转录组测序鉴定出动脉粥样硬化斑块中的核心致病趋化因子

摘要

本研究旨在利用RNA测序分析与动脉粥样硬化斑块（AP）相关的炎症因子的潜在作用机制。研究结果鉴定出CCL3、CCL4和CXCL1为AP中的关键炎症枢纽基因。这些趋化因子可能通过促进M0型巨噬细胞积聚并抑制保护性免疫细胞，从而推动动脉粥样硬化的发展，揭示了潜在的治疗靶点。

摘要

动脉粥样硬化斑块（AP）是一类在动脉壁内皮细胞和平滑肌细胞受损后发生的炎性纤维组织增生性疾病，可导致不同程度的心脑血管血流阻塞。然而，迄今为止针对炎症的有效治疗策略大多未能成功，提示仍需进一步深入认识其机制。本研究旨在通过RNA测序（RNA-seq）分析AP中与炎症因子相关的转录组学变化。对AP患者样本（n = 11）和对照个体样本（n = 3）进行了RNA-seq分析。使用Metascape鉴定差异表达基因（DEGs），随后利用R软件中的clusterProfiler包进行KEGG通路富集分析，采用CIBERSORT进行免疫浸润分析，并通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。PPI网络中的核心基因（hub genes）由CytoHubba插件识别。在AP组中共鉴定出3713个差异表达基因，包括2097个上调基因和1616个下调基因。结果表明，差异表达基因主要富集于免疫和炎症相关通路。CCL3、CCL4和CXCL1这三个与炎症相关的因子被认为是AP病理过程中的主要核心基因。免疫浸润分析揭示了AP中独特的微环境特征，表现为M0型巨噬细胞显著增加，同时CD8⁺ T细胞、活化的NK细胞和静息态肥大细胞减少。综上所述，本研究的实验结果描述了CCL3、CCL4和CXCL1在AP中的差异表达及其与免疫细胞组成改变的关联，提示这三种趋化因子可能是后续机制研究的潜在候选靶点。

引言

心血管疾病（CVD）已在全球范围内严重威胁人类健康¹。随着全球人口老龄化趋势加剧，CVD 的发病率也在不断上升²。其中，动脉粥样硬化斑块（AP）是导致 CVD 的主要原因之一³。AP 是一种慢性炎症性疾病，其特征是脂质在动脉内膜中逐渐积聚并形成斑块⁴。AP 是心脑血管事件的共同病理基础，主要累及大中型动脉，导致缺血和组织损伤，是引发心脑血管疾病和死亡的重要因素⁵。由于早期缺乏明显症状，AP 通常在确诊时已处于较晚期阶段，因而致死率较高⁶。AP 的治疗主要针对其危险因素，包括可改变的因素，如体力活动不足、久坐行为、吸烟、心理健康问题⁷，以及因高脂饮食导致的肥胖和2型糖尿病，也包括不可改变的因素，如基因、年龄和性别⁸。近期研究表明，代谢综合征、高同型半胱氨酸血症、高尿酸血症以及胰岛素抵抗是动脉粥样硬化发生与发展的重要危险因素^9,10。

与动脉粥样硬化（AP）发病机制相关的理论主要包括脂质浸润学说、炎症学说、氧化应激反应学说、感染学说以及遗传与环境因素相互作用学说^11,12。其中，炎症和氧化应激被公认为AP的核心发病机制，参与了AP从发生、发展到恶化的全过程¹³。AP不稳定斑块的突然损伤、血小板活化及血栓形成是心肌梗死和出血性脑卒中的重要发病机制¹⁴。随着研究的不断深入，发现AP不仅含有脂质，还包含大量炎性细胞¹⁵。吸烟、高血压、脂质代谢紊乱、高胰岛素血症、高血糖、高尿酸等有害刺激可诱导白细胞和内皮细胞持续释放可溶性黏附分子及多种细胞因子，促进单核细胞黏附于血管内皮细胞。聚集的趋化因子进一步促使单核细胞迁移至内皮下间隙并分化为巨噬细胞，后者吞噬组织中富含胆固醇的氧化型低密度脂蛋白（LDL），从而转化为泡沫细胞，启动脂质条纹的形成¹⁶。动脉粥样硬化（AS）的早期病理损害即脂质条纹，主要由巨噬细胞和T淋巴细胞构成，是一种典型的炎性病变¹⁷。因此，多种炎性细胞及其产物均参与了AP的启动和进展过程¹⁸。然而，AP的炎症图谱十分复杂，涉及多种已知及潜在未知的因素。传统的候选基因方法可能无法全面捕捉这一完整的炎症驱动谱系。

