机器学习辅助的拉曼光谱分析用于5-羟色胺响应性ssDNA-SWCNT纳米传感器以提高对多巴胺的选择性

摘要

该方案描述了对ssDNA包裹的单壁碳纳米管纳米传感器进行拉曼光谱分析的方法，结合机器学习模型，可提高对血清素相对于多巴胺的选择性检测能力。

摘要

5-羟色胺（5-羟色胺，5-HT）在神经调节中发挥着关键作用，然而现有的检测方法难以实现对5-HT的高灵敏度和高选择性实时检测。我们此前开发了一种近红外5-羟色胺纳米传感器（nIRHT），该传感器由单链DNA包裹的单壁碳纳米管构成，可灵敏地检测5-HT。然而，nIRHT的荧光响应无法区分5-HT与多巴胺（DA），限制了其实际应用。在本研究中，拉曼光谱结合机器学习克服了这一选择性难题。G带光谱特征显示出5-HT与DA结合nIRHT时具有明显不同的信号，其中DA引起更强的G带抑制。我们采用差分拉曼（ΔRaman）方法分离出分析物特异性的光谱变化，并训练了三种机器学习模型用于分类。基于ΔRaman的随机森林模型表现最优，准确率达到95.8%，显著优于使用原始拉曼光谱的模型。该方法表现出更高的特异性，对乙酰胆碱、γ-氨基丁酸（GABA）和谷氨酸的响应可忽略不计，并实现了0.1 µM的检测限，适用于生理条件下的检测。这种基于拉曼的方法将原本无选择性的nIRHT荧光传感器转变为能够稳健区分神经递质的检测平台，解决了基于单壁碳纳米管（SWCNT）的分子传感中的选择性难题。

引言

5-羟色胺（5-羟基色胺，5-HT）是一种关键的神经递质，可调节情绪、认知、睡眠和食欲，其功能障碍与抑郁症、焦虑症及其他神经精神疾病相关¹。由于突触传递的时间尺度在毫秒级别，且神经组织具有复杂的化学环境，对生物系统中5-羟色胺动态变化的实时监测仍面临巨大挑战²。尽管神经递质检测技术已取得显著进展，但实现对5-羟色胺的高灵敏度和分子选择性检测仍存在重大的分析难题。

目前的5-羟色胺检测方法涵盖了从传统分析技术到新兴纳米传感器平台的多种手段。高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ED）仍是金标准，其检测限可达0.056 nM，并具有优异的重复性³。然而，HPLC需要复杂的样品前处理，且分析时间长达15–30分钟，无法实现实时监测⁴。快速扫描循环伏安法（FSCV）可在碳纤维微电极上实现亚秒级时间分辨率，但存在电极污染问题，且对结构相似的神经递质选择性有限^5,6。近年来发展的基因编码荧光传感器，如iSeroSnFR⁷和GRAB-5HT⁸，具有极高的灵敏度和动态范围，但需要对目标组织进行基因改造，因而限制了其在临床中的应用。

单壁碳纳米管（SWCNT）光学传感器已成为无标记神经递质检测的有前景平台⁹。DNA功能化的SWCNT在分析物结合时表现出近红外（nIR）荧光调制，可在组织透明窗口（900–1400 nm）内实现检测^10,11。Landry研究组通过指数富集配体系统进化（SELEC）方法开发了nIRHT传感器，筛选了约10¹⁰种独特的单链DNA序列，以鉴定响应5-羟色胺（serotonin）的构建体¹²。该传感器在5-羟色胺结合时可实现微摩尔级灵敏度，并产生200%的荧光增强，且不受多巴胺或5-羟色胺氧化的影响。为排除氧化干扰，我们先前的研究证实了这些神经递质溶液的稳定性；紫外-可见光谱（UV-Vis）和核磁共振（NMR）分析显示，与纯5HT相比，未出现氧化变化或新峰形成¹²。此外，系统所采用的短时间孵育和中性pH条件旨在防止显著的醌类物质生成。类似地，Strano研究组开创了冠相分子识别（CoPhMoRe）技术，证明(GT)₁₅包裹的SWCNT可在11 nM浓度下检测多巴胺¹³。我们研究组近期通过机器学习指导的优化策略进一步推动了该领域发展，利用高通量筛选系统性突变序列，实现了2.5倍的灵敏度提升¹⁴。

