利用表皮撕取、透明化处理及基于人工智能的图像分析表征气孔与表皮性状

摘要

本实验方案介绍了一种利用表皮撕片、透明化技术及人工智能辅助图像分析，对两个不同物种的气孔和表皮性状进行比较研究的方法。其目标是实现对气孔功能相关细胞结构的高通量、可重复定量分析，以服务于农业应用及广泛的植物学研究。

摘要

准确表征气孔形态及其周围表皮性状对于理解气孔功能至关重要。本文提出了一种比较性实验方案，结合两种互补技术——表皮剥离法和叶片透明法，用于评估两种生态特征不同的双子叶植物Fraxinus excelsior和Taraxacum officinale的气孔及表皮细胞大小、形状和密度。该方案详细描述了样品制备、成像以及性状量化步骤，既包括成本和人力投入较低的手动测量方法（组织透明与表皮剥离），也涵盖可支持高通量应用的人工智能辅助图像分析方法。研究评估了三种分割工具——基于YOLOv8的气孔检测模型、通用型深度学习细胞分割工具和基于像素的分类器——在不同方法中的准确性与适用性。在手动分析和人工智能分析中，两种技术（剥离法与透明法）在气孔和表皮性状上均表现出显著差异。人工智能工具实现了可重复的量化结果，其中基于YOLOv8的气孔检测模型（StoManager1）在气孔性状分析中表现最佳，而通用型深度学习细胞分割工具（Cellpose）在表皮细胞分割中效果最优。基于人工智能的性状检测在T. officinale中高度一致，但在F. excelsior中应用受限，且结果仍与手动测量存在差异，说明物种特异性的解剖结构和图像质量会影响方法的适用性。这些发现表明，尽管人工智能辅助分析为气孔和表皮性状的量化提供了有效框架，但在推广或用于高通量应用之前，专家验证和预实验测试仍然必不可少。

引言

气孔是表皮上的微小孔隙，在调节植物气体交换和蒸腾作用中起着至关重要的作用。因此，了解气孔功能的形态学基础对于提高作物性能至关重要¹。尽管大多数关于气孔结构与功能的研究仅关注气孔形态，但要全面理解气孔的响应性，还需对周围表皮细胞的大小和形状进行表征。准确量化这些性状是理解气体交换及作物改良背后结构-功能关系的基础。

随着作物改良日益依赖先进的基因编辑技术，了解影响光合作用、内在水分利用效率和碳同化的关键形态性状（如气孔）变得至关重要。在持续的环境变化背景下，这一需求尤为紧迫，因为面对更频繁的干旱和热浪，人们对能够在保持光合能力的同时维持产量的抗逆作物的需求不断增长^2,3。因此，迫切需要建立标准化的成像与分析流程。使用清漆或指甲油进行表皮剥离是获取叶片表面印模以测量气孔及表皮细胞的大小、形状和密度的最简单方法^4,5,6。该方法操作快速、非破坏性，可实现样本的快速处理。组织透明化方法则是一种替代方案，可同时表征叶脉网络，并有望更全面地分析叶片水分运输特性。

化学透明化可软化组织并使其具有光学透明性，从而能够在不造成机械损伤的情况下原位成像气孔和表皮细胞。该方法广泛适用于多种组织类型，包括干燥或脆弱的样本，不仅可用于气孔成像，还可用于维管网络、荧光成像以及内部解剖结构的可视化^{7,8,9,10,11,12}，从而实现气孔性状与其他功能性状的联合分析。目前已存在多种透明化方法，涉及有机溶剂、水溶液、过度水合或水凝胶包埋^13,14,15，这些方法在处理时间、成像兼容性及试剂可获得性方面各不相同。本文所采用的方案操作简单、成本低廉，且无需特殊技能。与需要化学固定、包埋和切片等繁琐步骤的光学显微镜或扫描电子显微镜等方法相比，这两种技术均具有成本低、速度快的优势。

传统分析气孔和表皮特征的方法通常依赖于对显微图像的手动分割，这种方法劳动强度大、耗时长，且容易受到观察者主观偏差的影响，从而限制了通量，降低了分析流程的效率¹⁶。此外，诸如毛状体和不规则细胞壁等解剖结构特征，进一步增加了性状定量的一致性难度。尽管自动图像分析工具在高通量数据提取方面展现出巨大潜力，但这些工具通常针对特定植物组织进行了优化，难以在不同叶片类型和制备方法之间直接通用。例如，StoManager1（补充图1）采用基于YOLOv8的目标检测模型，在气孔检测中具有高准确性，但其训练专门针对气孔性状。Cellpose（补充图2）是一种大规模预训练的通用分割模型，当输入数据与预训练模型（如cyto、cyto2）相似时表现良好，而这些模型最初基于动物细胞和细胞器数据建立。Ilastik（补充图3）是一种基于像素分类的工具 ，依赖用户自定义标注。Cellpose和Ilastik均具有良好的用户友好性，但各自可能需要重新训练或精细调优，以适应图像质量、背景伪影以及组织特异性特征的差异。

此外，气孔和表皮形态在不同物种间表现出高度变异性¹⁷。气孔密度和大小等性状尤其具有可变性，但它们通常呈负相关，并共同决定物种间气孔动力学的差异。较大的气孔可在一定程度上补偿较低的密度，但通常表现出较慢的动力学特征⁵，这在日益频繁的热浪条件下可能处于劣势，因为在这些情况下，快速的气孔响应对于维持碳同化和防止过度失水至关重要。总体而言，这种变异性增加了气孔性状测量的复杂性，并可能影响所选实验方案的有效性以及基于人工智能结果的稳健性。

