用于空间分辨采集土壤中生长根系分泌羧酸盐的聚丙烯酰胺氢氧化锆水凝胶

摘要

本实验方案详细介绍了聚丙烯酰胺锆氢氧化物水凝胶（ZrOH 水凝胶）作为一种非破坏性、原位采样方法，用于从完整土壤中生长的植物根系在不同作物发育阶段根系分泌的羧酸盐。同时，本方案还阐述了后续利用离子色谱-质谱联用技术（IC-MS）对这些羧酸盐进行局部定位分析与定量的方法。

摘要

从未经扰动的土壤中生长的植物根系采集并可靠定量根系分泌物仍然具有挑战性。我们进一步开发了一种非破坏性方法，用于采集、二维成像及定量分析在根箱中生长的植物根系释放的七种羧酸盐（柠檬酸、顺乌头酸、富马酸、乳酸、苹果酸、草酸、琥珀酸）。本方法采用聚丙烯酰胺锆氢氧化物水凝胶（ZrOH 水凝胶），该水凝胶可吸附所有测试的羧酸盐，洗脱效率介于 95.3% ± 3.12% 至 111% ± 1.99% 之间。ZrOH 水凝胶对羧酸盐具有高结合容量，最高可达 1.82 µmol cm^-2，具体数值取决于溶液 pH 值和羧酸盐种类，该容量高于根际通常存在的浓度。此外，羧酸盐在 ZrOH 水凝胶上的结合状态稳定，可在 4 °C 下保存数周后再进行分析。在实际应用中，植物种植于装有土壤的根箱中，便于以最小干扰接触根系。为采集根系释放的羧酸盐，将 ZrOH 水凝胶小心贴附于目标区域，持续 24 小时。回收水凝胶后，将其切割用于成像，各凝胶小块经洗脱后进行后续羧酸盐分析（例如通过离子色谱-质谱联用技术）。研究结果表明，ZrOH 水凝胶能有效捕获并测定根际中羧酸盐的浓度。该方法的创新之处在于能够从完整土壤生长的植物根系中采集根系分泌物，并实现时间分辨采样，而传统方法（土培-水培混合法）通常具有破坏性，且仅允许单次采样。尤为重要的是，该方法可生成定量、高分辨率、毫米级的二维图像，有助于可视化羧酸盐沿根轴的分泌情况及其在根际中的空间分布。此外，该方法还支持在植物生长周期的不同发育阶段采集根系分泌物。

引言

植物根系向根际释放多种化合物，从而塑造其物理、化学和生物学特性¹。当植物暴露于非生物和生物胁迫条件下时，根系分泌作用尤为显著。事实上，根系分泌物可能直接或间接影响养分/金属的可利用性与迁移、微生物群落及其活性、土壤团聚体稳定性以及植物对病原体的防御能力^1,2,3。在众多重要的根系分泌物中，羧酸盐尤为关键，因其在养分溶解（包括磷（P）、铁（Fe）、铜（Cu）和锌（Zn））、重金属耐受性以及促进根际有益微生物生长方面发挥重要作用^2,3,4,5。

值得注意的是，根系分泌的羧酸盐包括柠檬酸盐、乳酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐和富马酸盐^6,7,8。例如，柠檬酸盐在磷的获取过程中发挥关键作用，能够活化与铁或铝（Al）的（氢）氧化物结合的磷^7,9。然而，准确采集和定量来自土壤中生长植物的根系分泌物仍是一个实验难题，主要原因是难以无损接触土壤中生长的完整根系系统，以及难以获取根系分泌物样品^10,11。此外，分泌的化合物会迅速被微生物降解（在数分钟至数小时内）¹²，并强烈吸附于土壤矿物表面^1,10。根系分泌研究中的另一个挑战是难以实现对分泌过程的动态监测，因为大多数采集方法会扰动根系或需要收获土壤中生长的植株，从而难以对同一根系进行重复观测^1,11。因此，准确采样、定量和监测根系分泌物需要一种能够捕捉空间变异并支持在植物生长过程中进行多次取样的技术¹¹。

在本研究中，我们介绍了一种非破坏性的方法， 原位 由Tiziani等人最初为柠檬酸盐开发的方法¹²，该方法现已进一步优化，并用于从生长在根际盒土壤中的完整植物根系中采样、精确定位和定量六种额外的羧酸盐（柠檬酸、延胡索酸、乳酸、苹果酸、草酸和琥珀酸）的分泌。该方法利用基于氢氧化锆的聚丙烯酰胺水凝胶（ZrOH 水凝胶）采集根系分泌物¹³ZrOH 水凝胶对阴离子（包括羧酸根）具有强结合能力，且可轻松洗脱^12,13,14ZrOH水凝胶（1）可通过将水凝胶直接置于土壤中生长的植物根系上，以最小干扰的方式实现根系分泌羧酸盐的取样；（2）对结合态羧酸盐具有至少6周的有效保护作用，防止其被微生物矿化；（3）羧酸盐在根际中的空间分布在其结合到凝胶上后得以保留；（4）可实现毫米尺度的羧酸盐二维分布图谱绘制¹².

现有的根系分泌物采样方法可分为基于土壤的采样技术（即从土壤栽培植物中采样，包括根系冲洗法、土壤-水培结合法、土壤-根系分泌物收集器（SOIL-REC）装置、微吸杯法、滤纸/琼脂片法、分泌物捕获陷阱以及RHIZOtest技术）和水培分泌物采样方法。根系冲洗法或土壤-水培结合法涉及将整株植物小心地从土壤中取出，清洗根系，然后将其浸入采样溶液中以收集根系分泌物¹⁵。由于操作简便，该方法是采集土壤栽培植物分泌物最常用的方法。然而，将根系从土壤中提取可能导致根毛和细根的丢失。此外，根系需要彻底清洗，这可能损伤根系，影响根系分泌物的质量和数量，并且无法实现时间分辨的连续采样^8,11。SOIL-REC方法 涉及在专门设计的根际箱系统中种植植物，使根系生长在两层多孔尼龙网（≤ 30 µm）之间，并使用根系分泌物收集工具采集分泌物^16,17。该方法可有效保护根系结构，最大限度减少土壤污染，并支持多次重复采集根系分泌物。然而，该方法装置复杂（仅能设置少量重复），由于采样体积较大导致分泌物被显著稀释，且仍需进一步优化，因其可重复性较差，不同重复之间的差异较大⁸。

