本方案通过将下一代测序与多色免疫荧光技术相结合，用于分析肺腺癌的特征。旨在研究基因组异质性与肿瘤浸润免疫细胞密度之间的关系。这种多维度方法有助于对肿瘤微环境进行全面评估，以用于术后预后判断。
研究文章
* These authors contributed equally
本方案通过将下一代测序与多色免疫荧光技术相结合，用于分析肺腺癌的特征。旨在研究基因组异质性与肿瘤浸润免疫细胞密度之间的关系。这种多维度方法有助于对肿瘤微环境进行全面评估，以用于术后预后判断。
肺腺癌（LUAD）的预后 traditionally 通过肿瘤-淋巴结-转移（TNM）分期进行评估，但该方法未考虑患者的免疫状态。本方案结合基因组学分析与免疫微环境分析，以实现更全面的术后预后评估。该方法采用两种主要技术对石蜡包埋的肿瘤组织进行回顾性分析。首先，使用定制的37基因 panel 进行高通量测序（NGS），以鉴定驱动基因的突变及意义未明的变异。其次，采用多重免疫荧光（mIF）技术检测包括 HLA-DR、CD68、CD163、CD206、PD-L1 和 PanCK 在内的标志物，从而量化特定免疫细胞亚群在不同肿瘤区域中的空间分布与密度。这种整合方法可同时评估基因组异质性与肿瘤浸润性免疫细胞的特征。所得数据可识别特定的突变谱组合（如 EGFR 状态）与免疫细胞密度之间的关联。这些整合性组合有助于研究其对患者生存的综合影响，为未来肺癌预后模型的构建提供了有前景的途径。本方案展示了一种用于表征 LUAD 肿瘤微环境复杂生物学特征的可靠方法。
肺腺癌（LUAD）是肺癌中最常见的亚型，但其5年平均生存率仍较低，约为15%1。目前的预后评估主要依赖于TNM分期系统；然而，该方法常忽略患者的整体免疫状态，可能限制其预测准确性。有证据表明，基因组异质性和肿瘤微环境（TME）在LUAD的肿瘤发生及疾病进展中均发挥关键作用2,3。
近年来，从传统的桑格测序转向靶向高通量测序（NGS），使得对多个驱动基因（如 EGFR、TP53 和 KRAS）实现高灵敏度、同步分析成为可能4,5。尽管NGS能够提供遗传变异的高分辨率图谱，但基因组数据本身无法捕捉肿瘤微环境（TME）中复杂的细胞相互作用和空间组织结构。
为应对这些复杂性，多重免疫荧光（mIF）相较于传统的免疫分析方法具有显著优势。单重免疫组化（IHC）每张切片仅能检测一种标志物，而mIF可在保留组织空间结构的同时，实现多种蛋白标志物的同步检测。与可能导致组织降解的连续IHC，或导致空间定位信息和单细胞分辨率丢失的流式细胞术及批量RNA测序相比，mIF结合空间区域注释技术，能够实现原位、多参数的免疫微环境特征分析6,7,8，从而更全面地揭示组织中免疫细胞的空间分布与相互作用9。
本方案建立了一种整合靶向NGS、多重免疫荧光（mIF）和空间区域评估（包括整个组织、肿瘤边界和肿瘤核心）的联合工作流程。这种多维度方法对于研究基因组改变与免疫细胞密度之间的相互作用至关重要，而单一模态方法通常难以捕捉这一关系。通过评估这些整合特征，本方案为表征肺腺癌（LUAD）的生物学特性提供了一种互补策略，并为术后预后分层提供了更可靠的框架。
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本回顾性研究经昆明市延安医院医学伦理委员会批准（批准号：2021-140-01）。所有参与者均签署了知情同意书。
研究设计与样本采集
