可视化人脂肪源性干细胞在直流电场下随年龄变化的电趋化性

摘要

在一小群女性供体中，衰老减弱了人脂肪源性间充质干细胞（hADSCs）的电趋向迁移能力。直流电场（DCEF）改变了基因表达（747个基因上调，624个基因下调），富集了钠离子转运/通道相关的基因本体（GO）术语及PI3K-Akt信号通路（KEGG通路），提示其可能参与年龄相关的电趋向性，但尚未确立因果关系。

摘要

人脂肪来源干细胞（hADSCs）在组织再生和伤口愈合中起关键作用，其定向迁移是发挥这些治疗效应的前提。电场（EFs）被公认为在伤口修复过程中引导细胞迁移的重要信号，但hADSCs的电趋向性行为——特别是供体特征（如年龄）如何调控该行为及其潜在的分子机制——仍不清楚。这一知识空白限制了hADSCs在再生医学中的优化应用。本研究首先验证了hADSCs中电趋向性的存在，并证实其具有电压依赖性：在100–200 mV/mm的直流电场（DCEFs）下，hADSCs向阳极方向定向迁移，且更强的电场强度可增强迁移的方向性和速度（相较于0 mV/mm对照组）。随后，我们在200 mV/mm DCEF刺激后，对年轻女性供体（27.00 ± 4.58岁）和老年女性供体（62.33 ± 4.04岁）来源的hADSCs进行了RNA测序（RNA-seq）比较。转录组分析发现，老年hADSCs中有747个基因上调、624个基因下调，差异表达基因（DEGs）在对电趋向性至关重要的生物学过程/通路中显著富集，包括钠离子跨膜转运、电压门控钠通道活性（GO术语）以及PI3K-Akt信号通路（KEGG通路）。功能上，在DCEF刺激下，老年hADSCs的向阳极迁移能力显著降低（累积距离、欧几里得距离和迁移直接性均下降），相较于年轻hADSCs表现更弱。本研究首次提供了hADSCs电趋向性具有年龄依赖性的证据，表明供体年龄与电趋向能力受损相关。进一步揭示钠通道活性失调和PI3K-Akt信号通路异常可能是这一年龄相关衰退的潜在机制。这些发现指出了hADSC电趋向性的潜在调控机制，为优化基于hADSC的治疗策略（例如选择最佳供体或靶向钠通道/PI3K-Akt通路）以改善组织再生和伤口愈合效果提供了新的见解。

引言

脂肪来源的干细胞（ADSC）具有强大的自我更新能力和显著的再生潜能。在适当的诱导条件下，它们可分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等¹。通过旁分泌信号通路，ADSC还能促进血管和淋巴管的生成^2,3，抑制瘢痕形成⁴，并表现出免疫调节作用⁵。因此，ADSC被认为是再生医学中细胞治疗的理想种子细胞。

ADSC 的功能受到多种供体特征的影响，这些特征可能影响其在细胞治疗中的潜在疗效，包括供体年龄、体重指数、性别等⁶。来自年长供体的 ADSC 表现出更明显的衰老特征，其成脂分化潜能、成骨分化潜能以及迁移能力均有所降低^7,8,9。此外，其促进角质形成细胞增殖以及刺激机体自身修复机制的能力也有所减弱¹⁰。

细胞定向迁移是伤口愈合和组织再生中的关键生理机制，其中电场（EFs）在引导细胞迁移和促进伤口修复方面发挥着重要作用¹¹。例如，当上皮屏障受损时，内源性电场会立即产生，并持续存在直至伤口愈合、上皮屏障功能恢复^12,13,14。作为引导细胞定向迁移的信号之一，电学信号已被证明比其他共存信号（如接触抑制、机械力和趋化因子）具有更高的优先级^15,16。目前已开发出多种促进伤口愈合和组织再生的方法，例如通过药物或外部电刺激装置来增强或模拟人体内的内源性电场^17,18。细胞沿电场梯度迁移的能力被称为电趋向性。体外（In vitro）研究表明，多种不同类型的细胞均能在电场中实现定向迁移。某些细胞向阳极迁移，例如哺乳动物颅神经嵴细胞、人星形胶质细胞和人乳腺癌细胞^19,20,21；而另一些细胞则向阴极迁移，例如人肾小管上皮细胞、人皮肤成纤维细胞和人中性粒细胞^22,23,24。脂肪来源干细胞（ADSC）可在直流电（DC）电场中被引导向阳极迁移，且在长期培养条件下，外源性脉冲电流已被证明可有效促进ADSC向阳极的定向迁移，同时维持细胞活力²⁵。迄今为止，关于人脂肪来源干细胞电趋向特性的研究仍较少，其电趋向行为背后的调控机制尚未完全阐明。