为解决这一局限性，我们采用了RNA测序（RNA-seq），这是一种无偏倚的高通量转录组学方法。该方法特别适用于那些关键分子驱动因素尚未预先确定的假设生成型研究。与候选基因法或基于微阵列的方法相比，RNA-seq具有更宽的动态范围、更高的灵敏度，并且能够在无需预先设计探针的情况下检测到新的转录本^19,20。这些优势使其在急性胰腺炎（AP）中炎症相关特征的发现中尤为适用，因为AP的分子基础尚未被充分阐明。

本研究通过RNA测序分析与急性胰腺炎（AP）相关的炎症因子的潜在作用机制。采用基于不同算法的生物信息学工具筛选一系列差异表达基因（DEGs）。随后进行富集分析（WGCNA、KEGG通路分析、mcode分析、GSEA分析、枢纽基因分析）以及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析。本研究结果有助于更深入理解炎症驱动型AP的分子病理机制，并在寻找新型生物标志物方面发挥重要作用。

方案

本研究经聊城市人民医院伦理委员会批准（批准号：2023014），并遵循《赫尔辛基宣言》的原则。所有参与者均签署了知情同意书，所有患者或其家属均已签署知情同意书。

患者与样本

本研究回顾性分析了2023年1月至2023年12月期间在中国山东省聊城市人民医院神经血管外科接受颈动脉内膜剥脱术的11例重度颈动脉狭窄患者。这些患者被纳入AP组。颈动脉狭窄的诊断依据包括CTA或脑血管造影等影像学数据。AP组的纳入标准为：（1）年龄在50至80岁之间；（2）计算机断层血管成像/数字减影血管造影证实颅内颈内动脉狭窄程度≥70%；（3）发病前改良Rankin量表评分≤1分；（4）已获得患者或其法定代理人知情同意。排除标准为：（1）存在炎症或免疫性疾病；（2）患有精神疾病；（3）患有恶性肿瘤；（4）妊娠、哺乳或具有生育能力的女性。同期在同一家医院因严重创伤性脑损伤而捐献器官的患者中，选择年龄匹配者作为对照组（NA；正常对照组，n = 3）。两组受试者在年龄、性别和体重指数方面相匹配，以消除混杂因素的影响。对照组的纳入标准为：（1）年龄在50至80岁之间；（2）无冠状动脉疾病、颈动脉狭窄或其他系统性血管疾病病史；（3）已获得患者法定代理人的知情同意。在颈动脉内膜剥脱术过程中，从AP组采集颈动脉内膜及斑块样本；在器官捐献后，从对照组采集主动脉内膜样本。血管及斑块组织均保存于液氮罐中，用于后续检测。AP组患者的基线特征见表1。

样品制备

使用TRIzol试剂按照制造商说明书提取总RNA。采用Nanodrop ND-2000分光光度计在260 nm和280 nm处测定RNA浓度和纯度（A260/A280比值介于1.8至2.0之间）。通过2%琼脂糖凝胶电泳在100 V条件下电泳30分钟评估RNA完整性。使用Agilent 2100生物分析仪测定RNA完整性数值（RIN）（RIN ≥ 7.0的样品用于后续分析）。所有样品处理和RNA提取操作均在室温下进行，除非另有说明。废弃的TRIzol试剂根据机构危险化学品废物处理指南进行处置。

RNA测序

经DNase I处理总RNA后，使用Oligo D(T)磁珠富集mRNA，并在94 °C下将其片段化5分钟，得到短片段mRNA。以这些mRNA片段为模板，随机寡核苷酸为引物，利用M-MuLV逆转录酶系统在42 °C下反应50分钟合成第一链cDNA，随后通过RNase H降解RNA链。在DNA聚合酶I体系中加入dNTPs进行第二链cDNA的合成。对双链cDNA进行纯化、末端修复，并添加带有“A”突出端的尾部，以利于接头连接。使用AMPure XP磁珠筛选长度为250–300 bp的cDNA片段，随后通过PCR扩增。扩增产物经纯化后，获得最终文库。文库测序在Illumina HiSeq平台上进行，采用双端150 bp读长模式。为进行数据质量控制（QC），使用内部脚本过滤含有接头序列或低质量碱基的原始数据。由于测序仪器可能产生测序错误，需通过分析测序错误率分布来评估数据质量（错误率<1%视为可接受）。此外，还测定GC含量分布。除非另有说明，所有测序操作均在室温下进行。含有危险化学品的试剂（如DNase I缓冲液）根据机构生物安全指南进行处理。