纳入2015年至2021年间接受手术切除且经病理学或组织学确诊为肺腺癌（LUAD）的63例患者队列。排除标准包括术前接受过新辅助化疗、放疗或免疫治疗的患者。此外，合并其他恶性肿瘤、严重合并症、组织质量差或临床资料不完整的患者也被排除在分析之外。将福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的肿瘤组织块切成1 mm切片用于脱蜡。如工作流程图（图1）所示，这些样本通过多重免疫荧光（mIF）和靶向下一代测序（NGS）进行整合分析。该联合方法可同时评估基因组改变和免疫微环境特征，为表征肿瘤生物学提供多维度分析框架。
随访
通过电话随访追踪患者的靶向药物使用、免疫治疗情况以及疾病进展或死亡情况，并获取有关患者生存状态、疾病进展或复发、术后接受的辅助治疗以及新诊断的合并症的详细信息。随访截止时间为2023年7月，最终观察终点为疾病进展或死亡。 总生存期定义为从手术开始至患者死亡的时间。所有患者均完成随访，无失访病例。最短随访时间为21个月。
NGS文库构建与测序
从FFPE组织切片中提取DNA
从病理标本中获取FFPE组织切片（厚度为3–10 µm），将其放入无菌微量离心管中。向每管中加入二甲苯，在室温下孵育5–10分钟以去除石蜡。在12,000 × g 条件下离心5分钟，小心弃去上清液。重复使用二甲苯处理一次，以确保完全脱蜡。随后依次用100%乙醇洗涤沉淀物两次，以去除残留的二甲苯。在室温下空气干燥沉淀，直至残留乙醇完全挥发。加入适量裂解缓冲液和蛋白酶K（来自DNA提取试剂盒），在56 °C下孵育1–3小时（必要时可过夜），直至组织完全裂解。再于90 °C额外孵育1小时，以逆转甲醛交联。按照制造商说明书，使用商用FFPE DNA提取试剂盒（参见材料表）提取基因组DNA。FFPE样本的DNA质量通常存在片段化现象，因此DNA质量应满足最低完整性阈值（例如，DIN ≥ 5），以确保靶向NGS文库构建的成功。
DNA 定量与归一化
采用荧光定量法测定 DNA，以确保浓度测量准确。使用 Tris-HCl 缓冲液（pH 8.5）将 DNA 样品归一化至终浓度约为 5–10 ng/µL。如有必要，逐步进行稀释操作，以确保 DNA 浓度的准确性与稳定性。
文库构建与靶向富集
使用基于杂交捕获的靶向高通量测序技术，对从FFPE组织中提取的DNA进行测序文库制备10。采用定制的探针面板进行靶向富集，覆盖与肿瘤发生相关基因的外显子区域。如需，可采用标准方法（如基于电泳的系统）评估文库质量及片段大小分布。
文库合并与测序
使用荧光定量法测定每个文库的浓度。根据测序试剂盒的要求，将各文库按等摩尔浓度进行合并。将合并后的文库上样至Illumina测序平台，采用150 bp双端测序模式进行测序。
数据处理与变异检测
原始测序读长采用标准生物信息学流程进行处理，包括接头序列修剪、质量过滤以及比对至人类参考基因组（GRCh37/hg19）。质量控制指标如下：Q20 > 85%，平均测序深度 > 2500x，靶向率 > 65%，Fold 80碱基惩罚值 ≤ 2。质量控制与比对：原始FASTQ数据使用FastQC和Trim Galore（或Trimmomatic）进行质量控制，以去除接头污染和低质量序列。经质控后的读长使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）比对至GRCh37（hg19）人类参考基因组。比对后处理：使用Picard和Genome Analysis Toolkit（GATK）进行排序、重复序列标记以及碱基质量评分重校准（BQSR），以最大限度减少假阳性检出。变异检测：胚系单核苷酸多态性（SNPs）和插入缺失（InDels）使用BWA MEM（0.7.16a - r1181）进行检测。体细胞单核苷酸变异（SNVs）和InDels通过Mutect2和VarScan2的共识方法识别。低频突变进一步采用Freebayes（v 1.3.2）统计模型进行评估。