利用小鼠皮下脂肪组织来源的基质血管组分建立脂肪细胞胰岛素抵抗模型

摘要

本研究介绍了一种实验方案，利用小鼠皮下脂肪组织来源的基质血管组分，并经地塞米松处理以模拟胰岛素抵抗。该方法保留了脂肪组织的复杂性，为机制研究提供了生理上更真实的平台。

摘要

脂肪组织中的胰岛素抵抗是2型糖尿病等代谢性疾病的核心特征，然而许多 体外 模型依赖于永生化细胞系，而这些细胞系无法完全反映天然脂肪组织的细胞复杂性。本实验方案旨在建立一种可重复且易于操作的方法，利用从小鼠皮下脂肪组织基质血管组分（SVF）中分离的原代脂肪细胞来构建脂肪细胞胰岛素抵抗模型。该方案详细描述了通过酶消化法分离SVF细胞、将其诱导分化为富含脂滴的成熟脂肪细胞，以及随后使用地塞米松诱导胰岛素抵抗的过程。胰岛素抵抗的状态通过功能性和分子水平的检测指标进行定义和验证，包括胰岛素刺激下的葡萄糖摄取与消耗减少，以及PI3K-AKT信号通路中关键胰岛素信号蛋白磷酸化水平的降低。由于保留了SVF来源的细胞异质性，该方法提供了一个基于原代细胞的实验体系，使脂肪细胞胰岛素信号的研究条件更接近于脂肪组织的生理状态，优于传统的细胞系模型。本方案适用于希望获得标准化平台以研究脂肪细胞胰岛素抵抗机制或评估代谢干预措施的研究人员，但需注意检测结果反映的是混合来源的SVF细胞培养体系的反应，而非纯化的脂肪细胞群体的响应。 关键词：原代脂肪细胞，基质血管组分，胰岛素抵抗，葡萄糖摄取，PI3K-AKT信号通路，地塞米松，脂肪组织生理学

引言

2型糖尿病（T2DM）已成为全球增长最快的非传染性代谢性疾病之一，患者总数目前已超过5.37亿，预计到2045年将超过7.83亿¹。其核心病理生理特征表现为外周组织的胰岛素抵抗（IR），并伴随进行性β细胞功能障碍²。胰岛素抵抗的本质在于生理浓度的胰岛素在靶器官中所触发的生物学效应显著减弱，导致葡萄糖摄取减少、肝糖输出增加以及脂肪分解抑制功能受损³。脂肪组织是胰岛素最重要的靶器官之一。肥胖会导致脂肪细胞对胰岛素敏感性下降，减少葡萄糖摄取，抑制甘油三酯合成，同时增强脂解作用并释放更多游离脂肪酸，从而加剧全身性胰岛素抵抗^4,5。

在生理条件下，胰岛素激活 PI3K-AKT 信号通路，促使葡萄糖转运蛋白 4（GLUT4）转位至细胞膜，促进脂肪细胞对葡萄糖的摄取及甘油三酯的合成。同时，胰岛素抑制脂滴表面的脂肪甘油三酯水解酶（ATGL）和激素敏感性脂肪酶（HSL）的活性，从而阻断脂解作用⁶当发生胰岛素抵抗（IR）时，受损的胰岛素信号通路减弱了对脂解作用的抑制，导致大量游离脂肪酸（FFAs）释放入血。这会引起FFAs在血液中的大量释放，造成肝脏、骨骼肌和胰腺等器官的异位甘油三酯沉积。进而诱发脂毒性及慢性炎症，最终促进2型糖尿病（T2DM）的发生与发展。⁷因此，建立一个能够再现成熟脂肪细胞特征的模型至关重要 体内 红外辐射特性对于阐明红外辐射的分子机制以及开发新型干预策略至关重要。

目前，3T3-L1 小鼠胚胎成纤维细胞系已成为研究脂肪细胞分化和代谢功能的常用经典工具 体外 由于其诱导周期短且可重复性好，常用于脂肪细胞胰岛素抵抗的研究^8,9然而，3T3-L1细胞的胚胎来源、均一的遗传背景以及长期传代后易发生表型漂移的特性，导致其代谢行为与成体细胞相比存在显著差异 原位 脂肪细胞，限制了其在转化医学中的应用价值^10,11相比之下，从啮齿类动物皮下脂肪组织中分离得到的基质血管组分（SVF）富含多能脂肪干细胞（ASCs）。由这些ASCs分化而来的成熟脂肪细胞在形态学、功能及转录特征上比广泛使用的3T3-L1细胞系更接近天然白色脂肪细胞。这使得SVF来源的脂肪细胞成为研究胰岛素信号传导及其抵抗机制的有力补充模型，更贴近原代组织的复杂性。¹².