本方案结合了两种经典制备技术——表皮撕取法和化学透明法——与现代人工智能（AI）和机器学习（ML）工具，用于性状的分割与测量。通过使用两种具有不同生态策略的常见喜光双子叶植物（F. excelsior 和 T. officinale），我们分析了气孔和表皮性状的变异，以评估三种方法的比较结果以及可能产生误差的环节。研究评估了三种AI工具的性能：StoManager1（一种基于YOLOv8的深度学习模型，用于气孔检测）、Cellpose（一种通用的深度学习分割工具）和ilastik（一种基于像素的表皮组织分类器）。该整合方法可实现气孔和表皮性状的可重复、高通量定量分析，为生态学和农业研究中的表型分析提供了稳健且可扩展的框架。然而，某些解剖特征，如密集的毛状体、较厚的角质层或细胞边界对比度低，可能降低分割的准确性，在选择撕取法或透明法以及应用基于AI的定量分析时应予以考虑。

据我们所知，这是首个将表皮剥离与化学透明化方法相结合，并利用多种基于人工智能的分割工具对气孔和表皮性状进行定量分析的逐步实验方案。该方案通过整合经典显微技术与易于获取的机器学习工作流程，减少了人为偏差，提高了通量，并促进了跨物种的可重复表型分析。因此，该方法可广泛应用于生态学、作物改良和气候变化研究，并可通过模型再训练或迁移学习为后续工具的扩展提供基础。

方案

注意：采集蒲公英（T. officinale）和欧洲白蜡树（F. excelsior）叶片无需特定许可或审批，因为这些非保护物种采自公众可进入的园艺区域。所有样本的采集均符合机构及当地相关规定。

1. 植物材料采集

1. 选择健康的叶片进行比较分析。本实验选用两种气孔分布不同的双子叶植物中健康、向阳的成熟叶片：仅在下表皮具有气孔的下表皮气孔型树木 F. excelsior，以及上下表皮均具气孔的两面气孔型多年生草本植物 T. officinale。
2. 每种样品类型或采样位置取 3–5 片重复叶片。
3. 使用洁净的剪刀或剃须刀片将叶片切下，立即将切下的叶片放入水中，以防脱水。
4. 采集后，将叶柄完全浸入水中，并于 4°C 条件下保存。
5. 在采样后 48 小时内进行第 2 或第 3 部分的实验操作。

2. 气孔印迹剥离物的制备与观察

注意：透明化处理过程中产生的所有化学废弃物均按照机构及当地安全法规进行处理。含戊二醛的溶液需单独收集，并作为危险化学废弃物处置。含氢氧化钠（NaOH）的溶液在允许的情况下，须中和至pH 6–8后方可处置。稀释的次氯酸钠（漂白剂）和乙醇溶液在符合机构及市政法规规定的场所，可用大量冷水冲入下水道处理。. TBO溶液应根据当地指南收集并作为化学废物处理。使用者应咨询所在机构的安全办公室，以获取批准的处置程序。

1. 如有必要，用清水轻轻冲洗所选叶片表面，以去除灰尘或碎屑。立即用滤纸或柔软的纸巾吸干叶片表面，去除多余水分。切勿自然风干，因为这可能导致组织收缩，从而影响气孔和表皮细胞大小测量的准确性。
2. 使用永久性记号笔在显微镜载玻片上标注样品信息（例如物种、叶片侧面及制备日期），以确保在成像、分析和数据解读过程中每个样品均可追溯，并便于样品的妥善保存以供后续使用。
3. 对于具有非腺毛（多毛）表皮毛的物种，在制备表皮剥离样本前需用剃刀片去除叶片表面的表皮毛，因为其存在可能遮蔽细胞边界，降低图像质量（图1）。
4. 使用小刷子将一层薄而均匀的透明、不可延展的指甲油（避免使用“可拉伸”或“可剥离”型产品）涂抹于目标区域。始终选择叶片的中央部分进行剥离制备，避开叶尖和叶基。
5. 让指甲油完全干燥（通常在室温下需2–5分钟）。长时间暴露可能导致组织变色（例如较软叶片上出现红色调），这种变色可能在最终的剥离样本中可见，并干扰需要均匀着色的后续分析。
6. 干燥后，将一条透明胶带贴在涂有指甲油的区域。从指甲油的一侧边缘开始，逐渐将胶带平铺于表面，轻压以确保良好粘附，并避免产生气泡或褶皱。佩戴丁腈手套以防止留下指纹。
7. 小心地将胶带连同指甲油膜（表皮印迹）一起揭下。
8. 将胶带（粘性面向下）放置在干净的显微镜载玻片上，避免折叠或重叠。
9. 将制备好的载玻片在室温下存放，避免灰尘和直射阳光。
10. 在复合光学显微镜下以400倍放大倍数观察载玻片。根据软件操作指南保存图像，并附上相应的比例尺。