将能够与周围溶液达到平衡或吸附根系渗出物的小块树脂、琼脂凝胶片或滤纸应用于易于观察的完整土培根系（如使用根盒或根窗）中目标根段的方法^18,19该方法能够实现对局部渗出物成分的时间分辨采样和部分测定，但空间分辨率较低。另一方面，该方法易受微生物矿化产生的假象影响，且操作繁琐。类似地，渗出物捕获装置可用于采集单个根段的根系渗出物，其中单根被固定于水平侧室中，局部放置含有采样溶液的密封有机玻璃环以收集渗出物⁸该方法适用于水培和土培的根系，可实现局部取样¹²然而，采集的体积较小，难以实现时间分辨采样，且分离单根容易受到机械应力的影响，这可能改变根系代谢和分泌物的释放⁸微吸杯用于采集根际土壤溶液，从而实现 原位 从土壤生长的根部取样²⁰然而，采集的体积较小，采样具有部分时间分辨性，且渗出物易发生吸附和微生物降解¹⁶RHIZOtest 技术涉及将根系在底部覆盖有 30 µm 尼龙网的小型圆柱容器中进行水培培养，随后将其转移至土壤圆盘中，使根系与土壤之间能够进行溶质交换^8,21,22将根系垫浸入采样溶液中收集渗出物。该方法可保持根系与土壤的接触，但采用人工生长条件，仅适用于短期实验，且无法实现时间分辨的采样。在上述方法中，仅有树脂、琼脂凝胶片、滤纸、渗出物捕获装置和微吸杯可用于测定渗出物的空间分布模式。

水培渗出物采样方法包括水培法和半水培法。水培法是一种常用且简单的根系渗出物收集方法，该方法将植物种植于营养液中，随后替换为采样溶液（H₂O、CaSO₄、CaCl₂、微纯水）以获取渗出物样品^15,23。该方法操作简便，对根系造成的机械胁迫极小；若需要，还可实现高度可重复性和无菌条件，从而提高根系渗出物的质量，并支持时间分辨采样^5,16。然而，该系统人为程度较高，可能改变植物的生理状态、形态特征（如根毛发育）以及根系分泌过程^6,15。在半水培法中，植物生长于玻璃珠、沙子或蛭石等基质上，并通过持续流动的营养液进行培养，渗出物则收集于流出液中^8,18。该方法相较于水培法人为干扰略低，且支持时间分辨采样。但该系统几乎完全处于水饱和状态，因此需要植物具备对部分厌氧条件的耐受能力。

与替代方法相比，ZrOH水凝胶法具有多项优势。ZrOH水凝胶可在土壤培养条件下（接近自然状态）采集根系分泌物，对根系干扰极小，能够在植物生命周期中实现时间分辨采样，并且由于微生物降解减少以及对羧酸盐的高结合能力，可实现超过24小时的持续采集¹²。此外，采样和保存水凝胶时无需使用杀菌剂（如Micropur、NaN₃），这类试剂长期使用可能对分析仪器造成影响并干扰化学分析。这是因为羧酸盐已与ZrOH水凝胶发生化学结合。同时，样品在分析前可在冰箱（4 °C）中保存数周至数月，因此可在同一实验装置中收集大量样品¹²，这可能归因于水凝胶中Zr的抗菌特性^24,25。此外，ZrOH水凝胶可实现根际中分泌化合物及其他阴离子的二维毫米级分辨率分布图绘制，并可对整个根系进行采样^12,14,26。与传统方法所需的大体积冷冻储存（通常在-20 °C冰箱中）相比，ZrOH水凝胶在冰箱（4 °C）中所占储存空间更小。该方法的主要局限在于需要熟练掌握高质量ZrOH水凝胶的制备技术，以尽量减少或避免气泡产生；此外，根盒系统本身仍属于人工生长环境。另一局限是该方法目前仅适用于七种羧酸盐（乌头酸、柠檬酸、富马酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸和草酸）¹²、磺胺类药物（磺胺二甲嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺氯哒嗪和克林霉素）²⁷以及无机阴离子（硫化物及磷、钒-V、砷-As、硒-Se、钼-Mo、锑-Sb的含氧阴离子）^14,26,28,29的检测。ZrOH水凝胶还曾与悬浮颗粒试剂—亚氨基二乙酸联用，用于原位采样和绘制根际阳离子（Al、Fe、Ca-钙、Mg-镁、Mn-锰、Ni-镍和Zn-锌）的空间分布图^28,29,30。

本文提供了一种基于ZrOH水凝胶的方法，可实现对土壤中生长的根系系统进行时间与空间分辨的原位羧酸盐取样。我们详细描述了如何开展根际盒实验，包括利用ZrOH水凝胶技术对根系分泌物进行取样和二维图谱绘制。该方法涵盖水凝胶制备、根际盒填充、植物培养、水凝胶施用、回收与切片、羧酸盐从水凝胶中的洗脱与分析，并最终生成二维图像。此外，文中还对关键步骤提供了说明，例如采用离子色谱-质谱联用技术（IC-MS）进行羧酸盐分析。

方案

1. ZrOH 水凝胶的制备

注意：凝胶制备需要洁净的环境和材料，以避免污染。在配制溶液、凝胶冲洗和水化过程中，仅使用一级实验室纯水（≤18 MΩ·cm），以确保质量。在开始制备水凝胶前，确保已在通风橱内放置好有毒废物容器（液体和固体）。在开始制备凝胶前约1小时，将烘箱预热至42─45 °C。材料与化学品的详细信息见材料表。