注释与过滤：使用ANNOVAR对变异进行注释，并整合gnomAD、ClinVar和COSMIC数据库信息。通过过滤高频人群SNPs并评估变异等位基因频率（VAF），区分胚系变异与体细胞突变。VAF阈值设定：克隆性事件（如ROS1和ALK）采用≥5%的VAF截断值，而基因突变（如EGFR）则采用1%的阈值，以确保检测到低频变异；该灵敏度得益于平均测序深度高达 >500x。利用1000基因组计划（1000G）数据及本实验室建立的中国汉族健康人群本地基线数据库，区分胚系突变与体细胞突变。所检测体细胞变异的致病性评估依据AMP/ASCO/CAP框架11进行，该框架通过分级、基于证据的方法对体细胞变异的证据等级进行细化。致病性/可能致病性（P/LP）变异予以保留，其分类基于I/II级标准，要求具备A/B级证据（FDA批准、临床试验）或C/D级证据（临床前研究/病例报告）。III级（VUS）缺乏确凿证据，IV级表示良性变异，依据人群频率（如gnomAD）或功能研究结果判定；这些变异在后续分析中被排除。所检测胚系变异的致病性评估依据ACMG/AMP指南12进行。本研究记录了致病性（P）、可能致病性（LP）及意义未明（VUS）的变异。仅包含通过质量控制标准的高置信度变异用于下游分析（QUAL ≥1；胚系突变覆盖深度 >10，体细胞突变覆盖深度 >500x）
来自福尔马林固定石蜡包埋组织的样本制备
石蜡切片的制备
使用切片机将福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块切成3 µm厚的切片。将切片漂浮于40–45 °C的水浴中以展平组织。将切片转移至带黏附性的显微镜载玻片上，并在室温下干燥。将载玻片置于65 °C的烘箱中加热1小时，以确保组织切片牢固黏附于载玻片并熔化多余的石蜡。
脱蜡与再水化
将切片置于染色架中，浸入透明溶液 I 中 5 分钟。随后依次转移至透明溶液 II 和透明溶液 III，每次 5 分钟，以彻底溶解石蜡。将切片转移至 100% 乙醇中 3 分钟，以去除残留的透明试剂。通过梯度乙醇溶液对组织切片进行再水化：95% 乙醇中 3 分钟，80% 乙醇中 3 分钟。用蒸馏水漂洗切片 2 次，每次间隔 3 分钟。由于二甲苯和乙醇在脱蜡过程中具有挥发性和毒性，操作均在化学通风橱中进行。所有含有机溶剂的废液均单独收集，并按照机构规定的危险废物处理指南进行处置。
苏木精-伊红染色部分
苏木精和伊红染色
将脱蜡和复水后的切片浸入苏木精溶液中，在室温下染色5–10分钟。用流动的自来水冲洗切片5分钟。将切片在1%盐酸酒精中分化数秒（3–10秒）。立即用流动的自来水冲洗。将切片浸入自来水或返蓝液中5分钟，使细胞核呈蓝色。将切片在伊红溶液中染色1–3分钟，室温下进行。必要时用蒸馏水短暂冲洗。
脱水与透明
通过梯度乙醇脱水：80% 乙醇中 1 分钟；95% 乙醇中 1 分钟；100% 乙醇中 2 次，每次 1 分钟。二甲苯透明切片 I–II，每个 2–5 分钟。
封片
滴加一滴中性树胶，小心放置盖玻片以避免产生气泡。将载玻片在室温下干燥后进行成像。
石蜡包埋组织切片的多重免疫荧光染色
采用连续多重免疫荧光染色法在同一张组织切片上检测多种免疫和肿瘤标志物。该方法可在保留空间信息的前提下实现不同细胞群体的原位可视化13。抗原修复：将抗原修复缓冲液加入染色缸中，放入微波炉内，高火加热3–5分钟，直至溶液开始沸腾。将脱蜡和水化后的切片小心转移至预热的修复缓冲液中，确保组织切片完全浸没。随后以低火微波加热15分钟，以有效暴露抗原。加热结束后，将切片于室温下自然冷却30分钟，再转移至冰水中5分钟，以终止抗原修复过程。
洗涤与疏水屏障制备