3. 准备和观察透明化切片

1. 取约 1 cm² 大小的叶片组织块。所有操作步骤均需佩戴丁腈手套，并在通风橱中进行。
2. 将样品转移至已标记的样品瓶中，加入固定液（4% 戊二醛溶于 0.1 M 磷酸缓冲液，pH = 6.9）（注意：有危险性），于 4°C 下固定 24 小时（见表 1，用于配制固定液）。
3. 用移液器吸除固定液，加入蒸馏水覆盖样品，静置 30 分钟。重复此步骤三次（图 2A-C）。
4. 吸除蒸馏水，加入 1 M NaOH 溶液（将 20 g NaOH 溶于 0.5 L 蒸馏水中）覆盖样品。
5. 在叶片透明化过程中，NaOH 溶液会变为绿色。每天更换一次新鲜 NaOH 溶液。持续处理 3 至 4 天，或直至样品变为淡黄色且 NaOH 溶液保持澄清（图 2D-F）。
6. 吸除 NaOH 溶液，加入漂白剂（5% NaClO）。市售的家用漂白剂若浓度符合要求，亦可使用。
7. 将样品在漂白剂中孵育 1–2 分钟。样品将变为白色且半透明（图 2G-I）。
8. 吸除上一步溶液，用蒸馏水覆盖样品 2 分钟。随后通过梯度蒸馏水-乙醇系列进行脱水处理，顺序如下：75:25、50:50、25:75 和 100% 乙醇。
9. 吸除乙醇，加入 3% 的甲苯胺蓝 O 醇溶液（TBO，将 3 g TBO 溶于 100 mL 100% 乙醇中）覆盖样品，静置过夜。
10. 吸除染色液，用 100% 乙醇覆盖样品 2 分钟。然后按以下梯度蒸馏水-乙醇系列重复此步骤：25:75、50:50、75:25，最后用蒸馏水清洗（图 2J-L）。有关透明化过程中常见问题及解决方案，请参见图 3。
11. 将样品保存在蒸馏水中，并于 4°C 下存放，直至观察使用。
12. 将样品转移至载玻片上，滴加一滴蒸馏水，加盖盖玻片，用于显微观察和成像。
13. 在复合光学显微镜下以 400 倍放大倍数观察玻片。根据软件操作指南保存图像，并附上相应的比例尺。更多详细信息请参见材料表。

4. 图像分析与测量

1. 使用 Fiji²³（ImageJ 发行版，版本 1.54p）进行图像处理与分析。
2. 使用“直线”工具在比例尺上绘制一条线，然后选择 分析 > 设置比例尺，将已知距离修改为比例尺的长度，并将长度单位更改为 µm。
3. 进入 分析 > 设置测量项，确保勾选 面积和 Feret 直径 选项。
4. 使用 多边形选区 工具勾勒出目标对象的轮廓，按 M 键记录测量值。
5. 在 Fiji 中测量以下气孔和表皮性状，并对透明化样品和气孔印痕样品均进行计算（图 3）。
6. 计算气孔数量（Ns）。
   1. 确定平均气孔面积（As）。
   2. 确定平均气孔宽度（Ws）：使用 Feret 最小直径。
   3. 根据以下公式计算气孔密度（SD）：
      
      ；单位 Ia（用于测量的叶片面积，mm²）。
   4. 确定平均表皮细胞面积（Ae）。
   5. 使用以下公式确定表皮细胞密度（ECD）：
      

5. 统计学

1. 使用单因素方差分析（ANOVA）和 Tukey 的 HSD 事后检验来检验样本组之间的差异。
2. 所有统计分析均在 R²¹ 中进行。
3. 每种物种分析共计 3 个重复叶片，并从每个叶片观察 3 个表皮撕片。