我们首次系统研究了年轻与老年女性供体来源的人脂肪源性间充质干细胞（hADSCs）在梯度直流电场（DCEF）下年龄依赖性的电趋化差异，并通过转录组学分析进一步揭示了其潜在机制（涉及钠离子通道活性和PI3K-Akt信号通路）。在本研究中，我们考察了DCEF对hADSCs的影响。通过RNA测序和差异基因富集分析，比较了来自年轻和老年女性供体的两组hADSCs在DCEF刺激后的基因表达谱，以鉴定与年龄相关的转录差异。我们假设供体年龄增长会损害hADSCs的电趋化反应能力，且这种与年龄相关的功能下降与钠离子通道活性及PI3K-Akt信号通路的改变有关。

方案

在采集组织样本前，已从所有参与者处获得知情同意。本研究经中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准（批准号：[2018]2018-110-2）。在采集组织样本前，已从所有参与者处获得书面知情同意。

hADSC的分离与培养
组织采集：人腹部脂肪组织样本来自中国医科大学附属第一医院整形外科常规择期吸脂手术。所有供体均为接受美容性腹部吸脂的健康女性志愿者，未因研究目的进行额外外科干预。手术医师在无菌条件下于吸脂后立即采集组织标本，并于30分钟内将标本置于冰上、装入无菌容器转运至实验室。

样本量：本研究共纳入6名供体，包括3名年轻供体（年龄：27.00 ± 4.58岁）和3名老年供体（年龄：62.33 ± 4.04岁）。

组织处理：将脂肪组织碎片转移至50 mL锥形管中，在4 °C下以1,800 × g离心3分钟，并小心吸除上层油相（以去除过量脂质）。向组织沉淀中加入0.2% IV型胶原酶（终体积：每1 g脂肪组织5–10 mL），然后将管子置于37 °C水浴或培养箱中消化45分钟。消化期间每10–15分钟轻柔振荡管子，以确保胶原酶与组织均匀接触。消化结束后，加入含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的低糖DMEM培养基终止反应（中和培养基与胶原酶溶液体积比为1:1）。

注意：操作胶原酶时，应佩戴一次性手套、实验服和护目镜，以避免皮肤和眼睛接触；应在生物安全柜（BSC）中配制和使用该试剂，以防止气溶胶污染；若发生泄漏，须立即用75%乙醇擦拭清理，并将受污染材料作为生物废弃物妥善处置。

细胞分离：将中和后的消化混合物在 4 °C 条件下以 1,200 × g 离心 10 分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，然后将沉淀重悬于红细胞裂解缓冲液（155 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃、0.1 mM EDTA；pH 7.4；体积：每沉淀加 2–3 mL），在室温（22–25 °C）孵育 5 分钟以裂解残留的红细胞。将细胞悬液依次通过 200 µm 滤网过滤，以去除未消化的组织碎片，获得单细胞悬液。

细胞计数：接种前，使用血细胞计数板对细胞数量进行定量。简言之，用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 将 hADSCs 消化脱离，重悬于生长培养基中，并与 0.4% 台盼蓝溶液按 1:1 混合。在光学显微镜下使用 Neubauer 血细胞计数板手动计数活细胞（未着色细胞），总活细胞数按以下公式计算：细胞数/mL = （平均计数细胞数 × 稀释倍数 × 10⁴）。