1. 玻璃组件准备
   1. 在通风橱中，将153.8 mL的65% HNO₃加入846.2 mL的实验室一级水中，配制10% (w/v) HNO₃酸浴。
   2. 将玻璃板（6.1 × 17 cm）、镊子、聚四氟乙烯U形垫片（0.25 mm或0.4 mm）和塑料夹子浸泡于酸浴中至少4小时。
   3. 从酸浴中取出玻璃板、镊子、塑料夹子和聚四氟乙烯垫片，用实验室一级水至少冲洗三次，然后在层流柜或洁净台中彻底风干。
      注意：玻璃板应在凝胶制备当天进行处理，避免使用纸巾擦拭以减少污染。
   4. 将“U”形垫片置于干燥的玻璃板上，盖上第二块玻璃板，并用夹子固定。将两块玻璃板错开约~1 mm，以便于移液操作（见图1A）。
   5. 在灌胶前，将玻璃板组件放置于薄膜罩下的洁净塑料膜上。
2. 聚丙烯酰胺凝胶制备³¹
   1. 凝胶溶液：在洁净的塑料离心管中，将15 mL薄膜扩散梯度（Diffusive Gradients in Thin Films, DGT）凝胶交联剂与47.5 mL实验室一级水混合，再加入37.5 mL丙烯酰胺溶液（40%），每加入一种溶液后充分搅拌。凝胶溶液可在冰箱（4 °C）中保存至少三个月。
      注意：确保准确移液或称量各溶液，并仅使用不含双丙烯酰胺（bis-acrylamide）的丙烯酰胺溶液，因为后者在2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液中会产生较软的凝胶。
   2. 通过将0.1 g过硫酸铵（APS）溶解于1 g H₂O中，配制10% (w/v) APS溶液。该溶液需每日新鲜配制，并确保完全溶解后使用。
   3. 在洁净的塑料离心管中，将4 mL凝胶溶液与28 µL 10% APS混合，再加入10 µL 99% N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED），每加入一种试剂后充分混匀。该混合液可用于制备最多3块凝胶，因混合后会迅速聚合。可根据所用玻璃板和垫片的尺寸调整混合液体积。
      注意：混合各种试剂时应避免产生气泡或泡沫。
   4. 如图1B、C²⁶所示，从玻璃板组件中间缓慢移取凝胶混合液注入。若存在气泡，可轻轻倾斜玻璃组件或用笔轻敲玻璃板以去除。
      注意：为获得无气泡凝胶，应避免使用划伤的玻璃板；使用后应将其存放在酸浴中，仅在下次使用前清洗，而非存放于聚乙烯袋中。使用带细小吸头的1 mL或5 mL移液器进行灌胶，并从中心缓慢加入凝胶混合液，同时将玻璃板倾斜约45°角，使凝胶均匀铺展。
   5. 将组件放入预热的烘箱中，在42─46 °C下保持至少1小时，确保凝胶完全固化（无液体滴落）。
   6. 使用洁净、无锈的刀片从角落轻轻撬开组件，用洗瓶中的实验室一级水将凝胶从玻璃板上冲洗下来（图1D–F）。为便于取出凝胶，可先用水浸泡数分钟，再将其冲洗至盛有1 L实验室一级水的烧杯中。
      注意：若凝胶粘附在玻璃板上，避免用镊子强行拉扯，以防凝胶变形。聚合完成后，任何可见气泡通常位于凝胶与玻璃板之间，而非凝胶内部，当玻璃板被移除后即变得清晰。
   7.  水化过程中，在24小时内至少更换3–4次水（建议在制备后每2小时更换一次），以洗去残留的聚合化学物质。通过反复更换水，未反应的试剂等杂质得以扩散去除，同时降低pH值，防止凝胶内部电荷积聚。
   8. 若凝胶片不立即用于ZrOH沉淀，可将其短期（约24小时）保存于实验室一级水中，或长期保存于0.01 mol L^-1 NaCl或NaNO₃溶液中（4 °C冰箱）。这些凝胶在NaCl中可保存长达一个月。
      注意：建议在聚合完成后立即进行沉淀，以尽量减少洗涤过程中可能引入的污染。
3. ZrOH凝胶沉淀¹⁴
   1. 在250 mL塑料烧杯中，将3.22 g八水合二氯氧化锆（ZrOCl₂·8H₂O）溶于40 mL实验室一级水中。
   2. 最多放入4片凝胶片，并加水至100 mL。或者，将1.66 g ZrOCl₂·8H₂O溶于20 mL实验室一级水中，放入2片凝胶并加水至50 mL。
   3. 将凝胶片浸泡至少2小时，以确保Zr在凝胶中均匀分布。
   4. 将每片凝胶转移至100 mL、pH 6.7的0.05 mol L^-1 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液中进行沉淀（pH用1 mol L^-1 NaOH调节）。在最初30–60秒内用镊子轻轻搅拌，以获得均匀沉淀。
   5. 在平板摇床中以≤100 rpm轻柔振荡40分钟，使Zr(OH)₄在凝胶中完全沉淀。
      注意：建议采用较慢的振荡速度，以避免凝胶相互粘连。
   6. 将凝胶置于1─2 L烧杯的实验室一级水中浸泡24小时以去除Cl^-离子，并每隔2小时至少换水3次³²。可通过测量洗涤液的电导率或进行氯离子检测来确认Cl^-是否被彻底去除。
   7. 将凝胶保存于0.03 mol L^-1 NaNO₃或NaCl溶液中，但在土壤实验中推荐使用NaCl，因为硝酸根会迅速促进土壤微生物活性，同时也是植物的主要营养元素^13,32。
   8. ZrOH水凝胶已在4 °C冰箱中保存长达60周，结果表明其特性稳定且性能良好（在目标值的±10%范围内）³²。
4. 凝胶切割
   1. 清洁无划痕的有机玻璃板、镊子和锋利且无锈的刀片。若无有机玻璃板，也可使用任何厚实坚固的玻璃板代替。
   2. 用实验室一级水润湿有机玻璃板，以利于ZrOH水凝胶片的铺展。
   3. 用镊子将ZrOH水凝胶片铺展在有机玻璃板上，确保其平整无气泡。识别凝胶片上的孔洞区域，切割时应避开这些区域。
   4. 使用锋利刀片精确切割ZrOH水凝胶片至所需尺寸。切割后将板上水分去除，有助于清晰观察切割区域。
      注意：为便于二维成像时识别方向，建议将ZrOH水凝胶切割为直角梯形，最长边位于左上角。
   5. 短期储存（仅在凝胶使用前）可将ZrOH水凝胶保存于实验室一级水中，长期储存（>24小时）则应保存于0.03 mol L^-1 NaNO₃/NaCl溶液中。