6. 人工智能辅助分析

1. 选择用于分割的机器学习工具。
   1. 根据目标结构（气孔或表皮细胞）、图像质量和分析目标，选择合适的基于机器学习的分割工具。
   2. 使用针对气孔的深度学习模型，以自动检测和测量气孔性状；使用通用型深度学习模型或基于像素的分割工具进行表皮细胞分割。
   3. 参见“机器学习工具与软件”部分，了解具体的软件实现（补充文件）。
   4. 在大规模分析前，先对部分图像进行试点测试，以评估分割性能并识别潜在的假阳性来源。
2. 准备计算环境。
   1. 使用配备8-12核处理器、至少32 GB内存，以及支持NVIDIA CUDA、显存不低于24 GB的GPU的工作站。
   2. 使用高分辨率显示器（建议为4K），以便于标注和视觉检查。
   3. 根据开发者说明安装所有选定的软件工具，并记录软件版本，以确保可重复性。
3. 为机器学习分析准备图像。
   1. 以TIFF或PNG格式导入显微图像，尽可能使用8位或16位灰度图像。
   2. 确保每张图像包含可见的比例尺，或在分析前已完成空间校准。
   3. 选择杂质、褶皱或气泡较少，光照均匀，且细胞边界清晰的感兴趣区域。
   4. 排除边缘模糊、阴影强烈或对比度低的图像，因为这些因素会降低分割准确性。
4. 执行气孔分割。
   1. 将图像载入针对气孔的深度学习模型（补充文件第1节）。
   2. 根据物种和图像分辨率，配置检测参数，包括对象大小限制和置信度阈值。
   3. 运行自动检测，以分割气孔复合体，并提取气孔数量、面积和Feret直径等输出指标。
   4. 导出分割掩膜和测量数据表，用于后续分析。目视检查分割叠加结果，必要时手动排除错误检测的对象。
5. 执行表皮细胞分割。
   1. 将图像载入通用型深度学习分割工具或基于像素的分类器（补充文件第2-4节）。
   2. 使用包含表皮细胞、细胞边界和背景的手动标注代表性图像，训练或微调模型。
   3. 运行分割以生成对象掩膜，并将掩膜导出至ImageJ/Fiji或等效图像分析软件中进行后处理。
   4. 应用基于尺寸或分位数的滤波，去除小的假阳性对象，并通过视觉检查验证分割准确性，然后提取表皮细胞面积和细胞密度等指标。
6. 记录参数并执行质量控制。
   1. 记录分析过程中使用的所有软件版本、参数设置、滤波阈值和硬件规格。
   2. 保留代表性分割叠加图像，以记录分割质量。
   3. 在进行统计分析或数据报告前，目视验证自动分割结果。
7. 所有机器学习处理的图像准备
   1. 样本成像
      ​注意：由于基于机器学习的分割依赖于强度梯度、边缘连续性和一致的对象几何形状，而非生物学背景，因此图像预处理和区域选择对模型性能和误差结构具有决定性影响。
      1. 拍摄经透明化处理或剥离的叶片表面的高分辨率图像，并显示比例尺。为获得良好的机器学习工作流程，应确保图像中可测量对象清晰、连续且具有高对比度。
   2. 区域选择与图像质量
      ​注意：在第6.7.1节图像采集后，需对图像进行目视检查，若图像尺度允许，应手动选择无伪影的感兴趣区域用于后续分割。选择伪影最少的区域（如杂质、褶皱、气泡、光照不均等）。对于气孔模型（如StoManager1），应优先保证气孔开口气清晰可见，保卫细胞轮廓分明。对于表皮细胞模型（如Cellpose、ilastik），应确保细胞轮廓上的强度梯度稳定；不连续或低对比度的边缘会显著降低分割性能。边界定义不清的图像应在分割前排除或重新处理。
   3. 文件格式
      建议以TIFF或PNG格式保存文件（推荐使用8位或16位灰度图像进行分割）。
   4. 可选的图像增强
      1. 若边界较弱，可在ImageJ/Fiji中增强对比度或减去背景。
      2. 重点关注边缘几何特征，因为这些特征可能产生被误认为细胞边界的虚假梯度。
      3. 在整个数据集的所有图像中一致地应用此类调整。
         注意：应特别关注边缘几何特征，因为阴影、光晕或不均匀的背景梯度可能产生人工强度过渡，机器学习模型可能将其误判为细胞边界。
8. StoManager1（v1.0.0 GUI版本）
   注意：StoManager1利用卷积神经网络（YOLOv8-seg-x）实现植物叶片气孔的自动化、高通量检测、测量与分析。该工具可从多种图像类型中量化关键气孔指标（如面积、密度、气孔/保卫细胞比值、聚集指数等），减少人工操作和偏差，有助于大规模生态学和生理学研究。提供用户友好的Windows应用程序，除可选的后处理外，无需编程技能（补充文件第1节）²³。
   1. 运行StoManager1：安装与配置
      1. 通过GitHub（https://github.com/JiaxinWang123/StoManager1）或独立的Windows应用程序（补充文件第1节）(https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.7686022)²³获取。
      2. 确保库版本兼容（Python依赖项）；若已安装其他机器学习/图像处理软件，可能发生冲突。
   2. 通过图形用户界面（GUI）或命令行接口启动StoManager1。
   3. 选择包含叶片图像的输入目录。
   4. 模型选择：勾选YOLOv8-seg-x模型以获得基于分割的更详细指标；若使用边界框模型（YOLOv3），则不勾选，其输出指标较少。
   5. 参数调优：根据成像方式/物种需要，调整检测阈值、图像分辨率、掩膜膨胀程度和对象大小限制。当部分气孔未被检测到时，建议使用默认参数，并主要采取以下措施：（1）降低检测置信度阈值，以恢复更多真实气孔，同时检查假阳性检测情况；（2）提高图像分辨率，较大值可改善对小气孔的检测，但会增加计算负担。
   6. 运行分割：
      1. 点击“开始处理”以检测、分割并测量气孔及完整气孔结构。
      2. 点击“统计分析”以处理组级统计数据。
   7. 收集结果。输出将保存至 YOUR_OUTPUT_PATH/Predict-output/Output_csv/（分割模式）或直接保存至YOUR_OUTPUT_PATH（边界框模式）。CSV文件包含单个对象和汇总指标；同时生成掩膜和结果图像。
   8. 启动批量处理。
   9. 完成后，收集输出结果：分割掩膜和每张图像的CSV结果文件。每张图像的结果包括：气孔数量和气孔面积、Feret直径（最大/最小值）、保卫细胞指标、聚集/均匀/发散指数以及气孔/保卫细胞比值。
   10. 使用Excel、R或Python对结果进行进一步统计分析和可视化。
   11. 质量控制：目视检查掩膜和叠加图像。如有需要，可通过尺寸、形状或手动校正去除异常对象（见下文）。
       注意：Cellpose和ilastik的详细操作流程及后处理步骤见补充文件。为在大型数据集和复杂图像上获得最佳性能，建议使用配备8-12核处理器、至少32 GB内存，以及支持NVIDIA CUDA、显存不低于24 GB的GPU的系统。强烈推荐使用大尺寸高分辨率显示器（建议为4K），以提高标注和可视化的效率。

结果

剥片法与透明法结果的比较

T. officinale 和 F. excelsior 的气孔及表皮性状均表现出变异性，具体取决于样品是透明处理还是撕取表皮（图4）。通常情况下，透明处理的样品能提供更清晰的细胞边界，更清楚地显示保卫细胞的形状和气孔开口大小，但偶尔因组织层重叠而遮蔽较小的气孔，导致尺寸估计值偏高。F. excelsior 中，透明处理样品的平均气孔面积和气孔宽度显著高于撕取样品；而在 T. officinale 中未观察到显著差异。F. excelsior 的撕取样品中气孔密度显著更高，而 T. officinale 中未检测到方法间的效应。两种物种的表皮细胞面积在不同方法间无差异，但 F. excelsior 撕取样品中的表皮细胞密度略高。

总体而言，方法间的差异具有性状和物种特异性，表明剥离法为气孔测量提供了一种可靠的方案，尤其适用于气孔大小存在变异的情况（例如在发育中的叶片中），而表皮性状则基本不受影响（图5）。

