基于纵向阻抗的肿瘤细胞活力检测用于连续杀伤实验——一种评估T细胞功能的有效方法

摘要

本方案介绍了一种基于阻抗的实时检测方法，用于量化CAR T细胞在慢性抗原刺激下的连续杀伤能力和持久性，同时结合了平板洗涤方法，以实现检测板的经济高效重复使用。

摘要

嵌合抗原受体（CAR）细胞疗法彻底改变了特定血液系统恶性肿瘤的治疗方式。然而，由于抗原丢失、抗原下调或T细胞耗竭，相当一部分患者会出现复发。这些挑战凸显了开发功能检测方法的必要性，以评估CAR T细胞在长期抗原刺激下的杀伤能力和持久性。连续杀伤实验通过检测CAR T细胞反复清除肿瘤靶细胞的能力，为CAR T细胞应答的持久性和效力提供了重要信息。

在此，我们介绍一种基于阻抗的检测方法，利用实时细胞分析（RTCA）系统定量CAR T细胞介导的连续杀伤效应 体外肿瘤细胞被反复接种并使其在特定检测用E-板上贴壁，随后按预定的效应细胞与靶细胞（E:T）比例加入CAR T细胞。该平台无需标记即可连续监测肿瘤细胞的存活力，以高时间分辨率捕捉动态细胞毒性变化。核心读数包括细胞指数（Cell Index, CI）动力学曲线、肿瘤细胞杀伤速率以及靶细胞清除时间。随着CAR T细胞与肿瘤靶细胞的反复接触，其杀伤能力呈进行性下降，这一现象可作为CAR T细胞功能失调（常称为T细胞耗竭）的标志。上述指标共同实现了在不同E:T比例下对CAR T细胞功能的精确评估，并可随时间对不同的CAR T细胞构建体或联合治疗方案进行直接比较。

为了提高成本效益，我们开发了一种平板清洗流程，可在不损害检测性能或数据完整性的前提下重复使用检测用E-板。该优化的工作流程在保持分析稳健性的同时降低了检测成本。这一方法使得CAR T细胞功能的临床前评估更加经济且可扩展，有助于推动细胞治疗设计的改进。

引言

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在多种血液系统恶性肿瘤（如慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、大B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤）的临床治疗中取得了显著成功，彻底改变了癌症免疫治疗的格局^1,2,3,4,5。自首个产品获得监管批准以来，CAR T细胞产品的种类和接受治疗的患者数量持续增长⁶。根据具体产品和临床适应证的不同，通常的输注剂量范围为每名患者约 2 × 10⁶ 至 5 × 10⁸ 个CAR⁺ T细胞⁷。高剂量输注对于实现有效的肿瘤清除和长期疾病控制至关重要，但也带来了临床和实际操作方面的挑战。大量细胞输注可能增加严重不良反应的风险，例如细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS），二者均可能具有剂量依赖性⁸。此外，从经过大量预处理或淋巴细胞耗竭的患者体内制备足量的功能性CAR T细胞存在困难，且该过程对治疗中心而言在物流上要求高且成本昂贵⁹。

尽管存在这些挑战，靶向CD19的CAR T细胞疗法在复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者中仍可达到70%至90%的完全缓解率，展现出显著的临床转化价值^10,11,12然而，CAR T细胞疗法仍面临一些限制其长期疗效的重要挑战。主要障碍包括抗原丢失或下调、CAR T细胞持续性不足以及功能耗竭⁹CAR T细胞耗竭——其特征为增殖能力下降、抗肿瘤活性受损以及持续性差——是导致治疗无应答和复发的关键原因¹³耗竭的CAR T细胞由于长期抗原暴露和免疫抑制性肿瘤微环境，导致效应功能下降、抑制性受体持续表达以及细胞因子产生缺陷。¹⁴临床研究已表明，功能性CAR T细胞持续性的丧失与复发风险增加相关^11,15,16,17. 由于长时间 体内 活性似乎是治疗成功的主要预测指标，因此在临床前和转化研究中，了解CAR T细胞产品的持久性及其持续杀伤能力是一个重要目标。特别值得关注的是CAR T细胞在较长时间内反复识别并裂解肿瘤细胞的能力——即所谓的“连续杀伤”——因为这一特性可作为CAR T细胞持久性和抗耗竭能力的功能性衡量标准。¹⁸.

