使用 RStudio 生成家禽垫料中微生物丰度的交互式三维空间可视化图

摘要

本文介绍了一种利用基于网格的采样数据，生成家禽饲养舍内微生物数量和pH值的交互式三维可视化图谱的实验方案。

摘要

传统的家禽垫料微生物学和理化组成评估通常依赖静态表格或二维可视化方法，这些方法可能无法捕捉禽舍环境内的空间异质性。本实验方案描述了整合家禽舍内微生物计数数据与环境参数的交互式三维（3D）可视化方法。采用基于网格的布局模拟禽舍采样，并首先生成模拟数据集以演示工作流程。实验数据集用于评估相对于环境特征（包括饮水线、饲喂器和禽舍入口）的空间梯度。数据在 RStudio 中使用 plotly 生成交互式 3D 图形。需氧菌负荷范围为 5.9 至 8.6 log₁₀ CFU/g，在饮水线附近显著更高（P = 0.023），且随距离该特征越远而数量降低。所得曲面图直观地突出了微生物群落在湿润区域周围的聚集现象，并展示了该框架在家禽垫料中微生物群落空间分布模式解读中的实用性。尽管仍需在商业化家禽养殖条件下进一步验证，但当前方案为可视化和分析家禽垫料数据集中的空间异质性提供了一种可重复的方法。

引言

家禽产业包括蛋鸡和肉鸡生产体系，这两种体系在运行过程中会因垫料、排泄物、饲料颗粒、羽毛、破碎蛋壳和水分的长期积累而产生大量家禽粪便^1,2,3。这种粪便能够支持多种微生物种群的生长，其来源包括家禽、昆虫、啮齿动物和气溶胶^2,3。其中某些微生物可能包含病原体，例如Salmonella（沙门氏菌），可引起家禽疾病，并对公共卫生构成威胁²。由于家禽粪便常被作为肥料施用于土地^4,5，因此了解其微生物分布对于环境监测、禽群健康和食品安全具有重要意义。

因此，具有代表性的家禽垫料采样对于表征微生物群落及检测潜在病原体至关重要。数十年来，研究人员已探索了多种家禽垫料采样方法，包括拖曳拭子法、粪便颗粒收集、直接采集垫料、一次性鞋套或靴套采样法^6,7。然而，采样位置在很大程度上决定了所获数据在多大程度上能够代表整体垫料状况。由于家禽在舍内自由活动，且饮水器、饲喂器、风扇以及降温或加热垫等环境设施会形成局部微环境，导致垫料中的微生物种群和营养因子分布并不均匀^3,8,9,10。因此，在解读与垫料相关的数据时，必须考虑其空间异质性，这对于实现有效管理并维持鸡群健康至关重要。

空间制图方法已广泛应用于农学和土壤科学领域，用于可视化微生物及理化性质的异质性以及局部热点^11,12。然而，当在禽舍内多个区域采集家禽垫料数据时，仅依靠数值难以解释其空间变化趋势^8,9。三维（3D）可视化提供了一种实用方法，可将微生物和理化测量结果与空间坐标整合，生成交互式表面模型^13,14。与静态的二维模型相比，3D模型支持旋转、缩放以及基于深度的采样网格梯度可视化，有助于更准确地解读禽舍环境中空间分布模式。

本方案描述了一种系统化且可重复的方法，用于生成基于网格布局采集并利用 RStudio 分析的家禽垫料微生物及理化数据的交互式三维可视化图谱。首先使用模拟的微生物和理化数据演示可视化工作流程，随后将该方法应用于实际家禽垫料微生物计数数据。本方案的目标是提供一个可重复的框架，以可视化家禽垫料数据集中的空间异质性，并支持结合禽舍结构特征对微生物分布模式进行解读。

方案

本方案使用模拟的微生物和pH值数据集，演示可视化工作流程的每一步，随后将其应用于实验性家禽垫料中的微生物计数，以说明该方法在实验数据中的应用，并支持对与距离相关的微生物关联进行统计学解释。本研究未涉及任何活体动物操作。垫料样本取自家禽饲养栏，未与动物直接接触，因此无需机构动物护理审批。