人工智能结果及其与剥离和清除方法的关联性

气孔特异性模型 StoManager1 在表皮撕取图像上的气孔检测更为可靠（图6），而在透明化样本上的性能则显著下降（图7）。为了进一步评估 StoManager1 在不同制样方法下的表现，我们比较了在 T. officinale 和 F. excelsior 中使用表皮撕取和透明化图像进行气孔性状检测的结果（图8）。在 T. officinale 中，该模型在不同制样方法下均能可靠地检测气孔的存在和密度。然而，其检测结果与人工测量值存在显著差异（表2 及 图5 和 图8）。大多数气孔性状在撕取样本与透明化样本之间差异显著（p < 0.05）（图8），表明基于人工智能的检测流程对样本制备方法高度敏感，在大规模应用前需进行严谨验证。相比之下，在 F. excelsior 中，由于上表皮无气孔，检测仅限于下表皮；而在透明化样本中，检测结果不稳定，常出现大量假阳性（图8）。这些结果凸显了物种特异性的解剖结构特征和图像质量对基于人工智能分析方法有效性的强烈影响。通用型机器学习工具如 Cellpose（图9A）和 Ilastik（图9B）在表皮撕取图像上对表皮细胞的分割效果优于透明化图像。然而，这两种工具在两种制样方法（撕取和透明化）下均产生大量假阳性，尤其是在低对比度条件下或细胞轮廓模糊时更为明显。在这些情况下，边界不清的气孔或表皮细胞轮廓常被过度分割为多个微小对象，错误地归类为独立的表皮细胞（见 图10）。因此，后处理至关重要，不仅需要剔除异常值，还需通过上位分位数过滤，以保留可靠识别的细胞。

图1：使用剃刀去除F. carica叶片表皮毛前后气孔印痕的观察。 大型表皮毛会在印痕上留下痕迹，形成气隙，导致表面不平整，影响聚焦的一致性（表现为较大的灰色斑点）。将F. carica作为异常样本纳入实验，以扩展本方案对多毛叶片的应用。(A) 在200倍放大下，去除表皮毛前的图像部分被表皮毛痕迹遮挡。(B) 去除表皮毛后图像质量得到改善。(C) 在400倍放大下，去除表皮毛前的图像大部分区域被表皮毛痕迹遮挡。(D) 使用剃刀去除表皮毛后，图像中的遮挡最小。比例尺：100 µm（A, B）和50 µm（C, D）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：透明化处理方案的连续步骤。 T. officinale、F. excelsior 和 F. carica 的代表性图像展示了透明化处理方案的各个连续阶段。(A-C) 新鲜叶片。(D-F) 经 NaOH 透明处理后的叶片。(G-I) 经 NaClO 漂白后的叶片。(J-L) 经甲苯胺蓝 O 染色后的叶片。该图示有助于判断每一步操作前样本的预期形态，并突出了不同物种间处理方案的差异性。F. carica 作为形态差异较大的物种被纳入实验，以展示该方案适用于更广泛的叶片结构和叶脉形态。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：气孔及表皮性状的测量示例。 图像中标注的测量性状如下：As = 气孔面积；Ls = 气孔长度；Ws = 气孔宽度；Ae = 表皮细胞面积。气孔密度和表皮细胞密度根据方案所述，在标记区域内进行计算。图像放大倍数为 400 倍。请点击此处查看此图的放大版本。

图 4：透明化处理法与表皮剥离法所获图像的比较。 代表性图像展示了 T. officinale 和 F. excelsior 经透明化处理与表皮剥离后在气孔及表皮细胞大小和密度方面的可见性与变异性。比例尺为 50 µm，图像放大倍数为 400×。 请点击此处查看此图的高清版本。

图5：透明法与表皮剥离法在性状手工测量结果上的差异。 箱形图显示了蒲公英（T. officinale）和欧洲白蜡树（F. excelsior）在气孔和表皮性状上，透明法与表皮剥离法之间的差异。（A）平均气孔面积，（B）平均气孔宽度，（C）气孔密度，（D）平均表皮细胞面积，以及（E）表皮细胞密度。星号表示统计学显著性水平（P < 0.05；*P < 0.01；**P < 0.001）。统计学显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey HSD事后检验进行评估。每组样本量：n = 3–5。缩写：As = 气孔面积；Ws = 气孔宽度；SD = 气孔密度；Ae = 表皮细胞面积；ECD = 表皮细胞密度。 请点击此处查看该图的高清版本。

图6：使用气孔检测模型对剥离样本进行分割的结果示例。 StoManager1 对蒲公英（T. officinale）剥离样本（成熟遮阴叶片的下表面）的分割结果，显示出良好的检测准确性。请点击此处查看此图的放大版本。

图7：使用气孔检测模型在透明化样本上进行分割的结果示例。 StoManager1 对蒲公英（T. officinale）透明化样本（成熟遮阴叶片的下表面）的分割结果，显示其检测准确率相较于剥离样本有所降低。请点击此处查看该图的放大版本。

图8：透明法与剥离法在AI辅助性状测量结果上的差异。箱线图显示了通过StoManager1处理图像后，由AI提取的蒲公英（T. officinale）和欧洲白蜡（F. excelsior）气孔解剖性状的测量结果。所测性状包括气孔面积（As）、气孔宽度（Ws）、气孔长度（Ls）和气孔密度（Ds）。单位同图5。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey HSD事后检验评估统计显著性。星号表示统计显著性水平（P < 0.05；*P < 0.01；**P < 0.001）。每组样本量：n = 3–5。缩写：As = 气孔面积；Ws = 气孔宽度；Ls = 气孔长度；Ds = 气孔密度。 请点击此处查看该图的高清版本。