本文提供了一种利用xCELLigence实时细胞分析（RTCA）阻抗平台进行连续杀伤实验的详细方案，其中包括一个可选的洗涤步骤，可实现检测板（后文简称E-板）的重复使用，从而在不降低实验性能的前提下提高成本效益。开发该方案的动因源于传统细胞毒性实验的局限性，后者通常仅提供静态的终点读数。常见的方法如铬-51释放法、乳酸脱氢酶（LDH）检测或基于流式细胞术的活力检测均需要标记物，操作流程繁琐，且仅限于特定时间点的检测^18,19。更重要的是，这些方法难以有效捕捉长期刺激或多轮抗原暴露条件下的动态杀伤动力学，而这种情况与CAR T细胞的持久性及功能耗竭直接相关¹⁸。

xCELLigence RTCA 平台通过基于电学阻抗的无标记、实时、动态监测靶细胞活力，弥补了上述不足²⁰贴壁肿瘤靶细胞接种于包被有金微电极的E-板上，其贴附与增殖会导致测得的阻抗升高，以细胞指数（Cell Index, CI）表示。²¹CAR T细胞介导的杀伤作用发生后，靶细胞被杀死并脱落，导致阻抗迅速下降²⁰这种实时读出功能使得在数小时或数天内无需任何额外标记物或试剂即可持续评估细胞毒性²²CAR T细胞为非贴壁细胞，不会对阻抗信号产生贡献，从而可清晰区分效应细胞与靶细胞的读数²³由于数据是连续记录的，研究人员可以开展多轮刺激实验，其中CAR T细胞被反复转移并暴露于新鲜的肿瘤靶细胞，从而直接测量杀伤能力随时间的演变过程²⁴这模拟了CAR T细胞所经历的反复抗原接触。 体内 并提供其细胞毒性能力的功能性检测结果。

这种基于阻抗的连续杀伤检测方法非常适用于在临床前环境中评估CAR T细胞功能的研究人员，包括结构优化、功能比较和效力测试。本方案需要使用xCELLigence RTCA系统和E-Plate 96板。虽然该方法广泛适用于贴壁肿瘤模型，但在缺乏固定或锚定策略的情况下，不直接适用于悬浮培养细胞。由于阻抗测量仅反映靶细胞的贴壁状态和存活情况，因此建议结合流式细胞术或细胞因子检测等补充分析，以全面表征CAR T细胞的活化、增殖及耗竭动态。本方案包含特定步骤，可用于收集细胞和上清液，以进行上述额外检测，从而实现对CAR T细胞功能更全面的评估。

方案

注意：本方案已针对 E-Plate 96 进行优化，需使用 xCELLigence RTCA 系统。贴壁肿瘤细胞需提前一晚接种，以确保在加入 CAR T 细胞时处于对数生长期。根据肿瘤细胞系及接种密度的不同，该孵育时间可缩短至 6–9 小时，从而实现同日效应细胞的添加。若采用后一种操作流程，则本方案中所述的按日时间线将相应调整，用户应据此调整实验安排。共培养持续 48 小时后，将 CAR T 细胞转移至新接种的肿瘤细胞上，此过程需要 xCELLigence 仪器上的两个板位，并每隔一天交替进行肿瘤细胞接种和效应细胞添加。CAR T 细胞的制备应遵循机构标准操作程序（SOP）或已建立的方案。简要而言，在符合伦理审批的条件下分离外周血 T 细胞，在适当的生物安全条件下进行转导，并通过流式细胞术或等效的质量控制检测方法评估转导效率和细胞活力。当 CAR 转导效率低于 20% 时，不应进行 xCELLigence 检测，因为较低的转导效率可能导致未转导细胞产生较高的背景信号和非特异性杀伤，从而干扰肿瘤生长曲线的准确性。所有细胞操作均应在无菌条件下于超净工作台内进行。培养基可采用实验室常规使用类型，或按照供应商推荐使用。除非另有说明，细胞均在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中培养。尽管本方法已针对 CAR T 细胞优化，但也可适用于其他悬浮型效应细胞与贴壁型靶细胞的组合。

