柔性电磁线圈贴片促进大鼠全层皮肤伤口愈合

摘要

本实验方案演示了一种在大鼠身上制备全层圆形皮肤伤口的方法，并通过使用可传递脉冲电磁场的柔性铜线圈贴片来促进伤口愈合。

摘要

慢性且大面积的皮肤伤口因愈合延迟和高感染风险而带来显著的临床挑战。脉冲电磁场（PEMF）治疗是一种可促进组织修复的非侵入性方法。本研究描述了一种可重复的大鼠伤口模型方案，采用柔性印刷铜线圈贴片连接定制的PCB控制器，对背部全层伤口施加局部PEMF刺激，对侧伤口作为未经治疗的对照。通过定期拍照和测量伤口面积来评估愈合进程。该方案提供了一种实用且可调节的系统，用于评估和优化基于PEMF的治疗方法 慢性伤口，脉冲电磁场，动物模型，伤口愈合，皮肤修复，大鼠，电磁刺激，全层皮肤缺损 体内 在多种条件下进行，重点关注再生医学中的局部应用及参数调整。参数选择基于成纤维细胞增殖的正交CCK-8筛选实验，测试范围为0.25–1.3 mT、10–40 Hz以及每日30–90分钟；主效应分析确定1.3 mT、30 Hz和每日60分钟为最优参数水平，并在后续实验中采用 体内 检测。

引言

慢性皮肤伤口（如糖尿病足溃疡）正日益成为重要的健康问题，常导致愈合受损、感染甚至截肢¹。传统治疗往往耗时较长且费用高昂，促使人们关注能够加速组织修复的辅助疗法²。电磁场治疗即为其中一种方法，具有无创性，并已在临床前和临床研究中显示出促进愈合的效果^2,3,4,5。极低频范围（~1-100 Hz）的脉冲电磁场（PEMFs）可刺激与组织修复相关的关键细胞过程，包括血管生成和生长因子的释放^2,6,7。

例如，脉冲电磁场（PEMF）通过上调成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）并促进血管生成，显著加速了糖尿病和健康啮齿类动物的伤口闭合⁸。类似地，在愈合受损模型（如糖尿病大鼠）中，PEMF治疗已被证明可提高愈合速率，并增加新生组织的抗张强度⁹。在临床方面，已针对慢性伤口患者开展了PEMF疗法的研究。一项针对糖尿病足溃疡患者的随机初步试验报道，PEMF暴露可增强微循环血流，并呈现出加快伤口闭合的趋势¹⁰。总体而言，PEMF在其他类型的伤口中也显示出有益效果，例如，接受脉冲磁场治疗的烧伤伤口愈合情况得到改善¹¹。这些研究共同强调了电磁刺激作为伤口护理辅助疗法的潜力^8,9,10,11。

与传统的有线刺激器相比，磁力驱动无需经皮连接器，降低了与硬件相关的并发症风险。无线磁性系统已在其他领域实现了组织特异性刺激，例如，在交变磁场下，导电性神经引导 conduit 可产生感应微电流，电流幅度由磁场参数间接决定¹²。磁性策略还可促进血管化——这是皮肤愈合过程中的关键瓶颈——因为静态或动态磁场，无论是单独使用还是与磁响应性生物材料联合使用，均已被证明可调节内皮细胞行为及促血管生成信号通路¹³。这些前期研究推动了我们开发一种可穿戴方案：一种贴合、可拆卸的线圈贴片，可在保持无创性和外部可编程性的同时，将脉冲电磁场（PEMF）集中于创面床^12,13。在以下实验方案中，我们将详细说明在大鼠全层皮肤缺损模型中实施该 PEMF 治疗的步骤，包括设备应用、刺激方案及疗效评估。

方案

所有动物实验程序均经江南大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（JN. No2025-0630S0360-915[408]）。实验采用雄性SD大鼠（6–8周龄，体重约200–250 g）。实验前，大鼠单只饲养，自由摄食和饮水，维持12小时光照/黑暗循环，符合《实验动物护理和使用指南》的要求。