细胞培养：将过滤后的细胞以 5 × 10³ 个细胞/cm² 的密度接种于生长培养基（低糖 DMEM + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素）中，在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。每 2–3 天更换一次培养基，以去除非贴壁细胞并维持最佳培养条件。后续实验所用的所有 hADSCs——包括细胞鉴定（表面标志物检测、三系分化实验）、DCEF 刺激、迁移与形态学分析、衰老/增殖实验以及 RNA 测序——均为第 3 至第 5 代细胞。

hADSC 鉴定
细胞表面标志物表达：将细胞培养至70%融合度，然后用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化贴壁细胞（37 °C孵育3分钟）。在4 °C下以300 × g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1× PBS中（体积：1–2 mL）。每份样品取1 × 10⁵个细胞（重悬于100 µL 1× PBS中），加入指定稀释比例的荧光标记抗体：抗CD44（1:50）、抗CD90（1:100）、抗CD29（1:50）、抗CD73（1:50）和抗CD105（1:20）^1,4,7。将抗体-细胞混合物在4 °C避光孵育30分钟，以避免荧光淬灭。孵育结束后，在4 °C下以1,000 × g离心5分钟，彻底吸除上清液。将沉淀重悬于1–2 mL 1× PBS中，再次在4 °C下以1,000 × g离心3分钟，弃去上清液，并重复洗涤两次以去除未结合的抗体。最后，将细胞沉淀重悬于200 µL新鲜1× PBS中，使用流式细胞仪采集荧光数据，并用FlowJo软件（v10）进行定量分析。设门流程遵循标准的间充质干细胞表型分析程序：首先通过FSC-SSC设门排除碎片，并根据细胞大小和颗粒度选择主要细胞群体；接着利用FSC-A vs. FSC-H和SSC-A vs. SSC-H图排除双联体，确保为单细胞事件；随后进行活细胞设门，排除台盼蓝阳性或PI阳性的死细胞。对单染对照进行荧光设门，同时使用未染色对照设定CD29、CD44、CD73、CD90、CD105（阳性标志物）以及CD34、CD45（阴性标志物）的阈值。导出并分析代表性设门图，以确认hADSC的身份。

分化潜能
成脂分化：使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 收获 85% 汇合度的 P3 代 hADSCs，然后以每孔 1 × 10⁵ 个细胞的密度接种于 24 孔板中（使用完全 DMEM 培养基），在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养至细胞再次达到 85% 汇合度。诱导时使用成脂分化试剂盒，按照说明书将试剂盒组分 A（成脂诱导剂）和组分 B（成脂维持剂）溶解，前 3 天使用组分 A，随后更换为组分 B 培养 1 天。重复此循环共 3 周。染色时，吸除诱导培养基，用 3 mL 1× PBS 轻柔洗涤细胞（避免破坏细胞层），室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定 20 分钟，然后室温下加入 0.3% 油红 O 溶液（溶于 60% 异丙醇中）孵育 15 分钟。用 1× PBS 洗涤细胞 3 次以去除多余染料，随后使用倒置光学显微镜（20×）观察脂滴。

成骨分化：将 hADSCs 以每孔 1 × 10⁵ 个细胞的密度接种于 12 孔板中，待细胞生长至 85% 汇合度时，使用成骨分化试剂盒进行诱导——将试剂盒组分 A（成骨诱导剂）和组分 B（成骨补充剂）溶解于低糖 DMEM 中（终浓度：10% FBS、1% 青霉素/链霉素、0.1 µM 地塞米松、10 mM β-甘油磷酸钠、0.05 mM 抗坏血酸-2-磷酸），每 3 天更换一次培养基，持续诱导 3 周。染色时，室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 分钟，用 1× PBS 洗涤 3 次，然后在室温下用 2% 茜素红 S 溶液（pH 4.2，以去离子水配制）孵育 30 分钟。用 1× PBS 洗涤细胞 3 次以去除未结合的染料，随后在相差显微镜（20×）下观察钙沉积结节，并使用 ImageJ 软件测量茜素红 S 阳性结节的面积以定量矿化程度。

软骨分化：将250,000个hADSCs在15 mL圆底离心管中于4 °C条件下以500 × g离心5分钟，形成细胞团块，向管中加入500 µL完全DMEM培养基，在37 °C、5% CO₂条件下过夜培养，以稳定细胞团块。次日，使用软骨生成分化试剂盒进行诱导——将试剂盒组分A（软骨诱导剂）溶解于不含CO₂的培养基中（终浓度：1%青霉素/链霉素、10 ng/mL TGF-β3、50 µg/mL抗坏血酸-2-磷酸、100 µg/mL丙酮酸钠），每3天轻轻更换一次培养基（避免扰动细胞团块）。诱导3周后，在室温下用4%多聚甲醛固定细胞团块30分钟，吸除固定液，加入0.1%（w/v）甲苯胺蓝O溶液（溶于0.1 M醋酸钠缓冲液，pH 4.0）室温孵育15分钟，吸除染液，用去离子水冲洗团块3次以去除多余染料，随后在明场显微镜（20倍）下成像，并使用ImageJ软件测量甲苯胺蓝O染色的平均光密度（OD）以定量硫酸化蛋白聚糖的累积量。