1. 准备与空白对照（第1天）

1. 培养板准备
   1. 向E-96孔板的每个孔底部加入50 µL肿瘤培养基。
      ​注意：操作时需小心，避免刮伤孔底，以免损坏培养板。
   2. 将E-板放入培养箱中，并放置在后续用于测量的同一仪器槽位上。
   3. 在37 °C下孵育E-板30分钟，使其达到适当的检测温度和pH值。
2. 仪器设置
   1. 同时，启动RTCA Software Pro（版本2.6.1），并选择实验数据保存路径。
   2. 在"RTCA操作员"字段中输入实验名称并保存。
   3. 选择需要测量的孔位。
   4. 在细胞标签下分配细胞名称，在处理标签下分配处理类型。
3. 测量程序设置
   1. 按以下步骤设置程序：
      步骤名称 = 空白；扫描次数 = 1；间隔 = 1；持续时间 = 0:00
      步骤名称 = 肿瘤细胞；扫描次数 = 250–300；间隔 = 15分钟；持续时间 = 至少24小时
      步骤名称 = 处理；扫描次数 = 最多2500；间隔 = 5分钟；持续时间 = 至少72小时
   2. 点击应用，并确保所有步骤均未选中自动模式。
4. 空白校准步骤
   1. E-板在37 °C孵育30分钟后，按下播放/运行按钮以启动空白步骤。
   2. 等待软件显示该步骤为完成状态（约需1–2分钟）。
   3. 仅在准备进行细胞接种时，解锁支架并取出E-板。

2. 第一轮：肿瘤细胞接种（第1天）

1. 接种肿瘤细胞
   1. 将肿瘤细胞重悬于适量培养基中，每孔50 µL。
   2. 从培养箱中取出E-板，每组设三个复孔，进行细胞接种。
2. 开始检测
   1. 立即将E-板放回仪器中并锁定托盘。
   2. 等待5–10分钟，使E-板温度和pH平衡，然后点击PLAY/RUN按钮开始检测（程序第2步 = 肿瘤细胞）。
   3. 将E-板继续在培养箱中孵育过夜，以使细胞充分贴壁。监测未归一化的细胞指数（CI）。当CI进入对数生长期时，进行下一步操作。该阶段因所用细胞系而异，并受接种细胞数量的影响。BxPC3细胞（ATCC CRL-1687）以每孔20,000个细胞接种时，通常在6–18小时后进入对数生长期。

