。其他已发表的研究提示PPI使用与认知功能下降之间存在关联。一项流行病学研究显示，使用PPI的患者发生痴呆和阿尔茨海默病的风险增加9。一项比较长期使用PPI者与非使用者的前瞻性队列研究发现，PPI使用与痴呆风险升高相关，作者建议将PPI用于高风险患者时应避免作为预防措施10。本研究旨在探讨兰索拉唑对脑出血（ICH）小鼠肠道损伤以及短期和长期神经功能（特别是学习和记忆能力）的影响。我们假设兰索拉唑可能通过其对肠屏障的保护作用，抑制脂多糖（LPS）的渗透，从而减轻全身性和神经炎症，进而改善ICH小鼠的神经功能。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
实验操作遵循美国国立卫生研究院（NIH出版号8023，1978年修订版）《实验动物护理与使用指南》。本方案已获得烟台大学伦理委员会批准（批准号：YTDX20240526）。危险材料根据机构化学废弃物处理规程进行处置。图1展示了实验设计的示意图。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 动物详情
雄性CD-1小鼠，体重22–25 g，饲养于12 h光照/12 h黑暗循环的房间内。动物可自由获取食物和水。
2. ICH 小鼠模型的制备
根据既往报道建立小鼠脑出血（ICH）模型11。简言之，小鼠以赛拉嗪（10 mg/kg）和氯胺酮（90 mg/kg）麻醉后，固定于立体定位仪上。在右侧冠状缝（中线外侧2.2 mm，前囟后方0.2 mm）处钻一小孔。将微量注射器插入右侧脑组织，深度为颅骨表面下3.5 mm。使用微量输注泵，以0.15 µL/min的速度注入细菌胶原酶（0.075 U溶于0.5 µL磷酸盐缓冲液[PBS]中）。5分钟后缓慢拔出针头。假手术组小鼠注射等体积的PBS替代胶原酶。用骨蜡封闭骨孔，缝合头皮切口。维持动物体温在37°C直至苏醒。
3. 实验设计
将雄性CD-1小鼠随机分为三组：假手术组、模型组和兰索拉唑组。脑出血（ICH）模型的建立方法如前所述。在诱导ICH后30分钟，兰索拉唑组小鼠以30 mg/kg剂量给予兰索拉唑（兰索拉唑剂量依据既往研究12选择），连续三天每日给药一次。假手术组和模型组小鼠则接受腹腔注射PBS。在ICH后第3天，采用Garcia评分、前肢放置试验和转棒试验评估短期神经功能。在诱导ICH后第29天，进行新物体识别试验和水迷宫试验以评估长期神经功能。
4. 加西亚试验
两名研究人员在不知分组情况的条件下，根据先前报道的方案13进行Garcia评分测试。神经功能通过0至21分的评分系统进行评估。该评估包含七个子测试，每个子测试评分范围为0至3分（0 = 最差，3 = 最佳）。
5. 前肢放置试验
在完成加西亚试验后，按照先前描述的方法14进行前肢放置试验。将小鼠垂直握住，使其与桌面平行，让其触须轻轻接触表面。观察连续10次试验中的前肢放置反应。左侧前肢放置百分比计算公式为：左侧前肢放置次数 /（左侧前肢放置次数 + 右侧前肢放置次数）× 100%。
6. 旋转杆实验
前肢放置试验后，将小鼠置于以5 rpm转速旋转的棒上训练3分钟。随后在4分钟内将转速从5 rpm加速至30 rpm。记录每只小鼠在5分钟内停留在棒上的持续时间，并记录逃避潜伏期15。
7. 肠道通透性与脑水肿检测
转棒实验后，从每组中随机选取六只小鼠。根据先前的方法16，以300 mg/kg剂量经口灌胃给予FITC-葡聚糖。3小时后，用异氟烷麻醉小鼠，并从眶后静脉丛采集血液，在4 °C、11,000 ×g条件下离心5分钟。使用荧光酶标仪在485 nm激发波长和528 nm发射波长下检测FITC-葡聚糖含量。随后将动物断头处死，取其脑组织右半球，称重获得湿重。将组织在100 °C下干燥24小时，测定干重。脑含水量（%）按以下公式计算：[（湿重 − 干重）/ 湿重] × 100%。
8. 血脑屏障（BBB）通透性评估