1. 收集家禽垫料样品并生成微生物丰度数据

1. 在肉鸡鸡舍内采用一致的间距建立基于网格的采样布局。
   注意：在较小的鸡舍中，可使用绳网系统；而在较大的鸡舍中，可使用标志旗标记每个采样位置。网格通常从鸡舍的左下角开始，该位置被视为起点。每个采样位置均通过其网格坐标进行记录。
2. 记录每个采样位置以及饲喂器、水线、加热灯和入口等环境点的 X 和 Y 坐标，使用同一网格系统，可通过单个位置或一条线表示其位置。
   注意：X 方向沿鸡舍长度方向延伸，Y 方向沿鸡舍宽度方向延伸。
3. 在数据集中包含一个“鸡舍”列，用于标识每个采样位置所属的鸡舍或处理组（例如，“P1”、“P2”）。
   注意：按鸡舍分组可确保空间分析在正确的饲养环境中进行。本示例中，在鸡舍范围内定义了一个结构化的 6 × 10 网格，共产生 60 个采样点（n = 60），来自 1 个鸡舍。选择 6 × 10 网格是为了在鸡舍内实现均匀的空间覆盖，并具有对称且等间距的布局。网格布局示例如 图1 所示。
4. 在每个采样位置采集三份垫料样品，用于微生物或理化分析。进行微生物检测时，每份重复样品称取 10 g 垫料，加入 90 mL 无菌缓冲蛋白胨水中，制成第一级稀释液（10⁻¹）。充分混匀样品，使悬浮液均质化。
5. 对混合后的垫料样品进行 10 倍系列稀释，并取每级稀释液 0.1 mL 涂布于琼脂平板上。
   注意：根据所测定的细菌类群不同，可使用不同的培养基。例如，需氧菌可使用胰蛋白胨大豆琼脂（TSA），乳酸菌使用 MRS 琼脂，肠杆菌科使用麦康凯琼脂（MacConkey agar）。
6. 将平板在 37 °C 下培养 24 小时，然后计数可见菌落。使用以下公式计算每克垫料中的菌落形成单位（CFU/g）：
   CFU/g = （计数菌落数 × 稀释倍数）÷ 涂布体积
7. 报告各重复间的平均值。
   注意：检测限由涂布体积（0.1 mL）决定，对应涂布悬浮液中约 10 CFU/mL，或原始样品中约 100 CFU/g 的垫料。
8. 以数字格式将微生物计数结果记录在电子表格中，用于后续统计分析和可视化。
9. 创建一个包含以下列的 CSV 文件：样品编号（Sample ID）、X（空间坐标）、Y（空间坐标）、Xnum（X 的数值排序，可选）以及微生物计数或 pH 等理化参数。模拟表格的示例如 图2。 所示。
10. 使用正态分布的随机值生成模拟的微生物丰度值。根据实测数据设定均值、标准差和范围。设定固定的随机种子以确保可重复性。在网格上引入空间梯度，并添加轻微的随机变异，以避免出现均匀模式。
    注意：用于数据生成的模拟参数，包括分布类型、范围和空间结构，总结于 Table 1 中。

2. 设置计算环境

1. 安装并加载必要的统计计算软件包。
   install.packages(c("plotly"))
   library(plotly)
2. 将CSV数据集导入计算环境，并设置工作目录。
   setwd("path/to/your/folder")
   dataset <- read.csv("path_to_your_file.csv")
   注意： 输入数据集应以电子表格格式（CSV文件）组织，每一行代表一个采样点。所需的输入数据结构和变量定义汇总于表2中。