2. 根箱实验设置

注意：植物种植在装有土壤的根盒中，根盒的设计可能有所不同。我们建议使用在底部或背面带有孔洞的根盒，以便于浇水并确保水分均匀分布（参见补充图1）。所用材料和化学试剂的详细信息见材料表。

1. 根箱填充及持水能力测定²⁶​
   1. 使用2 mm筛子筛分风干的土壤，并将土壤混匀。建议使用中等质地的土壤，但也可使用沙质或黏质土壤，前提是采用特定的处理技术（如根盒类型、填充方式、开口方式和浇水方法）。
   2. 称量根箱（空箱）的所有组件，包括夹子和塑料薄膜，并记录重量（参见 补充图2C）。为测定持水能力（WHC），需额外准备2–3个根箱。
   3. 估算填充根盒所需的干土质量。通常，根盒填充至距顶部约2 cm处。推荐的容重约为1.0–1.4 g cm⁻³。^-3.
   4. 根据根盒的类型及其操作便利性，小心地将干燥土壤填入根盒中。在填充过程中及填充完成后，可使用平板将土壤表面刮平，但不得压实。也可使用略微湿润的土壤填充根盒，以保持土壤结构，特别是对于质地较细或重质黏土土壤（参见 Wagner 等人）。²⁶ 有关详细描述）。
   5. 或者，如果从顶部填充根盒，则将塑料膜固定在根盒上，盖上前板，然后夹紧（参见 补充图 2A–D).
   6. 为方便操作，在填充过程中安装核孔膜，并确保其平整地贴合于表面。采集根系分泌物时需要使用核孔膜。
   7. 记录装有土壤的根盒连同夹具的重量。计算干土的质量（m_干燥土壤通过从装有土壤的根箱重量中减去空根箱的重量，计算每个根箱的净重，并记录该重量。
   8. 持水能力的测定首先通过去离子水充分饱和根箱，然后让其排水约8小时。称量根箱并计算水的质量（m_w) 通过从当前重量中减去步骤 2.1.7 中记录的装有土壤的根盒重量来计算。然后确定 WHC（g g^-1) 通过除以 m_w 由 m_干燥土壤，结果是一个比值。
      注意: 用于WHC测定的根际盒不得用于实际成像分析，因为水分饱和可能导致厌氧环境，从而产生氧化还原假象。
   9. 大多数植物在生长期间的最佳含水量应保持在50%─60% WHC（即WHC因子， f_WHC = 0.5─0.6），具体数值取决于土壤类型和植物种类。估算需添加的水量（m_{w 加入}) 按照以下方式向每个根盒中加入： m_{w 加入} = WHC × f_{WHC x} m_干燥土壤.
   10. 种植前用水浇灌根箱 m_{w 添加}若通过孔洞浇水，则在表面添加5-10 mL水。
   11. 记录浇水后根盒的质量，该数据用于植物生长期间的浇水管理。
2. 植物栽培与管理^12,26​
   1. 在萌发或种植前对种子进行灭菌。常用方法是将种子置于70%乙醇中3分钟，然后置于1% NaClO中15分钟，以防止真菌生长。随后用去离子水冲洗种子约6─7次。
   2. 在滤纸或发芽卷中用清水或0.05 mmol L的水湿润后进行种子预萌发⁻¹ CaSO₄ 直到胚根伸出。
   3. 将一株幼苗移栽至每个根盒中，靠近前板放置，覆盖少量土壤，然后加入一些水。
   4. 用铝箔包裹根盒，以防止根际发生光化学还原反应，抑制藻类及其他光合微生物的生长，并避免根系暴露在光线下产生胁迫。 alternatively，也可使用不透光的黑色前面板代替铝箔。
   5. 将根盒置于架子上，使其在具有可控温度、相对湿度和光照强度的生长室或温室中倾斜放置。建议倾斜角度为25°─35°。
   6. 每周根据植物需求，至少称重法浇水2─3次。具体操作为称量根箱重量，然后加水以补偿与步骤1.2.11中记录重量之间的差值。然而，当植物生物量显著增加、水分需求上升时，应考虑生物量的影响，并相应调整浇水量。
   7. 具体的作物管理措施（如施肥）应根据实验设计、土壤特性、种植的植物种类以及植物生长过程中病虫害防控的实际需求来实施。
   8. 生长期和根系分泌物采样时间在很大程度上取决于根际盒的尺寸、植物种类以及研究目的。