转棒实验结束后，从每组中随机选取六只小鼠以评估血脑屏障通透性。按4 mL/kg剂量腹腔注射2%伊文思蓝溶液。3小时后，用异氟烷麻醉小鼠，并通过PBS进行心脏灌流。取脑组织右半球，按3:1的比例（脑组织：三氯乙酸）加入50%三氯乙酸匀浆。匀浆液在4 °C条件下以15,000 × g 离心20分钟。取500 µL上清液与500 µL 70%乙醇混合，于4 °C避光孵育过夜。在610 nm波长处测定伊文思蓝浓度，并通过标准曲线进行定量。数据以每毫克脑组织中伊文思蓝的微克数（µg/mg）表示。
9. 肠道和脑组织的组织病理学检查
转棒实验结束后，从每组中随机选取三只小鼠。使用异氟烷对小鼠进行麻醉，采集空肠、回肠和脑组织，并用10%甲醛固定。将组织切成5 µm厚的切片，进行苏木精-伊红（HE）染色。由两名不了解分组情况的实验人员在显微镜下对肠道和脑组织进行组织病理学检查。在代表性切片中计数血肿周围的小胶质细胞数量。每只动物选取三个切片，每个切片随机选择五个视野进行细胞计数。
10. LPS 和 IL-1β 的测定
转棒实验后，从每组中随机选取六只小鼠。使用异氟烷麻醉小鼠后采集血液。血液样本在4 °C条件下以5,000 × g 离心10分钟，收集血清。取脑组织的右半球，按1:3的比例（脑组织重量（克）与PBS体积（毫升）之比）制备脑匀浆。匀浆在4 °C条件下以12,000 × g 离心10分钟。采用BCA试剂盒测定上清液中的蛋白质浓度。根据制造商说明书，使用ELISA试剂盒检测血清和脑匀浆中LPS和IL-1β的水平。
11. 透射电子显微镜
用于电子显微镜检查时，在转棒实验后从每组中随机选取三只动物。小鼠用异氟烷麻醉，并按照机构批准的方案，经心脏灌注0.1 M PBS中含2%戊二醛和2.5%多聚甲醛的固定液。随后取脑、空肠和回肠组织，置于4 °C、0.1 M卡可基酸盐缓冲液（pH 7.4）中含2%戊二醛的溶液中固定过夜。样品随后转移至1%四氧化锇溶液中，在室温下处理1小时。组织被切成超薄切片（50 nm）。脱水后，切片用醋酸铀和柠檬酸铅染色，以便在透射电子显微镜下观察。所有切片均采用盲法评估，并使用透射电子显微镜拍照。
12. 新物体识别
在脑出血模型建立后第29天，进行新物体识别实验以评估小鼠的学习和记忆功能。第1天，在实验装置（长：40 cm，宽：40 cm，高：40 cm）中不放置任何物体，让小鼠自由探索5分钟。第2天，在装置中放置两个相同的物体，允许小鼠探索5分钟。24小时后，将其中一个物体替换为一个新物体，再次让小鼠对这两个物体探索5分钟。当小鼠的鼻尖接触物体或其头部朝向物体且距离在1 cm以内时，记录为探索时间。测量并计算小鼠探索新物体所用的时间。对新物体的探索时间越长，表明其学习和记忆能力越好。
13. 莫里斯水迷宫
在脑出血模型建立后第32天，采用莫里斯水迷宫实验评估学习和记忆功能。实验装置由一个圆形水池（直径：100 cm，高度：40 cm）组成，池中注水（水深：25 cm），水温维持在22 °C ± 1 °C。一个逃生平台（直径：9 cm） submerged 于水面下1 cm处。在导航试验中，小鼠每天进行四次试验，记录找到平台所需时间作为逃避潜伏期。若小鼠在60 s内未能找到平台，则将其轻轻引导至平台。第五天进行持续60 s的探测试验。通过记录逃避潜伏期、穿越平台位置的次数以及在目标象限停留的时间来评估记忆功能。数据采用视频追踪软件进行分析。
14. 统计分析
数据采用 GraphPad Prism 软件 7.0 版进行分析。结果以均值 ± 标准差表示。使用 Shapiro-Wilk 检验评估各组数据是否符合正态分布。组间差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验。对于非参数比较，采用 Kruskal-Wallis 检验，随后进行 Dunn 检验。*p* 值 <0.05 被认为具有统计学显著性。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