注意：处理4% PFA（一种有毒且具有腐蚀性的试剂）时，必须在通风橱内操作，并佩戴一次性手套、实验服和护目镜，以避免吸入蒸气或接触皮肤和眼睛；若发生接触，应立即用流动水冲洗15分钟，并寻求医疗救助。对于危险废物的处置，应将使用过的PFA及被PFA污染的材料（如移液枪头、培养板等）收集至贴有“PFA Waste”标签的专用化学废液容器中，并按照机构规定的危险废物处理程序进行处置，切勿与生物废物混合。

电趋化室组装：在直径10 cm的培养皿盖中心线上相对的两端各钻一个孔（直径0.75 cm），孔位距离培养皿边缘1 cm（用于容纳琼脂-盐桥）。在培养皿底部沿中心线、距每侧边缘4 cm处，涂抹一层真空脂（长度≤2 cm，宽度≤1 cm）（图1A）。使用无菌细头镊子，将一块无菌的1 cm × 2 cm玻璃盖玻片放置在每处真空脂上，并轻轻按压以确保密封严密（避免盖玻片破裂；图1B-C）。在已固定的盖玻片上方再涂抹一层薄薄的真空脂，然后将第二块无菌的1 cm × 2 cm玻璃盖玻片直接置于真空脂上，形成双层盖玻片结构。轻轻按压，确保两层盖玻片之间密封紧密（防止培养基泄漏；图1D）。沿其中一个盖玻片堆叠结构的左上角至最近的培养皿边缘，以及另一个盖玻片堆叠结构的右下角至其最近边缘的对角线方向，涂抹真空脂，形成连续的屏障墙。该屏障墙应牢固贴合培养皿底部（无间隙），高度约为2 cm，宽度约为0.5 cm（图1E）。将组装好的趋化室置于紫外线下灭菌20分钟（以消除微生物污染），随后在无菌条件下室温保存，待用（图1F）。

DCEF 刺激：将无菌载玻片（用于接种细胞）放入 10 cm 培养皿中，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育过夜，以预处理载玻片（促进细胞贴附）。通过将 10 mL 10x 储存液稀释于 90 mL 去离子水（ddH₂O，无菌）中配制 Steinberg 溶液（终浓度：58 mM NaCl、0.67 mM KCl、0.44 mM Ca(NO₃)₂·4H₂O、0.83 mM MgSO₄·7H₂O、10 mM HEPES；pH 7.4）。取 0.3 g 琼脂加入 20 mL 已配制的 Steinberg 溶液中，微波加热 20 秒，直至琼脂完全溶解且溶液澄清，立即用热的琼脂-Steinberg 混合液填充定制的玻璃盐桥，并在室温下使其凝固。琼脂凝固后，将盐桥置于紫外线下灭菌 15 分钟，同时将两个烧杯（各装有 30 mL Steinberg 溶液）也进行紫外线灭菌 15 分钟。以 2 × 10⁴ 个细胞/cm² 的密度将第 3 代 hADSCs 接种至预处理过的无菌载玻片上，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时以促进细胞贴附，随后将接种细胞的载玻片转移至组装好的电趋化室跑道中，并用无菌侧边载玻片固定（防止移动）。在真空脂上覆盖一块 3 cm × 2 cm 的盖玻片以密封跑道，轻轻按压确保密封紧密，并在顶部盖玻片边缘涂抹额外的真空脂形成屏障（防止培养基蒸发）。向电趋化室的储液槽中加入不含 CO₂ 的培养基（添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素，每槽体积为 5–8 mL），将已灭菌的琼脂盐桥穿过培养皿盖上的孔（一端浸入电趋化室的培养基储液槽中，另一端浸入盛有 Steinberg 溶液的烧杯中），并通过 Ag/AgCl 电极将烧杯连接至电源（以提供稳定的直流电流）。施加 2 V/cm 的直流电场（DCEF）持续 4 小时，每隔 15 分钟使用数字万用表监测电压（必要时调整以维持恒定电场强度），并利用软件在 4 个随机视野下每 5 分钟拍摄一次细胞迁移的延时图像（使用 5 倍物镜，明场模式）。