质量控制阈值与故障排除

仅使用 RIN ≥ 7.0 的样本以及片段大小为 250–300 bp 的文库。每个样本至少需要 1400 万条原始测序读长，且 Q30 ≥ 98%。若文库产量较低，可通过增加 PCR 循环数至 18 次来解决，但优先选择 15 个循环，以使重复序列率保持在 15% 以下。

差异表达基因的筛选

我们评估了不同样本间基因表达水平的分布情况。通过基因表达水平的样本间相关性分析，验证实验的可靠性和样本选择的合理性。采用主成分分析（PCA）评估组间差异和组内重复性。差异表达基因（DEGs）通过 Metascape 在线数据库（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）进行鉴定。差异表达基因定义为 |log₂(倍数变化)| > 1 且 p.值 < 0.05 的基因，被认为具有统计学显著性。所有生物信息学分析均使用默认参数进行，除非另有说明。作为中间重复性检查点，生成 PCA 图以确认样本按组别聚类，而非按批次聚类。

京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

KEGG（http://www.genome.jp/）分析是一种系统性评估基因功能以发现生物调控通路的方法。本文首先从 org.Hs.eg（版本 3.12.0）获取差异基因的官方符号转换基因 ID，随后使用 R 软件（版本 4.2.0）中的 clusterProfiler 软件包进行 KEGG 通路分析。统计学显著性水平设定为 p. < 0.05。中间结果为生成一个按富集程度排序的通路列表，包含相应的基因数量和校正后的 p 值。

蛋白质相互作用网络分析

为构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并筛选关键基因，采用了 STRING 数据库（版本 11.0，https://string-db.org/）。仅保留复合评分超过 0.9 的相互作用，视为具有统计学意义。使用 Cytoscape（版本 3.10.1）对网络进行可视化和分析，该软件是一款用于探索分子相互作用网络的开源生物信息学工具。PPI 网络中的枢纽基因（hub genes）通过 CytoHubba 插件（版本 0.1）进行鉴定。

枢纽基因

通过 CytoHubba 插件筛选出前 20 个关键基因。红色表示基因表达水平较高。使用 Metascape 在线数据库（版本 3.5，http://metascape.org/gp/index）对上述 20 个核心基因进行生物信息学分析。基因富集分析涵盖以下本体类别：WGCNA、PCA、mcode、GSEA。全基因组所有基因为富集背景。筛选条件为：p. < 0.05、最小计数为 3 且富集因子 > 1.5 的条目。

统计分析方法

采用 SPSS 25.0 统计软件进行数据分析。计数资料以频数或百分比表示，组间比较采用卡方检验。符合正态分布的计量资料以均值 ± 标准差表示，组间比较采用 t 检验。p. < 0.05 被认为差异具有统计学意义。

结果

动脉粥样硬化斑块中差异基因的RNA测序数据分析

仅使用 RIN ≥ 7.0 的样本进行文库构建。全部 14 个样本（11 个动脉粥样硬化斑块组，3 个对照组）均通过该阈值。所有样本在同一批次中测序，因此无需进行批次效应校正。每个样本平均产生 1680 万条原始 reads；经过质量过滤后，保留了 1650 万条干净 reads（占 98%），其中 91% 唯一比对至人类参考基因组（hg38）。差异表达基因（DEGs）分析显示，与健康对照组相比，动脉粥样硬化斑块患者中有 2097 个基因上调和 1616 个基因下调（|log2FC| >1，P <0.05）（图 1A）。前 20 个显著上调和下调的差异表达基因的热图如 图 1B 所示。转录组 RNAseq 测序揭示了样本间的相关性（图 1C）。通过 WGCNA 分析共表达基因模块与表型之间的关联（图 1D）。PCA 分析显示 NA 组与 AP 组之间存在显著差异（P < 0.05）（图 1E）。