图9：使用通用型深度学习工具和基于像素的分类器进行分割的截图。 去除表皮的F. excelsior样本（叶片远轴面）分割结果，其中（A）为通用型深度学习工具（Cellpose (cyto2)），（B）为基于像素的分类器（ilastik）。请点击此处查看该图的放大版本。

图10：F. excelsior 剥离样品（叶片远轴面）的 Ilastik 分割掩膜，显示大量假阳性结果。 微小的斑点被错误分类为独立的表皮细胞。在后期处理过程中，需通过人工（视觉）检查设定基于尺寸的阈值，以有效滤除假阳性信号。 请点击此处查看该图的放大版本。

溶液	准备	最终体积
缓冲液1的配制基础	7.12 克（Na2HPO4 *2H2O) 在 200 mL 蒸馏水中2O	200 mL
缓冲液2的配制基础	7.12 g 的 Na2HPO4 *2H2O) 在 200 mL 蒸馏水中2O	200 mL
磷酸盐缓冲液	将36 mL基础液1与14 mL基础液2及50 mL蒸馏水混合2O	100 mL
固定液	将9.25 mL的5%戊二醛与12.5 mL磷酸盐缓冲液和28.25 mL蒸馏水混合2O	50 mL

表1：固定液配方²⁴。本研究中所用溶液的组成。

物种	侧面	方法	人工 (As)	人工智能 (As)	人工 (Ws)	人工智能 (Ws)	人工 (Ls)	人工智能 (Ls)
Fraxinus	远轴面	剥离法	177.43	9.32	12.71	2.85	17.58	3.58
Taraxacum	远轴面	透明法	408.09	18.84	20.1	4.19	26.14	5.39
Taraxacum	远轴面	剥离法	262.54	13.93	15.18	3.47	22.2	4.68
Taraxacum	近轴面	透明法	414.48	14.91	20.11	3.44	26.09	5.71
Taraxacum	近轴面	剥离法	258.72	11.37	15.72	3.3	21.15	4.08

表2： 手动测量与人工智能（AI）的代表性比较。Man 和 AI 分别表示手动测量结果和人工智能（StoManager1）分析结果。单位同 图5。手动测量与AI测量结果存在显著差异。部分比较因各种原因无法进行，包括气孔缺失（例如，F. excelsior 的近轴面）或检测失败（例如，在透明化样本中，由于细胞轮廓模糊，气孔更难被检测到）。

补充图1：叶片透明化过程中常见错误及其对结果的影响示例。 本图用于问题排查：（A）由于在第3.10节中样本复水不完全，导致染色不均；（B）化学处理后的样本极为脆弱，因操作不当造成机械损伤；（C）由于在第3.5节中叶绿素去除不彻底，样本中心区域呈现绿色。 请点击此处下载该图。

补充图2：StoManager1用户界面示例。 StoManager1用户界面的截图，显示输入设置和结果表格（左侧），以及显微图像视图，包括原始图像（右上）和气孔检测叠加结果（右下，为T. officinale剥离样品的上表皮表面）。请点击此处下载该图。

补充图3：Cellpose用户界面示例。 通过图形用户界面进行Cellpose分割的截图，显示可调节的参数（例如模型选择——推荐使用预训练的cyto2模型或自定义训练模型、阈值以及细胞直径校准）。对表皮细胞进行监督式手动标注，每个细胞以不同颜色高亮显示，以指导模型校准。叠加图像展示了F. excelsior远轴表皮剥离样本的分割结果。请点击此处下载该图。

补充图4：Ilastik 分割过程。 叠加图展示了基于像素分类的 F. excelsior 叶下表皮剥离图像。（A）Ilastik 分割过程中的截图，显示了手动标注类别的监督训练：表皮细胞（黄色）、细胞轮廓（蓝色）以及非表皮背景（如毛状体，红色）。（B）仅显示表皮细胞类别（黄色）的截图，展示分类器如何分离出单个表皮细胞。注意存在多个假阳性“微小”检测信号，尤其出现在对比度较低或光照不均的区域。（C）仅显示轮廓类别（蓝色）的截图，展示分类器如何将细胞边界从周围表皮组织中分离出来。注意部分轮廓不连续，且在对比度较低或光照不均的区域出现多个假阳性“微小”检测信号。（D）显示背景类别的截图。掩膜突出显示了气孔复合体、腺毛以及各种碎屑（红色），同时排除了表皮细胞本体。在表皮区域内可见大量微小的假阳性“微小”检测信号，这些信号源于灰度伪影和基于纹理的误分类。请点击此处下载该图。

补充图5：Cellpose训练设置。 针对已透明化处理的T. officinale样本（双面叶片）进行Cellpose训练设置（图形界面）的示例，展示调整前的默认模型参数。选择预训练的cyto2模型，学习率为0.1，训练轮数为100轮（默认值），分别决定模型权重的更新速度和训练遍历次数。通常会对这些默认参数进行修改（例如，学习率=0.15；轮数=12），以缩短训练时间并使模型适应植物表皮形态；然而，较低的训练轮数可能会降低检测性能，并增加假阳性结果。请点击此处下载该图。

补充图6：Cellpose“标签”掩膜。 对一个去除了表皮的F. excelsior样本（远轴叶面）应用Cellpose的“标签”掩膜，显示了有监督训练的结果，其中每个分割出的对象都被赋予唯一的标识符。表皮细胞（标记为e）占主导地位，气孔保卫细胞对（标记为g）也被成功识别。在某些区域可观察到假阳性结果，例如毛状体被错误分类为表皮细胞（左上）或气孔（中央下方），同时也存在假阴性情况，即部分图像区域中的表皮细胞未被标记。此类掩膜用于后续的定量分析以及有监督模型的优化。请点击此处下载该图。