该方案最适合旨在研究保留了比永生化细胞系更高组织异质性的原代脂肪细胞模型中胰岛素作用的研究人员。然而，使用者应注意，基质血管组分（SVF）是一个包含内皮细胞和免疫细胞的混合群体；因此，检测结果反映的是脂肪细胞为主要但非唯一成分的培养体系中的行为。该模型可能不太适用于需要纯度高且同步化的脂肪细胞群体的研究。

本研究提出了一种利用SVF来源的成熟脂肪细胞构建胰岛素抵抗细胞模型的实验方案。该方案详细描述了SVF的分离、培养、分化及胰岛素抵抗诱导的全过程，成功模拟了脂肪细胞的胰岛素抵抗状态。 体内模型评估将在葡萄糖消耗、细胞形态和分子机制层面进行，为研究脂肪细胞中胰岛素抵抗的分子机制提供技术基础。

方案

所有动物实验均经新疆医科大学动物实验伦理委员会批准（伦理批准编号：IAGUC-20240228-41）。

1. SVF 的分离

1. 实验动物：使用4-6周龄、体重9-11 g的SPF级C57BL/6J小鼠。饲养环境温度为22 ± 2 °C，光照-黑暗周期为12小时，自由摄食和饮水。
2. 无菌准备：将所有器械和耗材在121 °C下高压灭菌30分钟。实验前，用75%乙醇喷洒超净工作台，并用紫外线照射不少于15分钟。所有操作均应在II级生物安全柜内进行。佩戴无菌手套和口罩。
3. 脂肪组织采集：通过吸入二氧化碳安乐死小鼠，随后进行颈椎脱位。立即浸入75%乙醇中消毒10分钟。使用无菌眼科剪刀沿胸腹部中线做环形切口。钝性分离暴露双侧腹股沟白色脂肪组织，该组织位于大腿内侧，呈V形向睾丸区域延伸。仔细去除所有可见的淋巴结。将脂肪组织收集至预冷的PBS中，并快速冲洗三次。
4. 胶原酶消化：立即将洗涤后的脂肪组织转移至无菌培养皿中，剪碎成1-2 mm³的组织块。加入0.2% II型胶原酶（溶于Dulbecco's PBS，pH 7.4，预热至37 °C），体积为组织体积的1.5–2倍。在37 °C恒温摇床中以100 rpm振荡孵育10分钟。每3分钟轻柔颠倒一次，避免过度消化。
5. 终止反应与过滤：消化完成后，加入等体积预热至37 °C的完全培养基（DMEM/F-12 + 10% FBS + 1%青霉素-链霉素）以终止反应。使用1 mL移液枪头轻柔吹打5–8次。经70 µm细胞筛过滤，以去除未消化的组织碎片和成熟脂肪细胞。
6. 离心与洗涤：将滤液在25 °C下以300 x g离心5分钟。小心弃去含有成熟脂肪细胞的上清液。将沉淀用完全培养基重悬。再次在25 °C下以300 x g离心5分钟。重复此洗涤步骤2次，以去除残留的胶原酶及任何残留的成熟脂肪细胞。
7. 接种与培养：将最终沉淀重悬于1 mL完全培养基中。按每10 cm细胞培养皿接种4只小鼠腹股沟脂肪样本的密度进行接种。在37 °C、5% CO₂条件下培养。24小时后进行首次换液，以去除未贴壁细胞。此后每48小时更换一次培养基。当细胞融合度达到80%–90%时进行传代。
   注意：当细胞融合度超过90%时不得传代，因细胞已达到接触抑制，增殖能力下降。