差异基因的KEGG富集分析

使用 R 软件（版本 4.2.0）中的 clusterProfiler 软件包，分别对疾病组中上调和下调的差异表达基因进行 KEGG 通路富集分析（图 2A、B）。结果显示，这些基因在与免疫和炎症相关的通路中显著富集，例如造血细胞谱系、类风湿关节炎、黏着斑、整合素信号通路以及趋化因子信号通路。

GSEA 分析

GSEA 分析显示，实验组的核心基因主要富集在顶部，呈上调趋势（图 3A）。对照组的核心基因主要富集在底部，呈下调趋势（图 3B）。综上所述，炎症相关基因在实验组（ASA）中上调，在对照组（NA）中下调。

PPI 网络分析

在使用 STRING 数据库（版本 11.0）分析的蛋白质相互作用网络中，具有相同聚类 ID 的节点倾向于彼此靠近。如图所示 图4A该聚类分析表明，相关基因主要参与细胞活化、炎症反应以及细胞活化的调控。 图4B 呈现了按 p 值着色的同一网络，其中包含更多基因的簇具有更高的显著性 p.-值。

枢纽基因鉴定与免疫细胞浸润分析

筛选差异表达基因进行Mcode分析，分析结果主要与乙酰胆碱受体相关（图5 和 表2）。利用Cytoscape中的CytoHubba插件进行枢纽基因分析，鉴定了前20个枢纽基因，其中大多数与免疫和炎症相关（图6A，左图）。前10个枢纽基因包括CXCR4、CCL4、CCL3、CCL20、CXCL1、CCL5、CXCL8、CD4、CCR2和CCR5（图6A，右图）。将枢纽基因与Olink炎症 panel 92个基因取交集，发现5个共同基因，分别为CXCL1、CCL20、TNF、CCL3和CCL4（图6B）。CIBERSORT分析显示，疾病组与健康对照组之间免疫细胞浸润存在显著差异。与对照组相比，疾病组中M0型巨噬细胞的比例显著升高（p < 0.05）（图6C）。相反，疾病组中CD8+ T细胞、活化的NK细胞以及大多数静息状态细胞的比例均显著降低（所有比较的p值 < 0.05）（图6C）。

枢纽基因的功能分析

我们进一步利用 Metascape 数据库分析了枢纽基因的生物学功能，结果显示这些基因主要与细胞因子介导的信号通路和钙离子介导的信号通路相关（图 7A 和 表 3）。随后使用细胞类型特征谱对枢纽基因的转录调控因子进行富集分析，结果表明枢纽基因主要与 gao 大肠 24W C11 潘氏样细胞、cui 发育心脏 C8 巨噬细胞以及 manno 中脑神经元 hmgl 相关（图 7B）。DisGeNET 数据库的疾病富集分析显示，枢纽基因与皮肤病变、EB病毒（Epstein-Barr virus）感染以及蜱传脑炎相关（图 7C）。PaGenBase 数据库的组织特征富集分析表明，枢纽基因主要在脾脏、血液和肺组织中富集（图 7D）。此外，TRRUST 数据库分析揭示 RELA 和 NFKB1 是调控枢纽基因的主要转录因子（图 7E）。