3. 第1轮：CAR T细胞治疗（第2天）

1. 制备与接种T细胞
   1. 在不含扩增细胞因子（例如IL-2、IL-7、IL-15等）的人T细胞培养基中，以每孔100 µL的体积制备所需数量的CAR T细胞。
      注：CAR转导效率仅在实验开始时测定一次。效应细胞与靶细胞（E:T）的比例根据CAR⁺ T细胞数量相对于初始接种的肿瘤细胞数量设定。例如，当CAR⁺ T细胞比例为50%，BxPC3肿瘤细胞数量为20,000个，且目标E:T比为1:1时，应接种40,000个总T细胞。因此，E:T比指的是连续杀伤实验开始时的初始条件；除非进行额外检测，否则后续轮次中E:T比的变化情况未知。T细胞随时间的增殖或存活状态变化，以及由此导致的E:T比变化，均被视为连续杀伤检测结果的一部分。若T细胞在不同轮次间被分割使用，则E:T比按比例重新计算（例如，第3轮后进行1:1分割，将初始2:1的E:T比调整为第4轮的1:1）。若需研究各轮次之间的E:T动态变化，可额外设置中间检测用孔，用于检测CAR⁺百分比或效应功能。通过磁分离法去除抗CD3/CD28 T细胞刺激磁珠，有助于减少非特异性杀伤。建议使用处于对数生长期的T细胞（通常为刺激后5至20天），并在实验前至少两天使用细胞因子扩增细胞，而非在实验前一天进行扩增。
   2. 根据转导效率分析结果，通过混合未转导的T细胞，将各实验组的CAR转导效率调整至最低公共百分比。
      注：若所有组别的转导效率相同，则无需调整。若CAR⁺百分比不同，则需计算每组应接种的T细胞数量，使各组起始时CAR⁺细胞和CAR^-细胞的有效数量一致。具体方法为：将基于E:T比和肿瘤细胞接种量确定的目标CAR⁺细胞数乘以100，再除以各组实测的CAR⁺百分比，必要时添加未转导T细胞以使总T细胞数一致。例如，若一组CAR⁺ T细胞比例为50%，则接种40,000个T细胞（20,000个CAR⁺ + 20,000个CAR^-）；而另一组CAR⁺比例为60%，则需接种33,333个T细胞以提供20,000个CAR⁺细胞，并添加6,667个未转导T细胞，使总T细胞数与第一组一致（总计40,000个）。
   3. 可选步骤：若需研究细胞因子或化合物处理的影响，可在每孔中加入20 µL由人T细胞培养基与目标细胞因子或化合物配制的溶液，其浓度为预期终浓度的11倍。该体积将加入每孔已有的200 µL液体之上（50 µL用于调零，50 µL用于肿瘤细胞接种，最多100 µL用于T细胞添加）。根据制造商说明，E-Plate 96每孔最大容积为243 µL ± 5 µL，因此总液体体积达220 µL时仍适用于此类可选处理。
2. T细胞接种与检测
   1. 仅在准备添加T细胞时，解锁支架并取出E-板。
   2. 将制备好的T细胞直接接种至肿瘤细胞上。
   3. 将支架锁入检测设备内，并在RTCA软件中终止步骤2。
      注：若不终止步骤2，系统将继续测量前一步骤，直至该步骤完成才停止，从而导致数据点丢失。
   4. 等待步骤2状态显示为完成。
   5. 点击播放/运行按钮以启动步骤3（处理），并在弹出提示后点击确定。
      ​注：在操作后（如接种或转移细胞后）允许15–30分钟的平衡期，再开始下一步检测（步骤3.2.5之前），有助于最小化因温度或pH波动引起的生长曲线初始偏移。

4. 第二轮：肿瘤细胞接种（第3天）

1. 按照步骤 1.1 和 1.4 所述方法准备一个新的 96 孔 xCELLigence E-板。
2. 按照步骤 2 所述方法接种新鲜肿瘤细胞。
3. 将 E-板置于培养箱中过夜培养，以使细胞贴壁。

5. 第二轮：CAR T 细胞转移至第二块 E-板（第 4 天）

1. 使用多通道移液器将每个孔中的内容物转移至U型底96孔板中对应的孔内。注意不要触碰到E板底部的电极。
2. 室温下以400 ×g离心5分钟。
3. 小心吸除上清液，如有需要，可将其保留用于酶联免疫吸附测定（ELISA）。
4. 将细胞沉淀重悬于100 µL不含扩增细胞因子的新鲜培养基中。
   注（可选）：此时T细胞可进行分装（例如，50 µL = 1:2分装），用于进一步分析，如流式细胞术。对T细胞进行分装可校正其在xCELLigence杀伤实验期间的增殖情况，有助于减少观察到耗竭表型所需的培养周期数。建议测试2至4之间的分装比例。
5. 将100 µL/孔的T细胞加入第二轮肿瘤E板中（若为1:2分装，则加50 µL/孔），确保培养基以及（如适用）细胞因子或化合物已完全补充。

   

6. 连续杀伤实验的继续（第5 - 10天及以后）

1. 根据需要，每隔 48 小时重复步骤 4 和步骤 5，进行多轮杀伤实验。
2. 在每个阶段使用 xCELLigence 读数以及 ELISA 或流式细胞术等补充检测方法，监测杀伤活性和 T 细胞存续情况。

7. 数据采集与E-板处理

1. 在完成所需的测量时间后，点击软件中的STOP按钮。
2. 导出以效应细胞添加时间点为归一化基准且未取平均值的数据，以便在分析软件（R、GraphPad Prism等）中准确绘制均值 ± 标准误（SEM）图。如需要，也可导出已取平均值的数据集。
3. 解锁并取出E-板，随后在软件中结束实验。
4. 清洁E-板或将E-板存放于培养箱中，以用于后续分析（例如，收集上清液用于ELISA，或收集细胞用于流式细胞术）。