3. 根系分泌物取样^12,26

注意：本文提供了根系分泌物非破坏性取样的详细步骤。确保在取样前准备好所有必需的材料，并在取样过程中包含实验空白对照。相关材料与化学试剂的详细信息见材料表。

1. 在采样前一日或至少提前2小时，缓慢将根箱（rhizobox）的含水量调节至90%─95% WHC（对氧气胁迫高度敏感的作物为80%）。可通过第2.1.9步中使用90%─95% WHC计算需添加的水量（m_{w add}），再重新计算根箱、湿土及植物重量估算值的总质量，然后使用天平逐滴加入去离子水，直至根箱达到重新计算后的总质量。
2. 揭开根箱上的铝箔，确定感兴趣区域，并在前面板上标示出该区域。仅当需要采集根段或幼苗时才需执行此步骤。
3. 根据感兴趣区域及根箱尺寸，将塑料膜和ZrOH水凝胶（参见第1.3步）裁剪至指定大小。若在填充过程中未安装核孔膜，则应将其裁剪至所需尺寸，略大于ZrOH水凝胶。
4. 将根箱放置于水平支架上，使可拆卸前面板朝上，小心打开根箱（见图2A）。缓慢取出塑料膜，同时确保根系和土壤不受扰动。
5. 在感兴趣区域放置标尺并拍摄高分辨率照片，用于后续数据处理。标尺可在图像处理过程中提供准确的尺寸参考，尤其适用于需采样多个根箱的情况。
6. 向目标根区添加少量水，直至表面形成一层薄水膜（见图2B）。较高的土壤含水量（建议为90%–95% WHC，对氧气胁迫高度敏感的作物为80%）有助于采样期间实现良好的土壤-凝胶接触。较高的含水量对于保证分子持续向水凝胶迁移是必要的。
7. 将预先裁剪好的核孔膜直接贴附于土壤表面或目标根区，并确保其平整地覆盖在土壤-根系界面上（见图2C）。
8. 将ZrOH水凝胶尽可能平整地直接放置于核孔膜上的目标区域，并与置于ZrOH水凝胶左侧的标尺一同拍照（见图2D）。标尺可用于确定ZrOH水凝胶的尺寸；若采样期间其性质发生变化，亦可用于界定采样区域，并在长期储存（>1年）时识别方向。
9. 在ZrOH水凝胶上方覆盖一层塑料膜，以保护其免受前面板挤压（见图2D）。
10. 轻柔关闭根箱，以减少ZrOH水凝胶的移动。也可按照Wagner等²⁶所述方法，使用乙烯基电工胶带将“凝胶三明治”（核孔膜 + ZrOH水凝胶 + 塑料膜）固定在干净的根箱前面板上，从而在关闭根箱时最大限度减少水凝胶的位移。
11. 再次用铝箔包裹根箱，并放回生长室或温室中培养24小时。只要水凝胶不干燥，且根据实验设计和研究目的，根系分泌物的收集时间可长可短。
12. 在孵育期结束后，轻柔打开根箱，小心移除胶带和膜，取出水凝胶。将水凝胶放入无菌密闭袋中，封口前滴加几滴水，随后冷藏（4 °C）保存至分析。空白凝胶应以相同方式保存作为对照。若用于二维分布图绘制，应连同塑料片一起揭下ZrOH水凝胶，并标记顶部方向。
13. 去除根系，测定根系形态参数、鲜重和干重，用于分泌物数据的归一化处理（若未进行时间分辨实验）。
14. 若进行时间分辨研究，则关闭根箱并将其放回气候室或温室中继续培养。

4. 羧酸盐的洗脱与测定¹²

注意：制备空白样品和标准品时，需使用新鲜的实验室一级水和高纯度分析标准品。作为质量保证，应使用经认证的质量控制标准品。为防止管路堵塞，分析前需通过0.2 µm或0.45 µm尼龙滤膜过滤样品，确保溶液（样品和标准品）无颗粒物。材料与化学品的详细信息见材料表。

1. 从冰箱中取出已加载和空白的 ZrOH 水凝胶，使用直尺测量其尺寸，然后根据间隔片厚度计算每个水凝胶的体积：0.25 mm 间隔片对应的厚度为 0.4 mm，0.4 mm 间隔片对应的厚度为 0.64 mm。对于二维成像，使用洁净的剃须刀片将 ZrOH 水凝胶切割至所需大小。需注意，由于切割更小样品及处理相应洗脱体积存在困难，最小尺寸下限约为 2 × 2 mm。
   注意：切割ZrOH水凝胶时，可在聚甲基丙烯酸甲酯板的一侧使用坐标纸（毫米坐标纸）代替直尺，以便将ZrOH水凝胶切割成接近完美的片状。使用游标卡尺确认ZrOH水凝胶的厚度。
2. 将ZrOH水凝胶或ZrOH水凝胶小块放入塑料小瓶中，加入0.5 mol L⁻¹的NaCl溶液进行洗脱，洗脱液用于后续分析；以逗号分隔的关键词/标签列表：ZrOH水凝胶, 塑料小瓶, NaCl溶液, 洗脱, 分析^-1 NaOH，按照每0.196 cm²使用1 mL洗脱液的比例³ ZrOH水凝胶置于摇床中，在150 rpm条件下振荡反应24小时。
3. 如果使用非常小的（例如 2 x 2 mm）ZrOH 羟基氧化物水凝胶时洗脱体积过低，则按重量加入实验室一级水，使总体积达到 45–60 µL，具体体积取决于后续用于羧酸盐定量分析方法所需的最小体积（例如，IC-MS 根据仪器型号不同，自动进样器至少需要 45 µL 样品）。需准确记录为达到 45–60 µL 所添加的水量，该数值将用于计算稀释因子及实际浓度。
4. 使用0.2 µm或0.45 µm尼龙滤膜过滤样品，并转移至样品瓶中。建议使用1.5 mL塑料离子色谱样品瓶，因其可冷冻且不易破裂。对于较小体积，也可使用330 µL样品瓶，但需注意确保无气泡残留。
5. 使用首选的分析方法（如离子色谱-质谱联用、高效液相色谱）对洗脱液中的羧酸盐进行定量。我们推荐采用与质谱检测联用的离子色谱法进行分离。此外，也可使用高效或超高效液相色谱（HPLC 或 UHPLC）结合多种检测器进行分析，包括先进的质谱检测器（如飞行时间质谱或轨道阱质谱）或光谱检测器。
6. 测量结束后，样品和标准品均可储存于冷冻冰箱中。建议将所有含羧酸盐的溶液在 -20 °C 下保存，最长保存时间为1年。若需保存超过1年，可重新配制新鲜标准品并进行测定，以作为质量控制检查。
7. 计算每种羧酸盐在洗脱液总体积（即 NaOH 体积 + 水凝胶体积 + 添加的水体积）中的总量，并根据根重或根表面积进行归一化，再乘以相应的洗脱效率校正因子：柠檬酸乌头酸盐为 0.94，柠檬酸盐为 1.00，延胡索酸盐为 0.90，乳酸盐为 1.02，苹果酸盐为 1.05，草酸盐为 0.91，琥珀酸盐为 1.00（参见 补充表1）。如果在洗脱和测定过程中进行了稀释，需确保已考虑相应的稀释倍数。