补充图 7：使用 ImageJ/Fiji 对分割的表皮细胞进行定量分析。图示为对剥取的 F. excelsior 样品（远轴叶面）经 ilastik 像素分类后，进行表皮细胞分割与定量的截图。(A) 在导出的掩膜中，每个检测到的像素簇对应一个独立粒子，从而可自动提取对象级别的度量参数（如面积、周长、Feret 直径）。结果窗口（底部）显示了数千个对象的原始测量数据；注意其中存在数量极高的微小粒子，来源于“微小”点状噪声和碎片化轮廓，表明存在大量假阳性。这些伪影需通过后续基于生物学知识的过滤，以在进行下游统计分析前分离出真正的表皮细胞。(B) 在 ImageJ/Fiji 中对 ilastik 分割的表皮对象进行基于面积的过滤。通过设定 150–350 µm² 的最小面积阈值，排除小碎片和噪声，使检测到的粒子数量相比图 A 未过滤掩膜减少约一个数量级（十倍）。尽管该过滤步骤显著去除了微小的假阳性，但分类仍不完全准确：仍存在轮廓断裂和残余的非表皮成分，需进一步优化，例如设置圆形度阈值或基于生物学依据的后续筛选。请点击此处下载该图。

补充图8：在ImageJ/Fiji中对Cellpose“labels”掩膜进行后处理。通过使用Labels to ROIs插件处理一个去表皮的F. excelsior样本（远轴叶面），掩膜中的每个分割对象被转换为一个感兴趣区域（ROI），从而实现对表皮细胞和气孔保卫细胞复合体的单独观察与测量。ROIs叠加在原始显微图像上（左图），而结果窗口（右下角）则显示细胞层面的测量指标（如面积、Feret直径、周长）。该步骤支持基于生物学意义的数据整理，允许用户验证每个ROI是否对应真实的表皮细胞，并剔除在阈值过滤后仍残留的伪影，例如毛状体或错误分割的气孔，从而为后续分析提供可靠依据。请点击此处下载该图。

讨论

为获得一致的气孔测量结果，应从叶片中央区域取表皮样本以实现标准化，同时避免主脉，因为气孔密度在单片叶内存在显著变异，向叶基、叶尖和叶缘方向逐渐降低^25,26。使用新鲜叶片可获得最可靠的表皮样本，前提是采用不收缩、透明的指甲油和高质量透明胶带，以避免形变或伪影。若延迟超过约12小时，叶片会因脱水而导致轮廓清晰度下降。由于表皮样本为临时封片且可能夹带气泡，建议尽早成像，但在一个月后图像质量仍可保持可接受水平。

针对特定组织类型、成像目标和安全考虑，存在多种透明化方法^13,14,15。本研究采用基于水溶液氢氧化钠（NaOH）的透明化方案，因其操作简便、毒性低，并适用于多种叶片类型。由于不同物种的组织反应存在差异，需进行测试和优化。硬叶植物的叶片可能需要≥2周时间才能完成透明化，残留的绿色组织可能干扰染色效果并遮蔽解剖结构（补充图1C）。为加快透明化进程，可将NaOH浓度提高至2.5 M或5 M。软质叶片在漂白后会变得脆弱（第3.7节；补充图1B），而次氯酸钠（NaClO）处理时间过长可能导致组织降解或表皮层分离。对于大多数软质叶片，漂白30秒至2分钟已足够，但较坚韧的物种可能需要长达1小时²⁷。尽管透明化过程比表皮撕取法耗时较长（约需5天），但无需特殊培训，且可针对不同物种进行调整。透明和染色后的样品可保存在4°C的蒸馏水中，长期保存建议进行永久封片^15,27。

特异性针对气孔的 StoManager1 能够在大多数图像类型中可靠地检测气孔复合体（补充图 2），其检测结果在基于表皮撕取法的实验中通常与人工标注结果一致。然而，气孔面积的测量值与人工测量值存在系统性差异（表 2），因此在进行大规模分析前，需基于少量人工测量的样本（例如每个物种 10–20 个气孔）进行校准。StoManager1 显著提高了分析通量，在非标准情况下仍需人工验证。

同时分割气孔和表皮细胞具有挑战性，因为两者所需的最佳清晰度不同，且形态和膜的清晰度存在异质性，容易引入分割误差。同样，基于大量图像集（例如近轴/远轴表面、剥离或透明处理的样本）进行训练会降低特异性。目前尚无针对植物表皮预训练的 Cellpose 模型；标准的"cyto"和"cyto2"模型主要基于动物细胞训练，在表皮图像上的表现不佳。因此，为确保可靠性，必须进行自定义训练（补充章节2）。即使完成训练后，过分割和假阳性仍较为常见，尤其是在低对比度或未经透明处理的图像中（补充图3）。

在 ilastik 中（补充部分 3，补充图 4），应为目标细胞类别（例如，表皮为类别 1）生成对象掩膜，同时保留类别掩膜以用于审核和手动校正。批量处理以及后续的 ImageJ/Fiji 工作流程可节省时间并减少人为误差。必须通过面积、标准差或分位数进行一致的过滤，以抑制噪声和虚假检测。过滤后，细胞的中位面积和细胞计数接近手动测量值。与手动测量及其它机器学习工具（Weka、RootPainter）进行基准比较，对于参数优化和评估分割质量仍然至关重要。机器学习批量处理对计算资源要求较高。稳定的训练和大规模批量分割需要配备支持 NVIDIA CUDA 的 GPU 以及 ≥32 GB 的内存。在中端系统上（例如，16 GB 内存并集成显卡），监督训练通常在处理少于 <10 张图像时需要约 5–10 分钟，并且在使用多个标注类别或异质图像类型时经常发生崩溃。相较于 CPU 或集成 GPU 运行，CUDA 可将处理速度提高约 10–20 倍。