3. 准备并格式化数据

1. 检查 CSV 文件中是否存在缺失或不一致的数据值。
   summary(dataset)
   any(is.na(dataset))
2. 根据需要清理数据集，移除“NA”值。
   dataset <- na.omit(dataset)
3. 为实现数据标准化并改善图形可视化效果，对微生物计数进行对数转换。
4. 使用统一的下划线命名法（例如 log10_CFU_A 和 log10_CFU_B）标准化变量名称，以提高可读性和可重复性。
5. 对微生物计数数据应用以10为底的对数转换，以稳定方差，并符合标准的菌落形成单位（CFU）报告规范。
   dataset$Log10_CFU_A <- log10(dataset$OrganismA_counts + 1)
   dataset$Log10_CFU_B <- log10(dataset$OrganismB_counts + 1)
6. 确保 X 和 Y 坐标值为数值型。如果数据为字母形式，应将其转换为数值，以准确对应网格中的采样位置。
   注：最终数据集应包含围栏坐标系统中的所有唯一标识符、数值型空间坐标以及对数转换后的微生物计数。

4. 生成交互式三维可视化图像

1. 构建空间矩阵之前，需验证数据集结构，以确保能够正确生成网格。然后，通过整合多个部分（如空间坐标和对数转换后的细菌计数）准备空间数据矩阵，以匹配栏位的网格布局。
   注意：该代码按栏位（Pen）、X 和 Y 对观测值进行分组，计算每个网格点处的平均 Log10_CFU_A，然后根据数据集中唯一的 X 和 Y 坐标将这些值重塑为矩阵。
   org1_means <- aggregate(Log10_CFU_A ~ Pen + Y + X,
   data = dataset,
   FUN = mean,
   na.rm = TRUE)
   org1_P1 <- subset(org1_means, Pen == "P1")
2. 对点进行排序，以确保矩阵正确映射
   x_vals <- sort(unique(org1_P1$X))
   y_vals <- sort(unique(org1_P1$Y))
   ncol_grid <- length(x_vals)
   nrow_grid <- length(y_vals)
   org1_mat_P1 <- matrix(org1_P1$Log10_CFU_A,
   nrow = nrow_grid,
   ncol = ncol_grid,
   byrow = FALSE)
3. 确保无缺失值，以获得平滑的图形效果。
   for(i in 1:ncol(org1_mat_P1)) {
   org1_mat_P1[is.na(org1_mat_P1[,i]), i] <- mean(org1_mat_P1[,i], na.rm=TRUE)
   }
4. 以三维形式可视化微生物计数的空间分布。
   注意：本图中，网格大小反映了数据集的空间布局
   figA <- plot_ly(
   x = x_vals,
   y = y_vals,
   z = org1_mat_P1,
   type = "surface", colorscale = list(
   c(0, "darkblue"),
   c(1, "green")
   )
   )
5. 添加环境特征（如水线），以帮助可视化微生物计数或其他垫料参数与该点之间的距离，使用户能够观察到空间分布模式。
   figA <- figA %>%
   add_trace(
   x = c(1, 5),
   y = c(6, 6),
   z = c(8.5, 8.5),
   type = "scatter3d",
   mode = "lines",
   line = list(color = "#1f77b4", width = 8),
   name = "Water Line"
   ) %>%
   add_text(
   x = 3, y = 6, z = 8.6,
   text = "Water Line",
   textfont = list(size = 14, color = "darkblue"),
   showlegend = FALSE
   ) %>%
   layout(
   title = "模拟生物A",
   scene = list(
   xaxis = list(title = "X坐标", tickvals = x_vals),
   yaxis = list(title = "Y坐标", tickvals = y_vals),
   zaxis = list(title = "log10 CFU")
   )
   )
   figA
6. 有关可视化禽舍内pH水平所用代码，请参见补充文件1。