注意：使用电气设备时，应确保电源和电极处于干燥状态，并放置在非导电表面上，以避免触电。连接或断开电极时需佩戴绝缘手套，在调整装置前应先关闭电源；若电极液泄漏至电气部件上，须立即关闭电源，并用浸有75%乙醇的吸水纸擦拭干净。本研究通过减小电泳室的厚度并将其维持在约1 mm，同时在电泳室两端进行多点电压测量，将场强的波动控制在10%以内。在此条件下，可认为培养区域内的电场分布基本均匀²⁶。

迁移和形态学分析
活细胞成像：对于在直流电场（DCEF）刺激下的 hADSCs，将延时拍摄的图像序列（每5分钟一帧）导入 ImageJ 软件，使用“Manual Tracking”插件手动追踪4个独立视野中自刺激开始（t=0）至结束（t=4 h）共100个细胞的运动轨迹，并利用“Chemotaxis Tool”插件（ImageJ）计算平均迁移速度（µm/min）和迁移方向性（D/T 比值，其中 D 为起点到终点的直线距离，T 为总迁移路径长度）。

追踪：计算以下迁移参数以量化电趋化行为：定向性（Σcosθi/n，其中θi为细胞位移矢量与电场（EF）方向之间的夹角，n为被追踪细胞的总数，取值范围为-1至1，数值越接近1表示向阳极迁移的方向性越强）、累积距离（细胞在刺激期间移动的总路径长度，单位为µm）、轨迹速度（累积距离除以刺激时间，单位为µm/h）以及欧几里得距离（每个细胞从起点到终点的直线位移，单位为µm，反映净迁移程度）。

形态计量学：在直流电场（DCEF）刺激后，用4%多聚甲醛在室温下固定细胞20分钟，用1× PBS洗涤3次，加入Phalloidin-TRITC（以1× PBS按1:500稀释；24孔板每孔加200 µL）在室温下避光孵育30分钟以标记F-actin，再用DAPI（1 µg/mL溶于1× PBS；每孔100 µL）复染细胞核5分钟。使用荧光显微镜在20倍放大倍数下成像（代表性高分辨率图像在40倍下采集）。Phalloidin-TRITC的激发波长为540–555 nm，发射波长为565–580 nm；DAPI的激发波长为358–405 nm，发射波长为420–480 nm。随后在ImageJ软件中测量以下形态学参数：长轴（最大Feret直径，即细胞边缘上任意两点之间的最长距离）、垂直长度（垂直于长轴方向的细胞宽度）和垂直度（sinα，其中α为细胞长轴与电场方向之间的夹角，数值越高表示细胞与电场方向的对齐程度越高）。

衰老与增殖检测
SA-β-半乳糖苷酶染色（SA-β-Gal染色）：使用细胞衰老检测试剂盒，在明场显微镜下（20倍物镜）识别衰老细胞（呈蓝色染色的细胞）。将第3代人脂肪源性干细胞（hADSCs）以每孔2 × 10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，培养至细胞融合度达80%后，吸除培养基，用1× PBS轻柔洗涤细胞3次，每孔加入1 mL固定液（试剂盒提供），室温孵育15分钟；固定后再次用1× PBS洗涤3次以去除残留固定液，每孔加入0.5 mL SA-β-gal染色工作液（按照试剂盒说明书，将50 µL SA-β-gal底物与450 µL染色缓冲液混合配制），用透明封膜密封培养板（防止蒸发），在37 °C避光孵育过夜（16–18小时）（避免接触CO₂，因其会改变pH值并抑制酶活性）；次日采集每孔至少10个随机视野的明场图像（10倍物镜），计数蓝色染色（SA-β-gal⁺）细胞数和总细胞数，并按以下公式计算衰老细胞百分比：（SA-β-gal⁺细胞数 / 总细胞数）× 100。