Cellpose、ilastik 和 StoManager1 之间的性能差异源于它们各自不同的特征表示方式。Cellpose 通过预测指向目标中心的矢量流场进行分割，对光学晕轮和突变的折射边界较为敏感，这些因素会干扰流场，在透明化处理的 F. excelsior 样本中导致大量假阳性聚集。ilastik 作为一种由人工引导的像素分类器，除非明确将高反差的 pavement 细胞壁或晕轮标记为背景，否则容易对这些结构产生过分割。StoManager1 通过识别气孔复合体的物体级形态特征（成对的保卫细胞及其中央孔隙）进行检测，在表皮撕片样本中表现良好，包括 F. excelsior²⁸；然而，在透明化样本中，晕轮引起的模糊会降低孔隙的可见性，导致假阴性结果，而非错误分类（补充文件第 1 节 和 第 3 节）。因此，Cellpose 和 StoManager1 属于自动化分割工具，而 ilastik 则为人工引导的分类工具（补充文件第 1–3 节）^28,。

物种特异性的细胞结构会影响人工智能的性能。在蒲公英（T. officinale）中，平滑且呈椭圆形的保卫细胞边缘与 StoManager1 的训练数据分布相匹配，因此可在表皮撕片样本上实现气孔检测（补充图 2），而通用型工具常将保卫细胞与表皮细胞混淆。在欧洲白蜡（F. excelsior）中，下陷的气孔和高凸起的表皮细胞会导致透明化图像中出现假阴性结果。这些差异反映了成像几何特征在物种间及制备方法间的依赖性。人工测量与人工智能推导结果之间的系统性差异来源于两个方面：人工智能未能从图像中编码尺度信息，以及样品制备引起的光学伪影。缓解策略包括对组织制备产生的模糊和光晕进行视觉筛选，在上述条件下优先使用表皮撕片法，以及对少量气孔进行人工校准并采用线性校正（人工值 = a + b × AI 值）。其他策略还包括针对特定分类群的数据增强和辅助类别设计用于训练（然而，自行训练的模型性能可能仍低于在大规模、多样化数据集上预训练的模型），以及在分割后对上位数百分位进行滤除处理。

由于AI分割错误具有系统性而非随机性，因此后处理至关重要。图像质量诊断可遵循一个简单的决策树：首先检查表皮对比度和清晰度，若图像清晰，则转向假阳性问题；若模糊，则预期会出现小的高频伪影，并调整滤波器。如果假阳性（例如点状物、碎片）较少，通常采用±2-3倍标准差的离群值滤波即可满足要求；若小伪影占主导，则应使用基于分位数的滤波方法。随后将性状分布（例如中位数Ae）与生物学预期或人工测量数据进行比较，并根据需要优化阈值——在伪影较多的数据集中，仅保留上10%-50%的分位数可确保输出结果具有生物学意义（补充图7和8）。由于表皮机器学习工具产生的假阳性率较高，无法自动获得可靠的气孔密度估计值；而当边界清晰时，StoManager1能够提供精确的气孔测量结果²⁸（见图6和图7）。对于表皮中位数Ae而言，其表现稳健，相比均值对小的假阳性更为不敏感。

方法选择影响性状检测结果。在气孔密度检测中，表皮撕取法通过完全暴露气孔而优于透明法（图3）；尽管透明法有时能更好地保持气孔形态，但常因组织分层或含有色素而遮蔽较小的气孔²⁷。在人工智能工具中，StoManager1在表皮撕取样本上表现出稳定的气孔测量能力，且所需人工校正最少²³；此外，表皮撕取法还通过提高正确识别的细胞数量和图像覆盖范围，改善了表皮特征的测量效果²。未来的技术进步最有可能来自大规模、涵盖广泛分类群的预训练模型，这些模型可被整合到自动化成像流程中，用于生态生理学研究和作物改良。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
消毒液 NaClO <5%	Domestos, GB	H000023244	皮肤烧伤
磷酸氢二钠二水合物（Na2高倍镜4. 2H2O)	PENTA, CZ	10028-24-7	NA
乙醇，abs. 100% a.r.	Chem-Lab NV, BE	CL00.0505.1000	高度易燃
2 mL 玻璃小瓶	VWR生命科学，美国	548-0045
戊二醛 50% 溶液	VWR生命科学，美国	23H2856331	吸入致命。吞咽有毒。  佩戴防护手套，  服装，  眼镜。
显微镜载玻片	诺玛克斯，PT	5470308A	NA
指甲护理亮油 快干型	B<图像 替代文本="公式 1" src="/files/ftp_upload/69615/69615eq3.jpg" style="margin: auto;"/>K (INEZA), LT	LT-02244	NA
Nikon Eclipse E600 和 Nikon DS0Fi1 5 MP	Nikon Corporation, JP	https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-e600	NA
移液器和移液器吸头	赛默飞世尔科技，FI	KJ16047	NA
单刃钢制刀片	Oxford Instruments	51-1625-0182	NA
磷酸二氢钠二水合物（NaH2PO4 . 2H2O) 纯	PENTA, 捷克	13472-35-0	NA
氢氧化钠颗粒（NaOH）纯品	默克股份公司，德国	1310-73-2	重度烧伤
透明胶带	FOROFIS, LV	91231	NA
甲苯胺蓝，通用级	赛默飞世尔科技，英国	2045836	NA