1. 全层切除性伤口的制备

1. 准备动物和手术区域。
   1. 在诱导室中使用 3-4% 异氟烷诱导麻醉。失去翻正反射后，通过鼻罩将麻醉维持在约 2%。
   2. 将大鼠俯卧位放置在无菌手术台上。使用电动剪刀剃除背部胸区（从肩胛区至中腰部，包括侧腹部）的毛发。
   3. 注意：应从正中线两侧各去除至少 5 × 5 cm 的毛发，以确保清晰的手术通路和线圈放置空间。
   4. 先用 70% 乙醇对剃毛区域进行消毒，再使用碘伏溶液。重复乙醇/碘伏擦拭三次，最后一次使用碘伏。
   5. 用无菌纱布覆盖手术区域，仅暴露计划切口的部位。
2. 制作双侧全层切除性伤口。
   1. 使用无菌手术标记笔在背部侧腹部标记两个直径为 2 cm 的圆圈，分别位于前肢后方正中线两侧。
      注意：确保两个圆圈大小相等且对称分布，以便进行动物自身对照比较^14,15。
   2. 使用无菌剪刀或手术刀切除标记的圆形皮肤区域。去除表皮、真皮和肉膜层，形成全层伤口（约 3.14 cm²）。
   3. 通过无菌纱布轻压止血。在对侧侧腹部采用相同技术制作一个相同的 2 cm 伤口。
      ​注意：伤口床应暴露筋膜或肌肉，无残留真皮组织。
   4. 在造模后立即给予术后镇痛（例如，皮下注射利多卡因 4 mg/kg）。
3. 分配实验组。
   1. 采用自身对照设计，其中一个伤口接受脉冲电磁场（PEMF）治疗，对侧伤口作为对照。
   2. 另设一组独立队列，使用假装置（相同但不通电的线圈），以排除装置存在本身的影响。
   3. 保留未经处理或假处理的对照组，以区分电磁效应与操作或敷料处理效应。

2. PEMF 设备的应用

1. 处理伤口并放置线圈。
   1. 将无菌薄纱布或半透性薄膜直接覆盖在指定接受脉冲电磁场（PEMF）治疗的伤口上。确保完全覆盖伤口床。
   2. 将柔性铜线圈贴片置于已包扎的伤口上方（图1）。使线圈居中，确保伤口位于线圈中央。
      注意：线圈直径（约5 cm）可能超出伤口边缘；需确保伤口仍处于有效磁场区域内。
2. 固定线圈。
   1. 使用医用级胶带轻轻缠绕躯干以固定线圈。保持线圈与敷料紧密接触，但避免压迫胸腔。
   2. 如需要，可在线圈上方放置一条柔性铝条以稳定位置。避免限制呼吸或局部血流。
   3. 将导线引离身体（例如朝向头部），防止缠绕。
3. 实施PEMF刺激。
   1. 将线圈连接至PCB控制器（图2），并启动设备。设置刺激参数为频率30 Hz、磁场强度约1.3 mT，每日治疗60分钟。
   2. 每天在同一时间（±1小时）进行刺激，以保持一致的时间间隔。
      注意：这些参数是基于正交CCK-8筛选实验（0.25–1.3 mT，10–40 Hz，30–90 min/天，表1）确定的，结果显示1.3 mT、30 Hz和60 min/天为最优组合（表2）。
   3. 在对照组伤口上放置一个相同的非激活线圈，持续1小时，以实施假刺激。应明确标记假刺激线圈，避免混淆。
4. 移除设备并检查伤口。
   1. 60分钟后关闭控制器。小心移除线圈及粘贴材料。
   2. 检查伤口是否有出血、水肿或其他不良反应。如有需要，更换无菌纱布。
      ​注意：在1小时刺激过程中，线圈表面温度接近环境温度，未观察到明显升温现象。
5. 提供治疗后护理。
   1. 佩戴伊丽莎白圈以防止自伤。确保佩戴合适，不影响呼吸或进食。
   2. 用纱布轻轻包裹后肢，以减少对背部伤口的抓挠。
   3. 监测大鼠直至从麻醉中完全恢复。继续给予镇痛处理（例如，每12小时给予利多卡因4 mg/kg，持续2–3天，或根据机构规程执行）。
   4. 在研究期间每日重复PEMF治疗（例如，连续14天）。