Ki67 免疫染色
SA-β-gal 染色后，吸除染色液，用 1× PBS 洗涤细胞 2 次，加入 0.1% Triton X-100（溶于 1× PBS，每孔 1 mL）在室温下处理 10 分钟以通透细胞膜，再用 5% BSA（溶于 1× PBS，每孔 1 mL）在室温下封闭非特异性抗体结合位点 1 小时。随后，加入 Anti-Ki67 一抗（以 1% BSA/PBS 按 1:200 稀释，每孔 500 µL），于 4 °C 孵育过夜。次日，用 1× PBS 洗涤细胞 3 次（每次 5 分钟），去除未结合的一抗，再加入 Alexa Fluor 488 标记的二抗（以 1% BSA/PBS 按 1:500 稀释，每孔 500 µL），于室温避光孵育 1 小时。再次用 1× PBS 洗涤细胞 3 次，最后用 DAPI（1 µg/mL 溶于 1× PBS，每孔 200 µL）复染细胞核 5 分钟。使用荧光显微镜在 20 倍放大下采集荧光图像（代表性高分辨率图像在 40 倍下获取）。Alexa Fluor 488 标记的 Ki67⁺ 细胞采用 485–495 nm 激发波长和 515–545 nm 发射波长进行观察，DAPI 染色的细胞核则采用 358–405 nm 激发波长和 420–480 nm 发射波长成像。增殖细胞百分比计算公式为：（Ki67⁺ 细胞数 / DAPI⁺ 细胞核数）× 100。

注意：处理一抗和二抗时，应在生物安全柜内操作以防止污染；将抗体分装成单次使用量，避免反复冻融；并将受抗体污染的材料（如移液枪头、培养板等）收集至专用的可高压灭菌生物废弃物袋中，经高压灭菌消毒后方可丢弃。

hADSCs 的年龄依赖性电趋化性分析：使用直流脉冲电源产生三种强度的直流电场（DCEF）：0 mV/mm（对照）、100 mV/mm 和 200 mV/mm，采用活细胞工作站实时观察并记录细胞迁移行为；针对每种电场强度，通过测量累积距离、欧几里得距离、轨迹速度和定向性，定量比较来自年轻和老年女性供体的 hADSCs 的向阳极迁移能力，每组设置三个独立的生物学重复以确保结果的可靠性。电趋化性迁移参数使用 ImageJ（NIH）中的 Manual Tracking 和 Chemotaxis Tool 插件进行量化。对单个细胞在整个 4 小时刺激期间进行手动追踪，并根据标准方法计算以下参数：累积距离：细胞在记录期间所行进的总路径长度；欧几里得距离：细胞起始位置与终止位置之间的直线距离；轨迹速度：累积距离除以总追踪时间（µm/h）；定向性：定义为每次位移矢量与电场矢量之间夹角（θ）的余弦均值（取值范围为 -1 至 1；越接近 1 表示向阳极迁移能力越强）。

RNA测序
RNA提取与制备： 将装有冰块的容器置于紫外灯下灭菌15分钟（以维持RNA稳定性），后续所有操作均在冰上进行。将接种了人脂肪源性干细胞（hADSCs）的玻璃载片（1 cm × 2 cm）从电趋化室转移至无菌培养皿中，用3 mL预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次（轻柔加入PBS，轻微振荡，彻底吸除以去除残留培养基），然后向每张载片加入1 mL TRIzol试剂，在室温下孵育20分钟以充分裂解细胞（确保裂解液覆盖整个细胞层）。将裂解液转移至无RNase的1.5 mL离心管中，加入0.2 mL氯仿，剧烈涡旋振荡15秒以诱导相分离，冰上孵育15分钟后，在12,000 × g 4℃下孵育15分钟 °C. 这会将裂解液分离成三层：含有RNA的上层水相、中间的蛋白质层和下层有机相。小心转移上层水相（≈ 0.5 mL）转移至新的无RNase离心管中（避免接触中间层），加入0.5 mL异丙醇，轻轻涡旋混匀以沉淀RNA，冰上孵育10分钟，然后在12,000 x g 4℃下孵育10分钟 °C；RNA 将在管底形成白色沉淀。弃去上清液，用异丙醇沉淀法重复一次以提高 RNA 纯度，彻底吸除上清液，在生物安全柜中室温下将 RNA 沉淀空气干燥 5–10 分钟（切勿过度干燥，以免降低溶解度），将 RNA 沉淀重悬于 30 µL 的 DEPC 处理水，于 55 ℃ 孵育 °C 下孵育 10 分钟以促进溶解，使用分光光度计测定 A260/A280 比值（目标值：1.8–2.0）以评估 RNA 纯度，利用 RNA Nano Chip 检测 RNA 完整性；目标值：RNA 完整性数（RIN） > 8.0，并将合格的RNA样本储存在-80 °C，直至测序。