用蒸馏水冲洗载玻片 1 次，以去除残留的抗原修复缓冲液。使用疏水屏障笔在每张组织切片周围画圈。再次用蒸馏水短暂冲洗载玻片。用 TBST 缓冲液洗涤载玻片 2 次。每次洗涤后，将载玻片水平放置 3 分钟，以确保彻底去除缓冲液。
封闭
加入封闭缓冲液，完全覆盖组织切片（每张载玻片约 100 µL）。将载玻片置于湿盒中，室温孵育 15 分钟。
一抗孵育
轻轻在吸水纸上轻拍玻片边缘，以去除封闭液。加入针对 HLA-DR、CD68、CD163、CD206、PD-L1 和 PanCK 的一抗，工作浓度经优化后为 1:100 至 1:400。每个组织切片上加入约 100 µL 稀释后的一抗溶液。将玻片置于湿盒中孵育：37 °C 孵育 1 小时，或 4 °C 过夜以提高检测灵敏度。
洗涤
用TBST缓冲液洗涤载玻片3次，每次3分钟。每次洗涤后将载玻片水平放置，以利于缓冲液排出。
二抗孵育
用TBST缓冲液按1:3比例稀释二抗，配制二抗溶液。每张切片加入约100 µL二抗溶液。将切片置于湿盒中，37 °C孵育10分钟。用TBST缓冲液洗涤切片3次，每次3分钟。
荧光信号扩增
将荧光扩增试剂用扩增缓冲液按1:100稀释。每张载玻片上加入100 µL稀释后的试剂。在室温下避光孵育10分钟，以防止光漂白。用TBST洗涤载玻片3次，每次3分钟。
不同标记物之间的抗原修复
按所述方法进行微波抗原修复。加热后，依次冷却载玻片：先在温水中冷却5分钟，再在冰水中冷却5分钟。
依次染色其他标志物
对每个额外的抗体标志物重复一抗和二抗孵育步骤。在完成每个标志物的染色后、进行下一个抗体染色前，必须进行抗原修复。
细胞核复染
用 TBST 缓冲液洗涤载玻片 1 次。加入 DAPI 核染色剂。室温避光孵育 5 分钟。用蒸馏水洗涤载玻片 3 次。终点判定：在荧光显微镜下应可见细胞核被清晰染色。
仅最终标记染色
将生物素溶液用扩增缓冲液按1:200稀释后加入，室温孵育10分钟。用TBST缓冲液洗涤载玻片3次。按前述方法进行抗原修复。用TBST缓冲液洗涤载玻片3次。加入内源性生物素封闭试剂，37 °C孵育30分钟。将染色染料按1:100稀释于TBST中，避光室温孵育30分钟。用TBST洗涤载玻片1次，静置3分钟使其沥干。
封片
在组织切片上滴加一滴抗荧光淬灭封片剂。小心地将盖玻片覆盖在载玻片上。在成像前让载玻片自然干燥。
H的图像采集&E 和 mIF 切片
H染色全切片图像（WSI）&E染色和mIF FFPE组织切片使用切片扫描仪获取。H&E切片采用明场扫描，而mIF切片采用荧光扫描。成像目标：20倍物镜用于全片概览扫描，40倍物镜用于高分辨率区域成像。激发与发射参数：根据各荧光染料的制造商说明进行优化设置。曝光时间与增益：由成像软件自动调节，以确保信号强度充足且不出现饱和。
mIF 质量控制与图像可评估性
为确保 mIF 结果的可靠性，在使用 HALO 数字病理系统进行组织分类和细胞定量之前，实施了严格的质量控制（QC）流程。去除伪影并定义可评估区域：对全切片图像（WSIs）进行仔细人工审查，排除包含组织折叠、染色伪影和非特异性背景信号的区域。此步骤对于防止假阳性信号、确保空间分析的准确性至关重要。经过上述筛选后，所有样本中平均 80%（范围：50%–95%）的组织区域被划定为可评估的 mIF 区域。病理学验证与分区：为准确区分肿瘤和间质区域，将 mIF 切片与相邻的连续 H&E 染色切片进行比对。标注由两名经验丰富的病理学家独立审核，存在分歧时通过共识解决。为保持分析的严谨性，肿瘤组织面积低于 30% 的样本被排除在研究之外。定量后验证：在完成自动化的细胞表型识别与定量后，病理学家重新评估免疫细胞亚群的空间分布和表达模式。该审查确保数字定量数据与基础的组织形态学特征一致，从而保障研究结果的可靠性与准确性。