2. II型胶原酶工作液的制备

1. 试剂与耗材：获取II型胶原酶（活性 ≥ 120 U/mg）；牛血清白蛋白（无脂肪酸，纯度 ≥ 98%）；HEPES；含钙镁杜氏磷酸盐缓冲液（含 Ca²⁺ 1.8 mmol/L，Mg²⁺ 0.9 mmol/L），pH 7.2–7.4；0.22 µm 无菌低蛋白吸附滤器。
2. 0.2% II型胶原酶溶液的制备：称取60 mg II型胶原酶粉末、800 mg BSA和48 mg HEPES，置于50 mL离心管中，加入杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）定容至40 mL。用1 M NaOH或HCl调节pH至7.4 ± 0.1。经0.22 µm滤膜过滤除菌。每管分装5 mL，于-20 °C保存。避免反复冻融。
3. 当细胞传代后达到100%融合度时，诱导其分化。细胞呈现漩涡样形态时表明处于最佳分化状态。前48小时使用诱导液I，随后更换为诱导液II（表1).
4. 通过以下标准确认分化成功：诱导第4天，油红O染色显示大多数细胞（约50%）出现脂滴积聚，同时伴随甘油三酯含量的统计学显著升高（p < 0.05），且PPARγ和FABP4的mRNA表达水平较基线显著上调。 < 关键脂肪生成标志物的表达存在显著差异（p < 0.05）。

3. 胰岛素抵抗模型的建立

1. 选择分化第4天作为诱导胰岛素抵抗的起始时间点。在显微镜下确认所有细胞均已完成从梭形到圆形的形态学转变，且大多数细胞的胞质中充满高折光性的脂滴。
2. 更换为含有1 µmol/L Dex的诱导培养基II，继续培养48 h（表1）。完成此步骤后，视为胰岛素抵抗脂肪细胞模型已成功建立。注意这些细胞不再出现进一步的形态学改变。可直接用于葡萄糖摄取/消耗实验以及胰岛素信号通路相关蛋白的检测。
3. 胰岛素抵抗模型成功建立的标准：经48 h地塞米松处理后，确认在100 nM胰岛素刺激下，大多数细胞的葡萄糖摄取能力下降约40%；同时确认胰岛素信号通路中关键蛋白的磷酸化水平出现具有统计学意义的降低（p < 0.05）。
   注意：此过程需持续添加诱导维持培养基II。

4. 培养上清液中残留葡萄糖的检测

1. 在指定时间点收集细胞培养上清液。于 4 °C、300 × g 条件下离心 5 分钟，去除细胞。
2. 使用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（GOD-POD）检测试剂盒测定上清液中的葡萄糖浓度。根据以下公式计算浓度：
   葡萄糖浓度（mmol/L）= (A_(样品) - A_(空白)) / (A_(标准) - A_(空白)) × C_(标准)
   葡萄糖消耗量（mmol/L）= 无细胞培养基中的葡萄糖浓度（mmol/L） - 细胞上清液中的葡萄糖浓度（mmol/L）
   标准化葡萄糖消耗量（mmol/mg 蛋白）= 原始葡萄糖消耗量（mmol/L） / 细胞总蛋白浓度（mg/L）

5. 蛋白质印迹

1. 在指定时间点，用含100 nM胰岛素的完全培养基于37 °C刺激细胞10分钟，以激活PI3K-AKT通路。随后，向每个3.5 cm细胞培养皿中加入200 µL细胞裂解液。冰上孵育30分钟。在4 °C下以13,040 x g离心10分钟。将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。使用BCA工作液测定蛋白浓度。
2. 将样品上样至8% SDS-PAGE凝胶。以80 V电压电泳，直至样品到达浓缩胶与分离胶界面。将电压升至120 V，继续电泳至蛋白Marker条带完全分开。以恒定电流200 mA转膜2小时。
3. 用5%脱脂奶粉或BSA室温封闭膜2小时。用TBST洗涤膜3次。随后，于4 °C与一抗孵育过夜。一抗（稀释比例）：AKT：1:1000，p-AKT（Ser473）：1:1000，β-Actin：1:1000，PI3K p110α：1:1000，Phospho-PI3K p110：1:1000，C/EBPα：1:2000，FABP4：1:2000。
4. 用TBST洗涤膜3次。随后，室温下与HRP标记的二抗孵育1小时。二抗（稀释比例）：羊抗小鼠IgG-HRP：1:5000，羊抗兔IgG-HRP：1:5000。
5. 使用ECL化学发光法检测信号。利用Western blot成像系统观察并记录实验结果。
6. 使用ImageJ软件分析条带的灰度值。