兰索拉唑对脑出血小鼠短期神经功能的影响
与假手术组相比，脑出血（ICH）组小鼠在Garcia评分中得分显著降低（p < 0.01）。然而，与ICH组相比，兰索拉唑治疗组小鼠的Garcia评分未见改善（p > 0.05）（图2A）。同样，与假手术组相比，ICH组小鼠左前肢放置百分比显著降低（p < 0.01）。与Garcia测试结果一致，兰索拉唑治疗并未提高左前肢放置百分比（p > 0.05）（图2B）。在转棒实验中，与假手术组相比，ICH组小鼠在转棒上的停留时间明显缩短（p < 0.01）。兰索拉唑治疗未能改善该实验中的表现，因为在转棒上的停留时间未见显著增加（p ...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
肠道损伤是脑出血（ICH）患者常见的并发症。ICH 引起的肠道损伤可导致营养不良、住院时间延长、预后不良甚至死亡17。本研究利用 ICH 动物模型，首次证明了兰索拉唑可减轻 ICH 小鼠的肠道损伤。尽管兰索拉唑对短期神经功能未显示出有益作用，但它显著改善了长期神经功能预后。
无论是缺血性还是出血性卒中，均为全球主要的致死原因之一。卒中发生后，机体将产生全身性应激反应，可能引发脑外器官的病理性改变。肠道是该全身反应的主要靶器官之一。临床上，卒中引起的消化道症状如黏膜损伤、腹胀和便秘等较为常见18,19。在缺血性卒中模型中，动物表现出肠道屏障功能障碍，可能导致肠道细菌易位并扩散至肺等其他器官5。既往研究表明，脑出血（ICH）可引起肠道屏障功能障碍、黏膜破坏、蠕动功能受损、炎症反应及氧化应激。这些病理过程最早可在ICH发生后2小时出现，并持续长达7天
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者声明不存在利益冲突。
感谢来自理文编辑（Edanz）（www.liwenbianji.cn/）的Angela Morben对本稿件初稿的英文文本进行编辑。本研究得到了山东省泰山学者基金项目资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BCA试剂盒 | 碧云天生物技术 | P0009 | |
| 胶原酶 | 西格玛奥德里奇 | 128M4107v | |
| 伊文思蓝染料 | 西格玛奥德里奇 | MKCG7507 | |
| 荧光素标记葡聚糖 | 西格玛奥德里奇 | 46944 | |
| GraphPad Prism 7.0 | GraphPad统计软件，波士顿， 马萨诸塞州，美国，www.graphpad.com | Prism 7.0 | |
| 兰索拉唑 | 山东裕欣药业有限公司 | 524093053 | |
| LPS ELISA试剂盒 | 武汉优尔生商贸有限公司 | M25036407 | |
| 小鼠 | 济南朋悦实验动物繁育有限公司 | SCXK20220006 | |
| 微量输注泵 | 世界精密仪器公司 | Micro 3 | |
| 微量注射器 | 哈密尔顿公司 | SYR 10 μL | |
| 奥林巴斯显微镜 | 奥林巴斯有限公司 | IX-70 | |
| 转棒仪 | 潘纳实验室有限公司 | LE8205 | |
| 立体定位仪 | Kopf仪器公司 | Model 902-A | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | 碧云天生物技术 | PI301 | |
| 透射电子显微镜 | 日本电子株式会社 | JEM-100SX | |
| 视频追踪软件 | 潘纳实验室有限公司 | Smart 3.0 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表
申请许可