警告：TRIzol 和氯仿具有毒性、挥发性且为致癌物，因此必须在通风橱内操作，并佩戴腈类手套、实验服和护目镜；避免吸入其蒸气，若不慎接触皮肤，应立即用纸巾擦拭并用肥皂和水冲洗 10 分钟；切勿与漂白剂或其他氧化剂混合（以免产生有毒气体）。与 RNA 提取相关的危险废物处理时，应将混合物、异丙醇上清液及受污染的离心管收集至贴有“RNA 废物”标签的密封、耐化学腐蚀容器中（不得与水相废物或生物废物混合），并依照机构规定的危险废物处理流程进行处置，严禁倒入下水道。

数据预处理与质量控制：使用 VAHTS mRNA-seq 文库构建试剂盒，按照制造商的说明书制备测序文库——利用 oligo(dT) 磁珠富集 mRNA，通过二价阳离子将 mRNA 随机打断为 200–300 bp 的片段，使用随机六聚体引物合成第一链 cDNA，随后合成第二链 cDNA，进行末端修复，添加 A 尾，连接测序接头，通过 PCR 扩增文库，并使用磁珠纯化。在测序平台进行测序（150 bp 双端读长），每样本产生约 5000 万条原始读段，然后使用软件去除低质量读段（剔除超过 50% 碱基的 Phred 质量值 >50% bases having Phred quality score <20 的读段）及接头序列，每样本保留约 4800 万条干净读段（Q30 > 90%），用于后续分析。

生物信息学分析：使用 Hisat2 v2.2.1 软件将高质量测序序列比对至人类参考基因组（GRCh38/hg38），并将比对结果保存为 BAM 文件；利用 htseq-count v0.13.5 软件统计比对到每个基因的读段数量（基于 Ensembl 基因注释）；使用 DESeq (2012) R 软件包中的 estimateSizeFactors 函数对基因计数数据进行标准化，以消除批次效应和测序深度差异；采用 nbinomTest 函数（DESeq 软件包）进行差异表达分析，并以倍数变化（FC）> 2 和校正后 p 值（padj）< 0.05 为阈值筛选差异表达基因（DEGs）；使用 clusterProfiler v4.0 R 软件包对差异表达基因进行基因本体（GO）功能富集分析（包括生物过程、分子功能和细胞组分）以及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，重点关注与细胞迁移（如细胞黏附、细胞迁移）、离子转运（如钠离子跨膜转运）和信号通路（如 PI3K-Akt 信号通路）相关的富集结果；使用 pheatmap v1.0.12 R 软件包对差异表达基因进行无监督层次聚类，并通过热图（行标准化 z 值）可视化各样本间的基因表达模式。

统计分析：所有实验数据均以均值 ± 均值标准误（Mean ± SEM）表示，每组至少进行3次独立的生物学重复（n ≥ 3）。采用学生t检验比较两组之间的差异（如年轻供者与老年供者），采用单因素方差分析（One-way ANOVA）结合Tukey事后检验比较三组或以上组别之间的差异（如不同电场强度），使用SPSS 23.0软件进行统计分析，统计学显著性定义如下：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

结果

电场的应用可引导人脂肪源性间充质干细胞（hADSCs）的定向迁移，并增强其迁移能力
提取的 hADSCs 表达典型的间充质干细胞表面标志物（如 CD29、CD44、CD90、CD73、CD105），并具有三系分化潜能（成脂、成骨、成软骨分化；图 2A），符合 hADSCs 鉴定的标准标准。我们施加了强度为 0 mV/mm、100 mV/mm 和 200 mV/mm 的直流电场（DCEF），以研究 hADSCs 的电趋向性反应。在无电刺激的对照组（0 mV/mm）中，hADSCs 向随机方向迁移；而在 200 mV/mm 的外源性 DCEF 刺激下，细胞则向阳极方向定向迁移（图 2B）。此外，随着电场强度的增加，向阳极迁移的 hADSCs 数量也相应增多（图 2C-D）。通过量化细胞位移矢量与电场矢量之间的夹角，我们发现随着电场强度的升高，朝向阳极的定向...