8. 可选：E-板清洗以重复使用

注意：此可选步骤允许重复使用xCELLigence E-板以降低实验成本。仅当E-板的电学特性在多次实验中保持稳定，且各个孔达到可接受的基线范围时，才建议重复使用。处理氢氧化钠（NaOH）时，务必遵守所有安全操作规程。清洗后应目视检查E-板，以检测电极是否存在潜在故障。

1. 弃去E-板中的所有内容物，注意不要触碰E-板底部。
2. 每孔用200 µL去离子水洗涤三次。
3. 每孔加入200 µL的0.1 M NaOH。
   警告：NaOH具有腐蚀性。请遵守当地安全操作规程，佩戴手套、实验服和护目镜。在生物安全柜中操作1 M NaOH。NaOH废液应随水流冲入下水道，确保充分稀释。切勿将浓酸与浓碱混合；切勿将水加入酸中，只能将酸缓慢加入水中。
4. 将E-板在室温下孵育5分钟。
5. 每孔至少用去离子水洗涤三次，确保彻底去除残留的NaOH。
6. 将E-板轻轻在纸巾上拍打以去除水分，随后进行空气干燥。
7. 将E-板置于生物安全柜内或紫外照射装置中，用紫外光照射至少1小时以进行灭菌。
   注意：放置E-板时应使孔朝上。紫外光无法穿透塑料孔底。

结果

成功执行该方案可获得可重复的基于阻抗的读数，反映随时间变化的肿瘤细胞活力和CAR T细胞的细胞毒性。使用商用RTCA系统评估细胞生长和细胞毒性。数据以归一化细胞指数（NCI）表示，计算方法为将每个时间点的CI值除以选定归一化时间点的CI值。归一化时间设定在效应细胞加入前即刻。清除时间定义为效应细胞加入后NCI降至零所需的时间间隔。NCI由RTCA软件自动计算，并可导出用于进一步分析，包括杀伤速率和清除时间，可使用GraphPad Prism等统计软件进行分析。通过生成代表性NCI曲线以可视化细胞毒性的动力学过程。有关计算原理的更多细节可参见其他文献²⁵。

在一项代表性实验中，经第二代嵌合抗原受体（CAR）和额外的嵌合细胞因子受体（CCR）工程改造的CAR T细胞，在与BxPC-3胰腺癌细胞共培养时，经过多轮肿瘤攻击后仍保持强大的裂解潜能；而未携带CCR的CAR T细胞在第2轮后即丧失杀伤能力（图1）。每48小时重新引入肿瘤细胞，每次刺激循环后自然杀伤细胞指数（NCI）的逐步下...

讨论

本方案描述了一种利用xCELLigence RTCA平台，通过多轮抗原暴露来评估CAR T细胞介导的细胞毒性的方法。该方法通过阻抗检测对肿瘤细胞存活率进行长期动态测量，以无标记且连续的方式捕捉T细胞反复杀伤肿瘤细胞的效应——即所谓的连续杀伤（serial killing）。本方案旨在监测T细胞效应功能在连续多次肿瘤细胞再刺激下随时间发生的变化，从而深入了解功能持久性、早期耗竭以及整体杀伤动力学等关键参数（图1）。

确保可重复性和数据质量需要注意多个操作细节。首先，向孔中移液时必须小心操作，避免损坏孔底部的微电极表面。其次，空白校正步骤用于建立电学基线，并在加入细胞前识别任何无功能的孔。建议在空白校正过程中额外增加一些孔，因为若空白校正后出现阻抗信号不稳定或细胞指数（CI）值异常偏低或偏高（超出基线0 - 0.2 CI范围）等缺陷，可能提示电极受损，应将其排除在分析之外²⁰。第三，常用肿瘤细胞系的生长特征可能存在显著差异，因此相应调整接种密度（例如5×10³–4×10⁴个细胞/...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BxPC3	ATCC	CRL-1687
96孔E-Plate	Agilent	300600910
RTCA软件Pro（基础版）	Agilent	不适用	版本 2.6.1
xCELLigence RTCA MP（多孔板系统）	Agilent	不适用