数据可用性：

处理后的计数矩阵作为补充文件提供（补充文件1和补充文件2）。所有其他数据均在文章中完整展示。原始测序数据可根据合理要求向通讯作者申请获取。

图1差异表达基因分析 (A健康斑块与动脉粥样硬化斑块差异基因火山图，上调2097个，下调1616个（|log2FC| > 1, P .< 0.05). (B差异表达基因中上调和下调最显著的前20个基因的热图。C样本相关性分析。D) 通过WGCNA分析共表达基因模块与表型之间的相关性。EPCA分析（NA组与AP组之间存在显著差异）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2KEGG 分析 KEGG通路富集分析分别对上调的（A) 和下调（B) 疾病组中差异表达的基因 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 3：GSEA 分析。（A）GSEA 分析显示，实验组的核心基因主要富集在排序顶部，呈现上调趋势。（B）对照组中，核心基因主要富集在排序底部，呈现下调趋势。综上所述，炎症相关基因在实验组（AP）中上调，在对照组（NA）中下调。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图。 (A) 按聚类ID着色，具有相同聚类ID的节点通常彼此靠近。 (B) 按P值着色，包含更多基因的项目具有更显著的P值。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：差异表达基因的mcode分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6枢纽基因分析 (A) 通过 Cytoscape 中的 CytoHubba 插件基于度值计算方法获得的前 20 个枢纽基因（左图）和前 10 个枢纽基因（右图），这些基因主要与免疫和炎症相关。B)枢纽基因与Olink炎症组92个基因的交集分析鉴定出5个交集基因。C) 采用CIBERSORT算法比较AP组与NA组之间22种免疫细胞亚群的浸润丰度。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 7：枢纽基因的生物信息学分析。（A） 利用 Metascape 数据库对枢纽基因进行功能注释。（B） 基于细胞类型特征（Cell Type Signatures）对与枢纽基因相关的转录调控因子进行富集分析。 （C）使用 DisGeNET 数据库对枢纽基因进行疾病富集分析。（D） 通过 PaGenBase 数据库鉴定枢纽基因的组织特异性表达模式。（E）利用 TRRUST 数据库分析枢纽基因的转录调控网络。请点击此处查看该图的放大版本。

MCODE	GO	描述	Log10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	高钙通透性烟碱型乙酰胆碱受体	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	突触前烟碱型乙酰胆碱受体	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	高钙通透性突触后烟碱型乙酰胆碱受体	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	双孔结构域钾离子通道	-10.3
MCODE_2	GO:0030322	膜电位稳定	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	4期——静息膜电位	-9.7

表1：急性胰腺炎患者的基本特征

MCODE	GO	描述	Log10(P)
MCODE_1	GO:0030322	高钙通透性烟碱型乙酰胆碱受体	-19.9
MCODE_1	R-HSA-5576886	突触前烟碱型乙酰胆碱受体	-19.6
MCODE_1	R-HSA-1296346	高钙通透性突触后烟碱型乙酰胆碱受体	-16.7

表2：DEGs的MCODE富集分析。

MCODE	GO	描述	Log10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	高钙通透性烟碱型乙酰胆碱受体	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	突触前烟碱型乙酰胆碱受体	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	高钙通透性突触后烟碱型乙酰胆碱受体	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	双孔结构域钾离子通道	-10.3
MCODE_2	GO:0030322	膜电位稳定	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	第4相——静息膜电位	-9.7

表3：枢纽基因的MCODE富集分析。

补充文件 1：对照组（n=3）基因表达。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：患者（n=10）核心表格基因。请点击此处下载该文件。

讨论

随着对动脉粥样硬化（AP）研究的不断深入，越来越多的细胞因子在AP中被持续发现，炎症已成为动脉粥样硬化（AS）发生与发展的重要因素^21,22。白蛋白的活化可能破坏内皮细胞与血管内膜基质之间的连接，促使内皮细胞从血管内膜剥离，从而诱导血管内膜损伤^23,24。炎症可诱导低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的氧化修饰，而修饰后的LDL-C反过来又促进动脉内膜内的炎症过程，进而加速AP的形成²⁵。不稳定的斑块最终可能在内外因素作用下破裂，导致急性冠状动脉综合征（ACS）²⁶。斑块破裂过程中，巨噬细胞、血管平滑肌细胞（VSMC）和淋巴细胞会分泌白细胞介素-1（IL-1）、IL-6、血管间黏附因子-1和细胞间黏附因子-1等炎症因子。同时，单核细胞和粒细胞表面的白细胞整合素受体（CD11b/CD18）表达增加^27,28。然而，炎症导致AP形成的分子机制仍有待进一步探索。

由炎症引起的AP发生与发展是一个涉及多因素作用、多基因改变和多阶段病变的复杂过程，尤其与多种基因的异常表达密切相关。本研究通过RNA-Seq和生物信息学分析发现，在健康对照组织与AP之间，差异表达基因（DEGs）的火山图显示有2097个基因上调，1616个基因下调。对差异表达基因进一步进行KEGG通路富集分析表明，这些基因主要富集于免疫和炎症相关通路。枢纽基因（hub gene）分析鉴定出前10位的枢纽基因为CXCR4、CCL4、CCL3、CCL20、CXCL1、CCL5、CXCL8、CD4、CCR2和CCR5。将枢纽基因与Olink炎症因子检测面板中的92个基因取交集，发现5个共有基因，分别为CXCL1、CCL20、TNF、CCL3和CCL4。这些结果提示，炎症相关因子CCL3、CCL4和CXCL1可能在AP的病理过程中发挥关键作用。免疫浸润分析揭示了一种独特的微环境特征：斑块中M0型巨噬细胞显著增加，而CD8⁺ T细胞、活化的自然杀伤（NK）细胞和静息态肥大细胞则减少。