5. 二维映射

注意：目前没有专门用于创建渗出数据二维图像的软件。该映射可通过 Microsoft Excel 和 Python 实现。

1. 将步骤 4.7 中从每块凝胶获得的数据填入二维网格（行 × 列）中对应的单元格内。该网格基于采样期间拍摄的根系照片生成（见步骤 4.1）。
2. 定义网格的尺寸，并核对数据是否匹配。
3. 选择颜色标尺，并指定代表最低值和最高值的颜色编码。
4. 设定图例的数值范围，确保其与所选标尺准确对应。
5. 生成热图，并确保热图不包含标签或网格线。可使用 补充文件 1 中提供的示例 R 脚本在 R 软件中轻松创建热图。
6. 处理图像，并将其放置在采样期间获得的根系照片旁边，以便能够解读羧酸盐的空间分布。
   注意：目前也可使用人工智能工具进行绘图。操作流程十分简便：只需将 Excel 中的数值网格复制粘贴至对话界面，然后请求生成具有指定凝胶片尺寸和图例颜色标尺的热图。需注意，首次输出结果可能并非完全准确，但重复操作通常可获得精确结果。该方法的优势在于显著快于人工方法。

结果

ZrOH水凝胶法最初是为采集土壤中生长的植物根系释放的柠檬酸盐而开发的，并已成功用于解析根系分泌物的空间分布模式¹¹。在将该方法应用于其他羧酸盐之前，我们对ZrOH水凝胶进行了表征，以确认其同样适用于其他羧酸盐（见补充表1）。此外，我们还对2019年一次根箱实验中使用后负载并储存的ZrOH水凝胶进行了洗脱和分析。采用Tiziani等人¹²建立的相同洗脱条件（1 mL，0.5 mol L^-1 NaOH），ZrOH水凝胶在5小时内可完全回收所加载的顺乌头酸、柠檬酸、延胡索酸、乳酸、苹果酸、草酸和琥珀酸（约0.2 µmol，10 mL），回收率达100%。ZrOH水凝胶对羧酸盐的最大吸附量可达3.29 µmol cm^-2 ± 0.40 µmol cm^-2（见补充表1），远高于根际中通常检测到的浓度（通常在nmol范围内）。此外，负载羧酸盐的ZrOH水凝胶具有良好的稳定性，可在分析前储存数周，从而最大限度地减少采样过程中及采样后微生物降解的影响。

实验结果 图3 展示土壤中生长的簇根沿其空间分布的柠檬酸分泌二维可视化图像 白羽扇豆 在缺磷土壤中种植的羽扇豆（Lupinus，L）植株。该图谱包含48个独立测量点，数据来自2019年8月柠檬酸采样后，于2025年8月将ZrOH水凝胶切割成的5 × 2 mm凝胶片。显然，ZrOH水凝胶有效吸附了根系分泌的柠檬酸，即使在小型凝胶（0.10 cm²）上也能获得可量化的结果。²)，无需对洗脱液进行预先浓缩。最高柠檬酸根分泌速率出现在簇根区域（高达 2.8 nmol cm^-2 凝胶层析^-1），相当于 67.2 nmol/cm^-2 凝胶日^-1，而仅与土壤接触的凝胶块中检测到的速率最低。簇生根的长度范围为0.2 mm至15.6 mm，总长度为250 mm。这些结果证实了水凝胶适用于根系释放的羧酸盐在24 h内的采样。ZrOH水凝胶除柠檬酸外，还能够结合其他羧酸盐，如乳酸、延胡索酸、苹果酸和草酸表1). 在4 °C下保存6年的ZrOH水凝胶中仍检测到大部分羧酸盐，表明这些羧酸盐降解程度极低。然而，针对来自不同植物物种的七种羧酸盐，相关实验仍在进行中，以获取更为充分的信息。

图1： 聚丙烯酰胺凝胶制备的关键步骤。（A）玻璃板组件对齐，偏移约1 mm。（B）凝胶灌注，以及（C）从玻璃板中心均匀铺展凝胶溶液。（D）用剃须刀片从角落撬开玻璃板。（E）浸泡凝胶以帮助其从玻璃板上脱离。（F）将凝胶冲洗至烧杯中。请点击此处查看该图的放大版本。

图2: 利用ZrOH水凝胶采集根盒培养植物根系片段的根系分泌物. (A) 移去前面的板和塑料后，打开根盒。B) 使用洗瓶中的去离子水充分润湿土壤-根系界面。CNuclepore 微孔滤膜附着于湿润的土壤-根系界面。D) 在目标区域应用 ZrOH 水凝胶的根盒，用塑料薄膜覆盖以保护水凝胶免受前板影响。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图3： 利用ZrOH水凝胶采样根系分泌物及柠檬酸分泌的毫米级二维图像。（A）采样过程中，ZrOH水凝胶覆盖在目标根区的照片，用于生成映射所用的网格。 （B） 毫米级二维图像，显示在缺磷土壤中生长的白羽扇豆（Lupinus albus L.，简称羽扇豆）簇根的柠檬酸分泌速率（nmol cm^–2 gel h^–1）分布情况。每个网格代表一块5 × 2 mm的凝胶。请点击此处查看该图的放大版本。

植物	处理	乌头酸	柠檬酸	延胡索酸	乳酸	苹果酸	草酸	琥珀酸
	mg P kg-1 土壤	nmol cm-2 h-1
Lupin	50		0.02	0.21	0.15		0.06
Lupin	250		0.02	0.4	0.17	0.02	0.2
Lupin	250		0.05	0.31	0.09	0.01	0.19
Lupin	0		0.03	0.21	0.15	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.24	0.04	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.39	0.12		0.1
Rice (Nerica4)	50		0.01	0.24	0.35		0.09