6. 葡萄糖摄取染色实验

1. 分别在指定的两个时间点使用含1% FBS的RPMI 1640培养基对细胞进行12小时的饥饿处理，以消除基础葡萄糖的干扰。
2. 用100 nM胰岛素刺激10分钟后，向每个孔中加入1 mL的1×2-NBDG溶液。将培养板在37 °C条件下避光孵育1小时。
3. 用缓冲液洗涤细胞2至3次，然后向每个孔中加入1 mL即用型Hoechst染色溶液。将培养板在37 °C黑暗条件下孵育10分钟。沿培养容器侧壁缓慢加入染色溶液，避免直接接触细胞层，以防细胞脱落。
4. 用缓冲液洗涤细胞2至3次，然后加入PBS。使用倒置荧光显微镜拍摄细胞的荧光图像。
5. 使用ImageJ软件对图像进行定量分析。利用ImageJ分离各通道，将葡萄糖摄取信号（绿色通道）与细胞核荧光信号（蓝色通道）分离开。
6. 将所有图像转换为8位灰度图像。应用默认的自动阈值算法以确定阳性信号区域。
7. 测量这些指定区域内平均荧光强度。通过将绿色通道的平均荧光强度除以相应蓝色通道的平均荧光强度，对葡萄糖摄取的荧光信号进行归一化处理。

7. 油红O染色

1. 将 Oil Red O 储存液与无 RNase 水按 3:2 的比例稀释。依次通过滤纸和 0.22 µm 滤膜过滤，制备工作液。
2. 吸除细胞培养基，用 PBS 轻轻洗涤细胞 2 次。每孔加入 4% 多聚甲醛，在室温下固定细胞 30 分钟。
3. 去除固定液，用双蒸水洗涤细胞。每孔加入 1 mL Oil Red O 工作液。将培养板置于室温避光条件下孵育 25 分钟。
4. 染色完成后，吸除染色液。用蒸馏水彻底洗涤细胞，以去除背景和染色伪影。每孔加入 1 mL 蒸馏水覆盖细胞，立即使用倒置显微镜采集明场图像。

8. BODIPY

1. 将BODIPY储备液与无菌水按1:200的体积比稀释，制备工作液。
2. 用无菌PBS洗涤细胞爬片，每张爬片加入30 µL 4%多聚甲醛溶液，在室温下固定30分钟。
3. 吸除固定液，用PBS洗涤3次。每张细胞爬片加入30 µL BODIPY工作液，在室温避光条件下孵育30分钟。
4. 用PBS洗涤爬片3次，每张爬片加入30 µL DAPI染液，在室温避光条件下孵育10分钟，以标记细胞核。
5. 再用PBS洗涤爬片3次，进行封片：取10 µL抗荧光淬灭封片剂滴加于洁净的载玻片上，用镊子轻轻将细胞爬片（细胞面朝下）倒置在封片剂上，置于避光环境中使其自然干燥。
6. 立即使用激光扫描共聚焦显微镜采集图像。

9. 统计分析

1. 每个实验包含三个生物学重复。使用 GraphPad Prism 10.0 软件进行数据分析。符合正态分布标准的定量数据以均值 ± 标准差（mean ± SD）表示。对于满足正态性和方差齐性的两组数据，采用独立样本 t 检验；对于多组数据，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），以 p < 0.05 为差异具有统计学意义。

10. 安全与废物处理

1. 动物组织处理
   1. 所有涉及原代细胞的操作均须在 II 级生物安全柜中无菌条件下进行。
   2. 将所有动物组织废弃物、未使用的器官及被污染的耗材归类为生物危害性废物。将此类废物放入指定的生物危害袋中，经高压灭菌处理后，再行处置。
2. 地塞米松（Dexamethasone）的处理
   1. 称量 Dex 粉末时应佩戴手套、医用口罩和实验服，并在化学通风橱内进行溶液配制。
   2. 单独收集被 Dex 污染的废弃物，并作为化学废物处置。
3. 生物危害性材料的处理
   1. 实验操作开始前，须使用 70% 乙醇彻底消毒工作台面及生物安全柜内部。
   2. 细胞培养过程中产生的所有液体废物，必须经高压灭菌处理以消除感染性后，方可丢弃。

结果

从C57BL/6J小鼠iWAT中分离的SVF细胞在初次接种于培养皿时呈现点状悬浮状态。接种后约18小时，约40%的细胞完成初始贴壁；至接种后第5天，细胞完全铺展，融合度达到95%（图1A，B）。当细胞达到汇合状态并呈现特征性的涡旋状排列时，更换为分化培养基。诱导第4天时，可见细胞内出现大量折光性脂滴，成熟脂肪细胞约占1/3^rd 人口的（图1C，D).