5. 三维模型在实验性家禽垫料微生物计数中的应用

1. 根据栏舍内的预设网格布局采集家禽垫料样本，并使用空间坐标记录采样位置。
   注意：本研究中，样本采自位于美国威斯康星大学麦迪逊分校的家禽栏舍，采用预设的网格布局进行采样。采样时使用 5 × 7 m 的网格布局。
2. 从每个采样点称取定量的垫料，悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）或等效稀释液中，制备初始稀释液。
   注意：本研究中，每个采样点使用 Whirl-Pak 袋采集 1 g 垫料，并以 1:10 的比例稀释于磷酸盐缓冲液（PBS）中。
3. 将垫料样本接种至合适的培养基上，通过平板菌落计数法进行微生物数量测定，并在适宜条件下培养。
   注意：本研究中，样本采用点样法在胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板上进行双重复接种，并于 37 °C 培养 24 小时。微生物计数所需的材料列于材料表中。
4. 以菌落形成单位（CFU）量化微生物丰度，并对数据进行 log₁₀ 转换以便后续分析。
5. 将处理后的微生物数据整合至计算工作流程中，并按照所需的输入格式进行数据格式化。
6. 利用上述方法生成三维空间可视化图，以展示栏舍内微生物丰度的空间分布。
   注意：本研究中，可视化图用于呈现所采样栏舍中需氧细菌丰度的空间分布情况。

6. 统计分析

1. 进行基本的统计分析，以总结微生物丰度和环境变量的空间分布模式。
2. 仅对实验性家禽垫料数据集进行统计分析。模拟数据集仅用于可视化演示，不得纳入统计检验。
3. 当存在重复测量时，计算每个网格位置的平均值。
4. 采用线性回归分析评估微生物丰度与环境地标距离之间的关系。
5. 利用环境地标在栏舍内的已知网格位置计算其距离，并将距离视为连续变量。
6. 使用分析结果探索空间趋势并辅助解释可视化结果，而非用于确立因果生物学关系。

结果

用于演示三维模型的模拟微生物与理化数据
本研究提供了基于模拟数据的代码，用于可视化家禽饲养舍内微生物（生物体A和生物体B）的丰度以及垫料的pH值。根据基于网格的模型生成的三维图展示了微生物数量（图3A、B）和pH值（图3C；如需交互式体验，请参见补充文件3）。模拟的pH值在饲养舍内呈现空间异质性，沿网格方向发生渐变，符合预设的空间梯度。完整无文字中断的代码见于补充文件1。

三维模型在实验家禽垫料微生物计数中的应用
为展示该模型如何结合实际生态数据进行分析，本研究对家禽垫料中的需氧细菌计数进行了空间映射，并采用线性回归模型（LRM）进行统计分析，以评估距离环境特征点（如饲喂器和供水线）的远近对细菌丰度的影响。用于分析的实验数据集详见补充文件2。三维可视化结果清晰地展示了栏舍内不同区域需氧菌计数的差异，表明该方法能够有效呈现家禽养殖环境中真实的微生物分布情况（图4；交互式体验请参见补充文件3）。这些可视化图像揭示了空间分布的异质性，在某些特定环境特征附近存在局部细菌丰度较高的区域。在整个家禽栏舍中，需氧菌计数范围为5.9至8.6 log₁₀ CFU/g，其中供水线附近检测到的浓度最高，而中央饲喂器周围及远离供水线区域的计数较低。需氧菌平均丰度从供水线附近的8.0 log₁₀ CFU/g下降至最远记录距离处的7.4 log₁₀ CFU/g。微生物计数表示各采样位置重复测量值的平均值。此外，距供水线的距离是需氧细菌负荷的显著预测因子（LRM，P < 0.05），而距饲喂器和入口的距离则无显著影响（LRM，P > 0.05）。这些定量结果与三维曲面图中观察到的视觉趋势一致，表明随着与湿源距离的增加，微生物丰度显著下降。最终结果表明，基于三维网格的框架为家禽垫料数据集中空间异质性的可视化与分析提供了一种实用的方法。通过模拟数据与实验数据的结合，该模型不仅捕捉到了局部微生物分布模式，还进一步实现了对栏舍内细菌丰度与环境特征之间关联性的统计学解释。