数字病理学分析与区域标注
将全景扫描图像导入数字病理图像分析平台进行处理。使用 HALO AI Nuclei Seg-Plugin 对细胞进行分割与识别。以 H&E 染色图像为参考，人工标注以下感兴趣区域（ROIs）：全肿瘤区域（WSIT）；肿瘤边界（TB）；肿瘤核心（TC）。阳性信号的检测依据各标志物的荧光强度阈值及其预期的亚细胞定位确定。采用这种基于特定区室的分析方法，以尽量减少背景干扰并提高免疫细胞识别的准确性。免疫细胞密度定义为每个选定肿瘤区域内标志物阳性细胞的数量。根据组织形态学特征，将多重免疫荧光（mIF）图像与相应的 H&E 染色衍生标注进行对齐。根据每种标志物免疫细胞密度的中位数值，将患者分为高密度组和低密度组。
统计学分析
采用 SPSS 17.0 软件进行分析。符合正态分布的数据以均值 ± 标准差表示，不符合正态分布的定量数据以中位数（25%–75% 四分位间距）表示。使用 Python lifelines 模型中的 Cox 比例风险回归模型分析各基因突变类型、免疫细胞密度与临床特征之间的相关性。根据样本量及数据是否符合正态分布，连续变量组间比较采用 Student's 检验或 Mann-Whitney U 检验。等级变量的比较采用 Wilcoxon 符号秩检验。无序分类变量的分析根据样本量和理论频数选择卡方检验或 Fisher 精确检验。相关性分析采用 Spearman 检验或 Pearson 检验。患者总生存率通过 Kaplan-Meier 法获得，并采用 Log-rank 检验进行假设检验。生存曲线使用基于 RStudio 软件的 R 语言绘制。P 值 <0.10 被认为具有统计学意义。
实际应用性与局限性
为可靠实施该整合工作流程，FFPE 组织切块必须满足严格的质量标准，包括理想的肿瘤细胞含量≥30%，且无广泛坏死或显著的组织伪影。多重免疫荧光（mIF）的技术成功高度依赖于组织保存质量；过度固定、严重损伤或高背景自发荧光等因素可能导致抗体渗透不足和信号强度不理想。此外，本研究存在若干固有局限性，需予以考虑。首先，分析基于一项包含63例患者的回顾性单中心队列，这可能限制研究结果的统计效能及其向其他人群的广泛推广性。其次，评估范围仅限于一个固定的37基因NGS panel和一组特定的免疫标志物（HLA-DR、CD68、CD163、CD206、PD-L1 和 PanCK；补充表1）。如文献所述，尽管该联合方法为预后分层提供了更稳健的框架，但仍需开展更大规模、前瞻性、多中心的研究，以进一步验证这些关联，并优化所鉴定生物标志物的预测价值。
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肺腺癌患者的临床特征
共63例被诊断为肺腺癌并接受手术治疗的患者治疗 2015年至2021年期间在本院就诊并符合纳入标准的患者被纳入本研究。所纳入患者的临床特征如表所示。 表1在入组患者中，中位年龄为60岁（47–73岁），包括男性30/63例（46.2%），女性33/63例（53.8%）。有吸烟史的患者为23/63例（35.4%）。所有入组患者的病理类型均为肺腺癌（LUAD）。根据美国癌症联合委员会（AJCC）第8版TNM分期标准1463例患者中，IIIB期2例（3.1%），IV期8例（12.3%）。转移部位包括：骨转移9例，双肺转移8例，脑转移6例，纵隔转移5例，腹壁/胸壁转移4例，肝转移2例。术后共有24例出现肿瘤复发或转移，其中17例死亡。
所有入组患者均接受了手术治疗治疗，术后进行了辅助治疗。其中56/63例（86.2%）接受了化疗，主要化疗方案为培美曲塞联合顺铂/卡铂。接受放疗的7/63例患者均在术后出现转移，并...