尽管取得了这些进展，5-羟色胺与多巴胺之间选择性不足这一根本性局限仍然存在。这两种神经递质均含有芳香环和乙胺链，仅在一个羟基上存在差异¹⁵。目前基于荧光的单壁碳纳米管（SWCNT）传感器通常实现的选择性比率低于5:1，不足以在突触环境中区分共同释放的神经递质¹⁶。鉴于5-羟色胺和多巴胺常共存于调控奖赏与动机的脑区，这一选择性难题尤为关键¹⁷。

拉曼光谱通过单壁碳纳米管-分析物复合物的振动模式分析，提供互补的化学信息¹⁸。单壁碳纳米管的G带（~1580 cm⁻¹）分裂为G⁺和G⁻两个组分，其频率对分子吸附和电子掺杂敏感¹⁹。先前的研究表明，单壁碳纳米管上的非共价表面活性剂会在G带区域引起明显的拉曼光谱变化²⁰。

在本研究中，我们展示了利用机器学习辅助的nIRHT传感器拉曼光谱分析，以实现5-羟色胺与多巴胺之间更高的选择性区分。我们系统地表征了0.01至100 µM浓度范围内的拉曼响应，揭示了每种神经递质独特的光谱指纹。我们使用光谱数据集训练了三种机器学习模型——卷积神经网络（CNN）、支持向量机（SVM）和随机森林（RF），用于分析物身份的分类。关键的是，我们引入了差分拉曼处理方法，该方法可去除基线信号，从而分离出分析物特异性特征。结合差分拉曼处理的优化RF模型实现了95.8%的分类准确率，显著提升了分子识别能力。这种将近红外荧光灵敏度与拉曼化学特异性相结合的多模态方法，为在复杂生物环境中实现实时、选择性监测5-羟色胺提供了可行路径。

方案

1. ssDNA功能化的SWCNT nIRHT纳米传感器的制备

1. 在1.5 mL离心管中加入1 mg单壁碳纳米管（SWCNTs）、100 µL 1 mM E6#9 ssDNA和900 µL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）。
   注意：干燥的SWCNT粉末具有潜在的吸入危害。请在经认证的化学通风橱内操作，并佩戴适当的个人防护装备，包括口罩和手套。
2. 使用水浴超声仪对混合物进行5分钟的分散处理，随后在冰浴中使用配备3 mm探头的探头式超声仪以50%振幅超声处理30分钟。
3. 将超声处理后的溶液在21,500 × g 条件下离心1小时，以沉淀未分散的SWCNTs。小心吸取850 µL上清液，并转移至新的离心管中。
4. 在632 nm波长下测定所收集的SWCNT悬浮液的吸光度。利用SWCNT的消光系数0.036 (mg/L)⁻¹ cm⁻¹ 计算其浓度。将最终的近红外传感器溶液储存于4 °C，待后续使用。

2. 拉曼光谱测量

1. 将90 µL的10 mg/L nIRHT分散液加入96孔板中。使用532 nm激光激发源，在PBS缓冲液中测量传感器的拉曼光谱。将记录的光谱设为基线。
   警告：在检测活体生物样品时，必须严格将激光功率控制在10 mW，波长保持在532 nm。较高的激光功率可能引起严重的光毒性，影响细胞活力。本方案中使用的10 mW、532 nm激光已被广泛证实对活细胞分析安全且无损伤，可在确保获得强拉曼信号的同时，保护敏感的细胞器²¹以及原代神经元的电生理活性²²。
2. 向每份90 µL的传感器溶液（10 mg/L）中加入10 µL待测物溶液，使终浓度分别为0.01、0.1、1、5、10、50和100 µM。加入待测物后等待5分钟，以确保充分孵育。
3. 测量孵育后样品的拉曼光谱。每个浓度制备三个重复样品，并重复步骤2.1至2.2，以确保实验结果的可重复性。