图1：家禽圈舍采样用网格布局。 基于网格的采样框架示意图，用于确定家禽圈舍内的空间坐标和采样位置。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：以电子表格格式呈现的模拟数据示例布局。 代表性电子表格结构，显示样本标识符、空间坐标（X和Y）以及用于分析的微生物或理化变量。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：家禽饲养栏中微生物数量和pH值的模拟空间分布。 （A）模拟生物体A的数量，（B）模拟生物体B的数量，以及（C）基于网格的三维空间模型所呈现的模拟pH值。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：家禽饲养栏内好氧细菌数量的空间分布。 三维曲面图展示了不同距离（X–Y坐标）下好氧细菌数量（log CFU/g）的变化情况。请点击此处查看该图的放大版本。

参数	数值
分布	正态分布
均值 (μ)	8.26
标准差 (σ)	0.77
范围	7.10–9.37
空间模式	线性梯度（Y方向）
噪声	正态分布（μ=0，小方差）
随机种子	10

表1：模拟微生物数据集生成所用参数。 生成模拟微生物数据时所使用的分布参数汇总，包括均值、标准差、数值范围和空间梯度设置。

列名	描述	数据类型	是否必需
Pen	栏位或处理组的标识符	文本	是
X	在网格上的 X 坐标位置	数值	是
Y	在网格上的 Y 坐标位置	数值	是
Log10_CFU_A	对数转换后的微生物计数（微生物 A）	数值	是
Log10_CFU_B	对数转换后的微生物计数（微生物 B）	数值	可选
pH	测得的 pH 值	数值	可选
Landmark Distance	距环境特征的距离（例如水线）	数值	可选

表2：空间分析所需的输入数据集结构。 所需变量列表，包括样本标识符、空间坐标以及微生物或理化测量值，以及相应的数据格式。

补充文件1：用于生成模拟微生物和pH空间可视化图的代码。用于处理模拟数据集并生成家禽饲养栏中生物体A、生物体B及pH的三维曲面图的R脚本。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：实验家禽垫料微生物数据集。 包含用于三维可视化和统计分析的好氧细菌计数及相应空间坐标的电子表格。请点击此处下载该文件。

补充文件3：交互式3D可视化访问链接和二维码。用于访问模拟和实验数据集交互式3D图的二维码及相应网页链接请点击此处下载该文件。

讨论

本研究中展示的基于模拟的图谱旨在演示三维空间映射在增强家禽垫料环境中微生物及理化分布可视化方面的潜力（补充文件 3）。此外，我们将该方法与围栏内的微生物计数数据以及环境和空间标记相结合，以评估局部分布模式并识别与距离相关的规律（补充文件 3）。

当前方案中的一个关键步骤是准确建立基于网格的采样框架。由于三维表面依赖于可靠的空间坐标，因此正确设定原点、保持均匀间距以及精确记录X和Y位置至关重要。该方法中最耗费人力的部分是布设网格，并确认每个样本均对应其指定的坐标和环境标志物，例如饲喂器、供水管线、入口点或加热区域。此阶段的微小位置误差可能会影响后续分析结果。在较大规模或商业化环境中，基于激光的测量工具或其他定位辅助设备可减少人力投入并提高可重复性。仔细标注栏舍内的标志物同样重要，因为这些特征为理解由鸟类活动、湿度和养分分布所形成的垫料环境中微生物梯度提供了生态学背景²。

本方案可适用于更广泛的农业应用。除了微生物数量和pH值外，该方法还可用于其他与垫料或地面相关的变量，包括湿度、温度、养分分布、与氨相关的指标，或由测序获得的微生物群落特征。实际修改方法包括按栏位对数据进行分组、从记录的数据集动态生成矩阵，以及在绘图前筛查缺失值。常见问题解决步骤包括将坐标标签转换为数值、对相同位置的重复测量值取平均、检查是否存在重复或缺失的坐标，并确认矩阵结构与原始栏位布局相对应。该框架还可进一步扩展，以包括多变量分析和垫料深度，从而评估水平和垂直方向的异质性。