讨论

在组织损伤修复与再生的早期阶段，电场作为微环境中最早出现的物理信号之一，其方向性与细胞向损伤部位的募集在时空上密切相关²⁷。内源性电场起源于上皮组织中由极化离子转运所产生的跨上皮电位。当上皮屏障受损或发生衰老时，该电位随之发生继发性改变，而未受损或非衰老区域仍维持离子转运，从而形成电压梯度，进而在上皮表面平行产生直流电场（DCEF）²⁸。在此情况下，损伤中心充当阴极，是电场的关键组成部分。脂肪源性干细胞（ADSC）存在于脂肪组织中的特定干细胞微环境²⁹。越来越多的证据表明，ADSC 可从其原始微环境中被动员，并参与皮肤修复与再生过程³⁰。在本研究中，我们探讨了 ADSC 是否对外加直流电场（DCEF）表现出电趋性，从而评估其在皮肤再生过程中对内源性电场（EF）的响应能力。研究结果表明，在 DCEF 刺激下，ADSC 会朝向阳极进行定向迁移，且其迁移极性与电场强度呈正相关。鉴于 ADSC 在伤口愈合和组织再生中的关键作用，已有若干研究探索其电趋性行为...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4°C/-20°C/-80°C 冰箱	Haier，中国	HYC-390/DW-25L262/DW-86L728J
琼脂	HUSHI，中国	10000561
Agilent 2100 生物分析仪	Agilent Technologies，美国	G2939BA
茜素红 S	Sigma-Aldrich，美国	A5533
生物安全柜	Thermo Fisher Scientific，美国	1300 A2 1.5 m
CaNO3·4H2O	HUSHI，中国	10013960
离心机	Thermo Fisher Scientific，美国	X4R Pro
CO2 培养箱	Thermo Fisher Scientific，美国	Forma Steri-Cycle 3307
IV 型胶原酶	Biosharp，中国	BS076
共聚焦显微镜	ZEISS，德国	LSM 900
直流脉冲电源	Daedo Powertronics，韩国	DDP-500
地塞米松	Sigma-Aldrich，美国	D4902
数字万用表	Fluke，美国	FLUKE-175
DMSO	Sigma-Aldrich，美国	D2650
电子天平	Sartorius，德国	BSA224S-CW
FBS	Gibco，美国	10270-106
流式细胞仪	Thermo Fisher Scientific，美国	A24858
IBMX（1-甲基-3-异丁基黄嘌呤）	Sigma-Aldrich，美国	I7018
吲哚美辛	Sigma-Aldrich，美国	I7378
胰岛素	Sigma-Aldrich，美国	I5500
倒置显微镜	ZEISS，德国	Axio Observer 7 / ACR
ITS-G	Sigma-Aldrich，美国	I3146
KCl	HUSHI，中国	10019318
KH2PO4	HUSHI，中国	10019320
亚油酸	Sigma-Aldrich，美国	L1376
活细胞工作站	Live Cell Instrument，韩国	Chamlide TC
低糖 DMEM	Gibco，美国	11885084
MgSO4·7H2O	HUSHI，中国	10019322
Na2HPO4·12H2O	HUSHI，中国	10019324
NaCl	HUSHI，中国	10019318
NanoDrop 2000 分光光度计	Thermo Fisher Scientific，美国	ND-2000
油红 O	Sigma-Aldrich，美国	O0625
青霉素/链霉素	Gibco，美国	15140122
移液器	Eppendorf，德国	4920000061
SYBR Premix EX Taq	Takara，中国	RR420A
甲苯胺蓝 O	Sigma-Aldrich，美国	T3260
Tris	HUSHI，中国	10019326
TRIzol	Beyotime，中国	R0016
胰蛋白酶-EDTA	Gibco，美国	25200056
正置显微镜	ZEISS，德国	415200-0000-000
真空润滑脂	DOW CORNING，美国	1597418
维生素 C	Sigma-Aldrich，美国	A4544
水纯化系统	Thermo Fisher Scientific，美国	GenPure xCAD Plus UF-TOC
β-甘油磷酸钠	Sigma-Aldrich，美国	G9422