M0 巨噬细胞代表一类未分化的细胞群体，能够高效摄取氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）并分化为泡沫细胞，这是早期动脉粥样硬化发生的关键特征事件²⁹。在疾病组中观察到M0巨噬细胞比例升高，提示这些前体细胞在斑块微环境中发生积聚。CCL4主要由活化的巨噬细胞和T细胞产生，可通过NFκB信号通路持续刺激巨噬细胞活化，促进黏附分子的表达，并诱导基质金属蛋白酶-2和-9的生成，从而推动M0巨噬细胞向促动脉粥样硬化表型转化，并直接损害斑块稳定性³⁰。CD8⁺ T细胞比例的降低可能反映了CCL3介导的对动脉粥样硬化保护性T细胞亚群的抑制作用。Komissarov等人证实，T细胞向人类动脉粥样硬化斑块的迁移主要通过CCR5-CCL3轴进行³¹。此外，Döring等人³²发现了一条非经典通路：CCL17通过CCR8信号诱导CCL3表达，进而抑制调节性T细胞的分化；在CD4⁺ T细胞中基因敲除CCL3可增加FoxP3⁺调节性T细胞（Treg）的数量并限制动脉粥样硬化发展，而给予CCL3则会加重疾病并抑制Treg的分化。这一变化可能削弱了具有动脉粥样硬化保护作用的CD8⁺调节性T细胞，同时促进致病性效应T细胞的扩增，最终导致本研究中观察到的CD8⁺ T细胞总体比例下降。活化自然杀伤（NK）细胞和静息肥大细胞比例的减少，更可能反映的是这些细胞激活状态的改变，而非其绝对数量的丢失。Bonaccorsi等人³³报道，症状性颈动脉斑块中NK细胞浸润增多且IFN-γ产生增加，直接将NK细胞活化与临床斑块不稳定性联系起来。对于肥大细胞，Wezel等人³⁴证明，活化肥大细胞释放的趋化因子（尤其是CXCL1）可通过CXCL1/CXCR2轴招募中性粒细胞，从而加剧正在进行的炎症反应，促进斑块进展和不稳定化。因此，活化NK细胞和静息肥大细胞比例的降低，很可能反映了这些细胞在炎症性斑块微环境中的激活、脱颗粒或功能耗竭，而非真正的数量减少。

本研究存在若干局限性。首先，本研究仅基于转录组测序，且受限于样本量较小。除样本量有限外，还需注意RNA-seq实验方案中存在的若干技术局限。批量RNA-seq会掩盖细胞异质性；需要单细胞方法来解析CCL3、CCL4和CXCL1的细胞类型特异性表达。计算性免疫去卷积分析（CIBERSORT）仅能提供估算结果，而非直接测量。RNA丰度并不总是与蛋白质水平相关；需要正交验证。未来的研究应通过采用单细胞转录组学、更大且独立的队列以及蛋白质水平的正交验证来弥补这些局限性。

综上所述，本研究结果强调了炎症因子在急性胰腺炎（AP）病理生理过程中的重要作用。此外，我们鉴定了核心基因CCL3、CCL4和CXCL1，这些基因可能共同构成一个协调的趋化因子网络，通过促进M0型巨噬细胞的聚集、抑制保护性T细胞亚群以及改变自然杀伤细胞和肥大细胞的活化状态，从而驱动动脉粥样硬化的发展。总体而言，这些发现突出了这三种趋化因子作为斑块免疫微环境的关键调控因子及潜在治疗靶点的重要性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
TRIzol	Invitrogen	15596026CN	RNA 提取
Nanodrop ND-2000 分光光度计	Thermo Fisher Scientific	ND2000	RNA 浓度检测
Agilent 2100 生物分析仪	Agilent	G2939BA	RNA 质量控制
Illumina HiSeq TM 2000	Illumina	HiSeq 2000	转录组测序
寡聚 d(T) 磁珠	New England Biolabs	S1550S	RNA 富集