3. 伤口监测与数据采集

1. 拍摄伤口图像。
   1. 在造模后第0、3、7、10和14天对伤口进行拍照。必要时对动物实施轻度麻醉，以防止移动。
   2. 每张图像中均应包含测量标尺，并将相机垂直于伤口表面、在固定距离处拍摄^14,15。
2. 测量伤口面积。
   1. 使用ImageJ软件中的参考标尺校准图像比例，勾画伤口边缘以计算面积（mm²）。
   2. 记录各时间点的伤口面积，并计算相对于基线的伤口闭合百分比。
   3. 定量比较经PEMF处理的伤口与对照组伤口。
3. 采集组织用于组织学分析（可选）。
   1. 根据IACUC批准的实验终点程序处死动物。
   2. 切除伤口组织样本，并用福尔马林固定，用于后续组织学处理。
   3. 进行石蜡包埋及染色（如H&E染色、Masson三色染色），以评估胶原沉积、再上皮化和血管生成情况^13,16。

4. 数据分析与解释

1. 生成伤口闭合曲线。
   1. 绘制每组随时间变化的伤口闭合百分比。
   2. 计算愈合速率以及达到预设闭合阈值所需的时间。
2. 进行统计学分析。
   1. 汇总所有动物的伤口面积数据，并计算每个时间点的平均值 ± 标准差。
   2. 检验数据正态性（Shapiro-Wilk 检验）和方差齐性（Levene 检验）。
   3. 采用双因素方差分析（因素为"处理"和"时间"）分析差异。若发现显著交互作用，则进行 Tukey 事后检验。
   4. 定义统计学显著性为 *p < 0.05 和 **p < 0.01。

结果

在该全层大鼠伤口模型中，通过柔性线圈贴片进行的每日脉冲电磁场（PEMF）治疗与对照组相比，显著加快了伤口闭合速度。为严格评估治疗效果，根据方案部分所述的实验设计，将大鼠分为三组：自身对照组（每只大鼠有一个接受PEMF治疗的伤口和一个对侧未治疗的伤口，数据分析时合并数据）、假手术对照组（PATCH：伤口覆盖无电源的线圈）以及未治疗对照组（CTRL：仅接受标准伤口护理）。图1、图2和图3展示了各组在14天内的伤口愈合进程。第0天时，两组大鼠的成对伤口大小相等，证实初始条件一致。第3天时，对照组和PEMF组的伤口面积均有所减小。然而，统计分析（双因素方差分析）表明，在这一早期时间点，PEMF组与对照组之间的伤口面积差异无统计学意义（p > 0.05）。但从第7天开始，接受PEMF治疗的伤口闭合速度明显快于对照组。到第7天，PEMF组的伤口明显小于对照组。这一趋势在第10天更加显著，此时PEMF治疗的伤口已接近闭合，而对照组伤口仍明显较大。到第14天，PEMF组...

讨论

关键步骤包括创建对称的全层伤口，确保线圈贴片平整地覆盖在无菌屏障上且无间隙，以及保持每天一致的暴露时间；任何偏差都可能降低磁场递送效果，并增加愈合结果的变异性。

本研究存在若干局限性，在解读研究结果和评估其转化潜力时应予以考虑。首先，该方案是在健康雄性SD大鼠（6–8周龄，200–250 g）的急性切除性伤口模型上进行验证的，因此未能充分反映临床上受损的愈合环境，如糖尿病、缺血、感染、衰老或免疫抑制等情况。此外，仅评估了一组单一的脉冲电磁场参数（1.3 mT，30 Hz，每日60分钟） 体内，并根据以下方案进行选择： 体外 成纤维细胞增殖筛选；最佳剂量可能因物种、伤口类型与深度、敷料或屏障厚度以及所针对的生物学过程（如炎症、血管生成或重塑）而异。尽管模拟结果和装置设计支持局部递送，但伤口表面的有效作用场仍可能随线圈与组织间距、屏障厚度及贴片对齐程度而变化，从而可能导致递送剂量出现日间波动。