油红O和BODIPY实验显示，SVF细胞在诱导脂肪向分化第4天开始大量积累脂滴（图2A，B）。与此同时，转录因子C/EBPα在此阶段表达达到峰值，而关键脂肪生成标志蛋白FABP4也显著上调（图2C，D）。综上所述，这些结果表明细胞在第4天进入脂...

讨论

大量研究表明，基于SVF细胞的模型在模拟脂肪组织的病理特征方面具有独特价值。然而，这些模型构建周期较长，通常需要约14天完成组织分离、原代培养、诱导分化及地塞米松（Dex）处理，这给实验连续性和细胞状态稳定性带来了挑战。为应对这些挑战，本研究采用并优化了以下关键措施为核心的实验流程：（1）选用约10 g重的3–4周龄健康幼年小鼠作为SVF细胞来源，以获得高活性的前脂肪细胞。（2）在组织处理过程中，将脂肪组织精细剪碎至约1 mm³的小块，以增加后续酶消化的表面积。（3）使用新鲜配制（储存时间≤3个月）的II型胶原酶，在37 °C（pH 7.4）条件下消化10分钟，以获得最佳细胞得率。（4）在分化及Dex处理阶段，将诱导剂或Dex与完全培养基充分混匀后再加入培养体系，以避免批间差异。（5）胰岛素抵抗模型成功建立的标准：经48小时地塞米松处理后，大多数细胞在100 nM胰岛素刺激下的葡萄糖摄取能力下降约40%，同时关键信号蛋白的磷酸化水平显著降低。这些标准化操作步骤可确保模型构建的可重复性。

根据本研究积累的经验，以下总结了常见问题及相应解决策略，以确保该流程顺利实施：1. 组织消化不完...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 μm 滤膜	Biosharp	BSF-XS-0232-01
2-NBDG	Beyotime	S0561M
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	Sigma	15879
4% 多聚甲醛	Biosharp	BL1278A
70 μm 细胞筛	Biosharp	BS-70-CS
抗 AKT 抗体	Proteintech	10175
抗 C/EBPα 抗体	Abclone	ab40764
抗 FABP4 抗体	Cell Signaling Technology	2120S
抗 pAKT (Ser473) 抗体	Proteintech	28731
抗 PI3K 抗体	Bioss	10657R
抗 pPI3K (p110) 抗体	Bioss	6417R
抗 β-ACTIN 抗体	Proteintech	60008
BCA 蛋白定量试剂盒	Thermo Fisher	23225
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
BSA	Sigma	A7030
细胞爬片	Biosharp	BS-14-RC
细胞培养皿，100 mm × 20 mm	Corning	430167
细胞培养皿，35 mm × 10 mm	Corning	430165
DAPI 溶液	Solarbio	28718-90-3
地塞米松	Sigma	D2915
DMEM/F-12	Gibco	C11330500BT
Dulbecco’s PBS	Cytiva	SH30264.02
Eppendorf 管	Corning	MCT-175-C
FBS	Life-iLab	AC03L0555
荧光显微镜	Leica	DMi8
葡萄糖氧化酶-过氧化物酶	南京建成	F006-1-1
羊抗小鼠 IgG-HRP	北京中杉金桥	ZB-2305
羊抗兔 IgG-HRP	北京中杉金桥	ZB-2301
GraphPad Prism	版本 10.0.0	/
Hepes	BioFroxx	1112GR025
Hochest	Biosharp	BL803A
ImageJ	版本 1.54p	/
胰岛素	Solarbio	18040
激光共聚焦显微镜	Nikon	Ti-E
抗荧光淬灭封片剂	Solarbio	S2100
油红 O 染色液	Sigma	O0625-25G
青霉素-链霉素	hyclone	SV30010
RIPA 裂解液	Thermo Fisher	89901
罗格列酮	Sigma	R2408
RPMI 1640	VivaCell	C3010-0500
脱脂奶粉	BioFroxx	1132GR500
TBS 缓冲液	Solarbio	T1060
II 型胶原酶	Sigma	C6885