还应承认该方法存在若干局限性。该方法本质上并未提高采样分辨率或生物学代表性；相反，它仅改进了数据采集后的空间组织与解释。因此，最终模型的质量仍然依赖于采样设计及野外执行的一致性。网格构建可能体力消耗较大且耗时较长。此外，成功实施该方法需要计算机设备以及基本的数据处理技能。命名模式错误、坐标输入错误或遗漏网格单元均可能导致矩阵生成中断或产生误导性的可视化结果。总体而言，当前方法应被视为一种探索性、基于可视化的分析框架，而非正式的空间统计分析或机制推断的替代方案。

尽管存在这些局限性，该方案相较于依赖混合样本和孤立时间点测量的常规方法仍具有明显优势，后者可能掩盖栏舍或鸡舍内部的精细空间差异^3,4,5,6,7。在本研究中，将该框架应用于需氧菌计数的结果表明，微生物种群在垫料中存在空间聚集现象。具体而言，靠近饮水线区域的细菌丰度较高，并向栏舍中心逐渐降低，在三维曲面图中呈现出明显的梯度分布（补充文件3）。该模式支持如下解释：特定局部环境条件（尤其是水分）可能强烈影响家禽垫料中微生物的分布。其他变量如pH值和营养成分可能进一步阐明这些关系。先前的研究同样表明，家禽垫料中的微生物群落和环境条件在空间上存在差异，且与pH值、饲料洒落和禽类活动相关²。通过将微生物或理化指标测量结果与动物环境中的具体位置相对应，该方法使这些空间模式更易于观察和解释。该方法也类似于土壤学和农学领域中用于识别梯度、斑块性和局部焦点区域的空间制图技术，并将这些概念应用于动物生产系统^11,12,13。未来，跨栏舍、跨鸡群及跨生产周期的重复性空间制图可能有助于对微生物热点区域进行预测建模，并实现对高风险生态区域的精准管理。

尽管三维可视化并不能提高数据的准确性和精确度，但它有助于解释影响家禽垫料中微生物模式和趋势的具有统计学意义的因素。更易于理解的可视化方式可能有助于就垫料改良措施、禽类健康以及 bedding 更换等问题进行有效沟通并支持科学决策^14,15,16。除了在科研中的应用，该工具对家禽养殖者和高校推广技术人员也具有实际价值¹⁷。这些三维图可作为有效工具，以更易于理解且可操作的形式向农场管理者、利益相关方以及小型家禽养殖户展示复杂的微生物数据¹⁷。通过二维码在手机上访问这些图表的能力，可能进一步提升其在田间技术支援中的实用性。随着家禽养殖业在传感器技术和数据生成方面的持续发展，此类方法在整合性家禽信息学中将可能变得越来越有用^18,19。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
分析天平	Fisher Scientific	15997490	用于称量凋落物（例如，10 g/样品）
配备互联网连接的计算机	任何	N/A	用于运行 RStudio
培养箱（37 °C)	赛默飞世尔科技	50125590H	24 h 细菌生长
微生物培养基（TSA）	BD Difco	236950	用于需氧菌计数
磷酸盐缓冲液（PBS）	赛默飞世尔科技	10010023	用于稀释和微生物悬浮液的制备
家禽垫料样品	家禽肉鸡舍或研究用圈栏	N/A	采用基于网格的设计采集的新鲜凋落物
R 包：plotly, dplyr, htmlwidgets	CRAN	https://cran.r-project.org	用于三维可视化与数据处理
R 统计计算环境（v4.3 或更高版本）	R 项目	https://cran.r-project.org	cran.r-project.org
RStudio（v2024.12.0.467 或更高版本）	阳性	https://posit.co/download/rstudio-desktop	posit.co
电子表格软件（Excel，Google Sheets）	微软/谷歌	https://www.microsoft.com/exce	在将数据导入 RStudio 之前进行整理
无菌10 mL锥形管	赛默飞世尔科技	339650	用于运输等分试样
无菌移液管 &和技巧	Fisher Scientific	N/A	用于精确且无菌的液体操作
无菌Whirl-Pak袋	Nasco	B01062	用于样品采集与均质化
涡旋混合器	VWR	10153-838	用于样品匀浆