此外，尽管采用同体对侧设计可提高实验效率并控制个体间差异，但系统性创伤反应和反复操作可能影响实验结果；...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔细胞培养板	白迪	H908002	CCK-8 检测
黏附显微镜载玻片	细胞检测	P/N.80312-3161	设备用于  H&& E/马松染色
镇痛剂（盐酸利多卡因注射液）	HUAMU	70011657	阿片类镇痛药，4 mg/kg（用于疼痛控制）
麻醉机	RWD Life Science（深圳，中国）	R520-Iso	配备氧气供应的异氟烷蒸发器
全自动免疫组化染色仪	Leica	21.2201	自动免疫组织化学染色
活检打孔器（20 mm）	Integra Miltex	#33-37	2 cm直径圆形皮肤打孔器
数码相机	华为 Mate 70 Pro	N/A	≥用于伤口成像的1200万像素
CD31 抗体	Abcam	ab182981	免疫组化内皮标志物（图4B）
CD34抗体	Abcam	ab81289	免疫组化内皮标志物（图4B）
细胞计数试剂盒-8（CCK-8）	Biosharp	BS350B	用于体外PEMF参数筛选（OD450）
细胞培养皿（10 cm）	BaiDi	H802004	10 cm（100 mm）组织培养皿，用于成纤维细胞培养
细胞培养基（例如，DMEM + FBS）	BaiDi	L100-500	用于CCK-8筛选中的成纤维细胞培养
CO2 培养箱	赛默飞世尔科技	BB150-2TCS-L	成纤维细胞培养
柔性铜线圈	定制自制（内部制作）	N/A	螺旋打印线圈（5 cm 直径，聚酰亚胺）
控制器板（PEMF 发生器）	定制构建（自主设计）	N/A	定制PCB，以30 Hz驱动线圈，磁场强度约1.3 mT
电动理发剪	Wahl 或 Oster（宠物美容）	Model 9160	用于剃除毛发的动物美容电推剪
伊丽莎白圈（啮齿类动物）	MukeBio	MK-EC-01	防止伤口干扰
包埋台	Epredia HistoStar	A81000002	组织学处理（如进行）
口罩	vedeng	V531596	维持麻醉
成纤维细胞（细胞系 L929）	Procell	CL-0137	用于CCK-8增殖筛选的细胞
有限元仿真软件（例如，COMSOL Multiphysics）	COMSOL	CM010004	磁场模拟（图5B-C）
柔性铝片夹板	亲爱的	1592	防止线圈移位的支撑装置
镊子	雄伟	01625	用于手术中处理皮肤和敷料
苏木精 && 伊红（H&E) 自动染色与封片一体机	DRS-Prisma-P+FILM	61770249	常规组织学染色耗材
图像分析软件	美国国立卫生研究院	版本 1.54	用于伤口面积测量（例如，ImageJ）
图像分析软件	美国国立卫生研究院	版本 1.54	用于伤口面积测量（例如，ImageJ）
诱导室	RWD Life Science (深圳, 中国)	802-00132-00	异氟烷麻醉诱导
红外热成像相机	HIKMICRO	H11	监测线圈表面温度（图 5A）
聚维酮碘消毒剂 10%	HYNAUT	N/A	皮肤消毒剂（碘伏）
异氟烷	RWD生命科学（深圳，中国）	20037015	吸入用麻醉药（USP级）
利多卡因注射液 10%	SANMA	N/A	用于术后镇痛
Masson三色染色试剂盒	BASO	C250202	用于胶原蛋白/细胞外基质可视化的耗材
医用皮肤标记笔和尺子	Tondaus	N/A	在伤口照片中包含比例尺
酶标仪	赛默飞世尔科技	A51119500C	CCK-8实验中OD450的测定
切片机	Epredia HM 340E	23900670	组织学/免疫组化切片（如进行）
多聚甲醛组织固定液	分享-生物	SB-C009	动物组织样本的固定
大鼠饲养笼	FengQiao	CP-JM	用于单独饲养的标准大鼠饲养笼。
大鼠，Sprague Dawley（雄性，6–8 周	WeiJingyu SUZHOU	SCXK2024-0004	200–250 克；单笼饲养；经 IACUC 批准使用
手术刀	Jinhuan	35W0602	用于切除性伤口的制备
半透膜敷料	ZD	Q20189	替代性伤口屏障
统计分析软件（例如 GraphPad Prism 或 R）	Software Mackeiv	10.6.9(890)	双因素方差分析及事后多重比较
无菌纱布	ZD	3141626	伤口敷料/保护屏障
无菌手术巾	ZD	V271617	皮肤准备后铺巾手术区域
手术剪	雄伟	01627	用于切除性伤口的制备
注射器和针头	MINANK	20193141643	用于皮下镇痛给药
全片扫描仪	3DHISTECH	N/A	数字切片扫描