基于机器学习的数据分析

1. 从总共208个拉曼光谱构建数据集，其中包括77个多巴胺（DA）响应、76个血清素（5HT）响应和47个对照组（PBS）响应。
2. 对光谱数据的G带区域进行背景扣除。基于G+带峰对扣除背景后的数据进行归一化处理。
3. 应用中值滤波以降低归一化光谱中的噪声。通过从每个分析物处理后的光谱中减去归一化的对照光谱，提取光谱变化（ΔRaman）。
4. 构建卷积神经网络（CNN）、随机森林（RF）和支持向量机（SVM）模型，用于对5HT、DA或对照组进行三分类。
5. 按照6:2:2的比例将整个数据集划分为训练集、验证集和测试集。
6. 配置CNN架构，包含三个使用ReLU激活函数的一维卷积层和大小为2的最大池化层，随后连接两个全连接层。
7. 使用径向基函数（RBF）核配置SVM，以实现非线性分类。
8. 使用默认超参数配置RF模型。
9. 采用5折交叉验证训练所构建的模型。计算所有5折的平均性能指标，以确保统计稳健性。
10. 选择在验证数据上准确率最高的模型用于最终分析。
11. 在测试集上评估所选模型，以验证其泛化能力。
12. 通过逐步从训练集中排除浓度低于0.1 µM阈值的数据，确定间接检测限（LOD）。
13. 在包括低于该标准浓度在内的整个浓度范围内测试训练好的模型，以确定最终的LOD。

结果

先前通过SELEC方法开发的E6#9单链DNA功能化单壁碳纳米管纳米传感器（nIRHT），在结合5HT后表现出可逆的近红外荧光增强，能够实现体外和离体条件下5HT的实时成像体外和离体¹²。E6#9序列（5'-CCCCCCAGCACCAGACAGCACACTCCCCCC-3'）包裹在单壁碳纳米管（SWCNTs）周围，形成5HT的结合位点。然而，该传感器缺乏特异性：5-HT和DA均会引起相似程度的荧光强度增加（图1B），限制了其在DA与5-HT之间进行区分的能力。

为了克服这一局限性，我们采用拉曼光谱技术研究神经化学物质与近红外荧光纳米传感器（nIRHT）在分子水平上的相互作用。对nIRHT纳米传感器溶液的拉曼分析显示，在G带区域（~1580 cm^-1）具有明显的光谱特征，该信号源于单壁碳纳米管（SWCNTs）类石墨结构中的面内碳振动（图1C）。G带可进一步分为两...

讨论

拉曼光谱分析显著提高了nIRHT传感器的特异性，这是其常规荧光响应所无法实现的能力。我们观察到，多巴胺（DA）相较于5-羟色胺（5HT）对G⁻峰（1570 cm^-1）的抑制作用更为显著。这些差异性的光谱特征可能源于分子在单壁碳纳米管（SWCNT）表面的不同取向和结合几何构型。具体而言，DA的儿茶酚基团可能与SWCNT表面形成更强的π-π相互作用，引发更大的电子扰动，表现为G⁻峰抑制增强。相比之下，5HT的吲哚环体系似乎产生较弱的电子耦合作用，因而保留了更多的本征拉曼信号。这种差异性相互作用为区分这两种结构相似的神经递质提供了明确的光谱学依据。

为了评估我们的纳米传感器在连续监测中的实际可行性，我们使用固定在APTES修饰的玻璃基底上的纳米传感器进行了洗脱实验。在加入5-HT和DA后，拉曼光谱显示出明显的特征峰变化，并在随后的洗涤步骤后成功恢复至初始基线（补充图6）。这明确表明传感器响应具有可逆性。有趣的是，基底固定化体系中这些光谱位移的具体趋势与溶液状态下通常观察到的行为相反。尽管这种差异背后的机制尚需进一步研究，但已证实的可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HiPCo 原料	Nanointegris
iDus1.7 InGaAs	ANDOR	DU490A-1,9
Ramantouch	Nano Photon
Vibra Cell 130	SONICS