表1：在施加0、50和250 mg P kg^-1 土壤条件下，土培 Lupinus albus L.（白羽扇豆）和 Oryza sativa L.（水稻）植株的柠檬酸、柠檬酸盐、延胡索酸、乳酸、苹果酸、草酸和琥珀酸分泌速率。LOQ 表示定量限

补充表 1：七种羧酸盐在 ZrOH 水凝胶上的 NaOH（1 mL，0.5 mol L^-1）洗脱参数（洗脱效率和校正因子）及吸附容量。数据为平均值 ± 均值标准差（n = 4，用于单个羧酸盐的洗脱效率和容量；n = 40，用于羧酸盐混合物）。请点击此处下载该文件。

补充图1：推荐的根箱示意图，便于浇水。该根箱由一个根箱框架组成，底部和背面设有等距分布的浇水孔，以便在浇水过程中实现均匀的水分分布；同时配备可拆卸的透明前板，便于在实验期间观察根系生长情况。请点击此处下载该文件。

补充图2：根箱的组装与填土过程。（A）用胶带封住根箱框架背面的孔洞。（B）将核孔膜贴在根箱框架的前面或开口侧，再覆盖塑料薄膜（确保其足够紧绷且平整）。（C）安装前面的盖板并夹紧根箱。（D）倾斜根箱使其向前倾斜，一边填充土壤一边使较细的颗粒落在可移动表面上，从而获得如图所示的平滑表面。（E）或者，从开口侧向已覆盖的根箱框架（A）中填土，用可移动板将其表面整平，然后依次覆盖核孔膜、塑料薄膜和前面盖板。（F）根箱的最终组装状态，已浇水并种植植物。另一种填充方法见Wagner等（2020）的研究。请点击此处下载该文件。

补充文件 1：该文件包含用于生成热图的 R 脚本的详细信息。请点击此处下载该文件。

讨论

本文所述的羧酸盐采样方法采用ZrOH水凝胶，其凝胶的正确制备与操作至关重要。操作ZrOH水凝胶时，建议使用数滴实验室级水保持其湿润。在制备过程中，配制凝胶混合液后（步骤1.1.3）应立即浇铸凝胶，并确保玻璃板之间无气泡产生。位于ZrOH水凝胶中心的气泡尤为关键，因其可能干扰采样；而边缘处的气泡则可在应用前通过修剪凝胶予以去除。此外，根系释放的羧酸盐会结合至水凝胶中沉淀的ZrOH上，因此沉淀过程中Zr的均匀分布至关重要。凝胶内Zr分布不均可能导致羧酸盐发生侧向扩散，从而扭曲其空间分布，影响二维定位结果的可靠性²⁶。为实现Zr的均匀分布，可将聚丙烯酰胺凝胶浸入ZrOCl₂·8H₂O溶液中超过2小时，并使用较宽的烧杯，同时减少凝胶数量¹²（步骤1.2.3）。此外，可根据Guan等人¹⁴（ZrOH水凝胶的开发者）的建议，采用扫描电子显微镜（SEM, S-3400N II, Hitachi, Japan）验证Zr的分布情况。然而，对于大量样品而言，SEM不宜作为常规检测手段。

另一个关键步骤涉及根际盒的填充、核孔膜的应用以及在施加凝胶前对土壤的浇水，以进行羧酸盐取样。在填充和操作砂质或重黏土土壤时需格外小心，以确保土壤表面均匀平整，这对于凝胶的良好接触至关重要，同时还要维持良好的排水条件。平整的表面对于核孔膜的正确贴附同样重要。必须确保核孔膜与土壤表面紧密贴合且气泡最少，从而建立根系与ZrOH水凝胶之间的良好接触。在施加ZrOH凝胶之前，还必须充分饱和土壤，以使ZrOH水凝胶能够牢固、平整地附着，并保持湿润状态，从而在取样期间维持其完整性。在切割凝胶用于二维羧酸盐成像时，实现毫米级精度的切口可能具有挑战性；因此，我们建议分辨率不要低于2 × 2 mm。此外，由于凝胶在干燥过程中会收缩，因此在取样后必须保持其湿润，以维持其结构完整性（步骤3.12）。本方法改编自Tiziani等人的研究¹²，其原建议使用NaN₃作为微生物抑制剂以防止羧酸盐降解。但在本实验方案中，我们未使用任何微生物抑制剂——这类试剂常用于根系分泌物取样（如NaN₃或Micropur，一种基于AgCl₃的材料）²³——因为它们会干扰分析方法，并可能对离子色谱-质谱（IC-MS）系统产生影响。

迄今为止，该方法仅针对七种羧酸盐（柠檬酸乌头酸、柠檬酸、延胡索酸、乳酸、苹果酸、草酸、琥珀酸）进行了验证，而根系分泌物组分则包含一系列复杂的化合物（如酚类物质、氨基酸、碳水化合物和羧酸盐）。目前该方法尚未涵盖这些其他重要化合物，也未对 ZrOH 水凝胶在采集这些物质方面的性能进行表征。土壤中其他含氧阴离子（如磷酸盐、硝酸盐）的存在可能会影响羧酸盐的吸附、容量和洗脱，以及在离子色谱（IC）或高效液相色谱（HPLC）上的定量分析。此外，从较大植物（如树木或灌木）采集完整的大型根系系统极具挑战性，原因在于制备非常大的 ZrOH 水凝胶（>30 cm）存在困难。然而，这一问题在当前所有根系分泌物采样技术中均存在⁸。另一个局限性在于使用根际盒（rhizoboxes）。尽管植物在根际盒中的生长比在水培系统中更接近自然状态⁸，但其仍属于人工环境，根系三维生长空间受限³³。此外，采样发生在二维表面上，理论上可能导致未与凝胶接触方向上分泌的羧酸盐丢失。然而，在应用过程中，由于扩散作用、ZrOH 水凝胶对羧酸盐较高的结合能力以及根际土壤的高含水量，这一局限性可能得以缓解。不过，仍需进一步验证以明确这些方面的影响。