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肺腺癌的整合基因组与空间分辨免疫学图谱分析
本研究展示了一种整合靶向NGS与多重免疫荧光（mIF）的技术流程，用于表征肺腺癌（LUAD）的多维特征。我们的基因组学发现与既往文献一致，特别是在不同族群间突变频率的差异方面。所观察到的EGFR突变率（约40%-60%）与亚洲人群中的报道频率相符，显著高于西方队列（15%-20%）15,16,17,18,19,20。此外，检测到PMS2和EPCAM的胚系突变，提示该人群中可能存在遗传易感因素，值得进一步研究其遗传性风险。通过将基因组数据与空间分辨的免疫图谱整合分析，我们发现EGFR野生型...
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作者声明不存在可被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系。
本工作得到浙江省医药卫生科技计划项目（2022KY1237）；云南省教育厅科学研究基金项目（2025Y0387）；云南省重点研发计划项目（202403AC100002）的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AlphaTSA 多重免疫组化试剂盒 | alphaxbio 科技有限公司 | AXT36025011 | 多重免疫荧光染色 |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Leagene Technology Co., Ltd. | IH0252，批号0525A17 | 多重免疫荧光染色 |
| CD163 | 北京中杉金桥生物技术有限公司 | ZM0428 | RRID:AB_3714707；多重免疫荧光染色 |
| CD206 | Abcam, Inc | 货号 5307-1 | RRID:AB_10896526；多重免疫荧光染色 |
| CD68 | 北京中杉金桥生物技术有限公司 | ZM0060 | RRID:AB_2904190；多重免疫荧光染色 |
| 定制化癌症基因检测面板 | TWIST Co., Ltd. | NGS文库构建 | |
| 脱蜡缓冲液 | QIAGEN 公司 | 19093 | DNA提取；HE染色；从FFPE组织切片进行多重免疫荧光染色 |
| Dynabead M-270 链霉亲和素 | Thermo Co., Ltd. | 65602 | NGS文库构建 |
| 荧光计 | 赛默飞世尔科技有限公司 | QUBIT 4.0 | NGS文库构建 |
| HALO 数字病理图像分析平台 | Indica Labs, Inc.，阿尔伯克基 | 版本 3.6.4134 | HE染色与多重免疫荧光染色分析 |
| 苏木精-伊红染色试剂盒 | 武汉伊莱瑞生物科技有限公司 | E-IR-R117 | HE染色 |
| HiPure FFPE DNA 试剂盒 | 广州美格生物科技有限公司 | D6323 | 从福尔马林固定石蜡包埋组织切片中提取DNA |
| HLA-DR | 华美生物有限公司 | ET1610-66 | RRID:AB_3069950；多重免疫荧光染色 |
| Illumina DNA测序仪 | Illumina 公司 | 550DX | 测序 |
| 中性树胶 | 北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司 | G8590 | HE染色 |
| 潘克 | 北京中杉金桥生物技术有限公司 | ZM0069 | RRID:AB_2941997；多重免疫荧光染色 |
| PD-L1 | R 和 D 系统 | 目录号 AF1019 | RRID:AB_354540；多重免疫荧光染色 |
| TBST缓冲液 | abclonla Technology Co., Ltd. | RM00013 | 苏木精-伊红染色与多重免疫荧光染色 |
| UN-Blocker | homgen Co., Ltd. | NGS文库构建 | |
| VAHTS DNA 纯化磁珠 | Vazyme Co., Ltd. | N411 | NGS文库构建 |
| VAHTS Universal DNA文库构建试剂盒（适用于Illumina） | Vazyme Co., Ltd. | ND610 | NGS文库构建 |
| 全片成像系统 | ZEISS 公司 | ZEISS AXIOSCAN 7 version3.3 | HE染色与多重免疫荧光染色分析 |
| xGen 杂交与洗涤试剂盒 | IDT Co., Ltd. | 1080577 | NGS文库构建 |
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