ZrOH水凝胶法在采集根系释放的羧酸盐方面相较于常用方法（即土培-水培结合法和水培法）具有多项优势。这种新方法能够 原位 从未受干扰的土壤生长的根系中采样羧酸盐、时间分辨采样（Santner, Mühlbacher 等，未发表数据）以及毫米尺度的二维成像。此外，ZrOH水凝胶可在根系上使用至少24小时¹²此外，应能够对同一根段进行长时间序列的重复取样。该方法相较于类似方法（如滤纸法）已得到更为充分的开发和表征。⁸由于ZrOH水凝胶对羧酸盐具有高吸附容量，因此可实现长时间采样，例如最低吸附容量为0.44 µmol cm^-2 ± 0.04 µmol cm⁻² 苹果酸凝胶最高达到 1.66 µmol cm^-2 ± 0.10 µmol cm⁻² 在 pH 4.00 条件下，琥珀酸总量为 3.29 µmol cm^-2 ± 0.40 µmol cm⁻² 当羧酸盐混合时（参见 补充表1）。在土培-水培混合方法中省略根系清洗步骤（该步骤通常每株植物耗时20–30分钟）可显著减少对根系的损伤及相关偏差，从而获得更真实、更具代表性的数据。

值得注意的是，负载后的 ZrOH 水凝胶无需特殊储存条件，仅需冷藏，且在我们目前的应用中，洗脱后无需进行预浓缩。ZrOH 水凝胶还可结合其他阴离子，这些阴离子在相同条件下洗脱，并可通过离子色谱法（IC）进行分析^14,34。这使得羧酸盐的分泌可与根际养分的空间分布相关联²⁹。

总之，这种采样根系释放羧酸盐的新方法是根际研究的基础步骤。由于羧酸盐在植物养分（如磷、铁）^35,36的活化与吸收以及有益微生物的招募过程中发挥着关键作用，该方法可用于筛选具有特定根系性状的品种并应用于植物育种。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙醇	Sigma-Aldrich		70%
草酸	Sigma-Aldrich	194131-250G	98%
反式-乌头酸	Sigma-Aldrich	122750-25G	98%
二氯氧化锆八水合物（ZrOCl2 × 8H2O，98%）	Thermo Scientific	A12342.22	98%
柠檬酸	Sigma-Aldrich	C83155-500G	99%
硝酸钠	VWR Chemicals	批号：19H224150	100%
硝酸（HNO3）	Sigma-Aldrich	CAS号：7697-37-2	>65%，用于分析 EMSURE® Reag. Ph Eur, ISO
富马酸	Sigma-Aldrich	240745-100G	>99%
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S8045-500G	≥98%
过硫酸铵（APS_(NH4)2S2O8）	Thermo Scientific	201531000	≥98.0%，超纯，适用于电泳
琥珀酸	Sigma-Aldrich	S3674-100G	≥99%
2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液	Sigma-Aldrich	M8250-250G	≥99.5%
氯化钠	Sigma-Aldrich	71376-1KG	≥99.5%
交联剂	DGT Research Ltd（英国兰开夏）	na	2%，琼脂糖衍生物
板式或水平摇床			任意
离子色谱或IC-MS	Thermo Fischer Scientific	na	可使用任何高效或超高效液相色谱（HPLC或UHPLC）系统，结合多种检测器，包括先进的质谱（如飞行时间或Orbitrap）或分光光度检测器
pH计			可使用任何实验室pH电极
烘箱	Binder	na	可使用任何能维持特定温度的小型烘箱，优先选择较小尺寸的
尼龙滤膜_13 mm 0.45 µm	GVS Filter Technology	批号：7135431	也可使用更大的尼龙滤膜，但由于洗脱液体积较小，建议使用较小尺寸的
二水合硫酸钙	Sigma-Aldrich	C3771-1KG /CAS号：10101-41-4	也可使用CaSO4
丙烯酰胺溶液，40%	G-Biosciences	786-508	请勿使用与 Bis-丙烯酰胺混合的丙烯酰胺溶液。该化合物有毒，应在通风橱中小心操作
根际盒（Rhizoboxes）	https://www.rhizosphere.com/	na	我们的根际盒为定制产品，设计基于Rhizosphere.com
聚丙烯小瓶套装，1.5 mL	Thermo Scientific	79812	建议使用塑料IC小瓶，因其可冷冻而不破裂。也可使用330 µL小瓶，但需注意避免产生气泡
顺式-乌头酸	Thermo Scientific	A16010.06	工业级，85%
N,N,N’,N’- 四甲基乙二胺（TEMED）	Sigma-Aldrich	批号：BCBN1173V	有毒化合物，应小心操作
250 mL PP小瓶	Sarstedt	批号：2406082
铝箔	本地超市	na
烧杯_1 L / 2 L
夹具	本地仓库	na
玻璃板（6.1 × 17 × 0.4 cm）	本地仓库	na
L-(-)-苹果酸	Sigma-Aldrich	M6413-25G
IC用乳酸标准品	Sigma-Aldrich	07096-100ML
层流工作台
无水L-乳酸	Thermo Scientific	L13242.14
Nuclepore蚀刻径迹膜_0.2 µm	Cytiva	批号：A29983896
塑料薄膜/塑料袋	本地仓库	na
塑料镊子	Semadeni	602
有机玻璃板	本地仓库	na
PP 30 mL小瓶	Aptaca spa	批号：250552
PTFE垫片_0.25/0.4 mm	https://www.krishplasticindustries.com/teflon-sheet.html
剃须刀片	本地仓库	na
直尺	本地书店	na
次氯酸钠（NaClO）	CARLO ERBA Reagents	CAS号：7681-52-9
注射器_1 mL	HENKE SASS WOLF（HENKE-JET）	批号：22A17C8
乙烯基电工胶带	本地仓库	na